专利名称：一种量子点标记蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及纳米生物技术领域，具体涉及一种量子点标记蛋白的新方法。
背景技术：
量子点(QDs)是一种零维半导体纳米晶体，近似球形，直径f 12nm，可分散于水或者有机溶剂中形成胶。与传统的有机染料相比，QDs具有更优异的光谱性质，如激发光谱宽且连续分布，而发射光谱呈对称分布且宽度窄，颜色可调，并且光化学稳定性高，不易光解(Marcel BJ, Mario M, Peter G, et al. Science 1998，281，2013-2016)。这些优越的性能使QDs在体内细胞成像和生物特定标记等方面都得到了广泛应用，它正在并将日益成为分子细胞成像研究中非常重要的一种探针工具。目前，在生物标记中应用最广泛的是金属有机溶剂法合成的脂溶性CdSe/ZnS量子点。因此，必须将脂溶性的QDs转化成水溶性的QDs才能进行生物标记。而将脂溶性的QDs转化成水溶性的QDs最常用的方法是先用巯基小分子(如巯基乙酸、巯基丙酸、谷胱甘肽、巯基丁二酸等)取代脂溶性QDs表面的配体，然后通过偶联剂与生物分子偶联；另一种常用的QDs标记生物分子的方法是与含有组氨酸标签的多肽或蛋白结合。QDs表面的Zn原子和多组氨酸残基的金属亲和协调作用，含有组氨酸残基的蛋白质和多肽能够直接接到QDs表面的Zn原子，这种方法具有很好的稳定性，已逐渐成为生物标记中一种常用的方法。Sapsford等(Sapsford K. E. , Pons T. , Medintz I. L. , et al. J. Phys. Chem. <^2007,111，11528-11538)系统地研究了含组氨酸多肽与QDs之间的相互作用及结合常数等，6个组氨酸序列与QDs的结合速率是约100秒，KtT1约为I nM。因此，我们考虑在链球菌致热性外毒素A蛋白(SpeA)上表达一个Histag，再通过蛋白的二聚使蛋白二聚体上形成两个Histag,使更多的组氨酸与QDs结合，以此提高结合的稳定性，从而大大提高QDs在生物标记领域中的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有蛋白与QDs稳定性差的问题，限制其在生物领域中的普及使用，为解决上述技术问题，本发明提供一种量子点标记蛋白的新方法，利用SpeA蛋白容易发生二聚的性质，使得到的二聚体产生两个Histag，从而提高量子点与蛋白结合的稳定性。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种量子点标记蛋白的方法，是蛋白上表达一个组氨酸标签序列(Histag)，然后将带组氨酸标签的蛋白与量子点混合，得到量子点标记的复合物。所述的蛋白为容易发生二聚的蛋白，例如SpeA蛋白。所述的蛋白与量子点之间的摩尔比为4:1-16:1。由于蛋白容易发生二聚，因此有两个Histag同时与量子点结合，从而提高结合的稳定性。所述的蛋白为各易发生_■聚的SpeA蛋白。·
本发明所述的量子点为含有Zn的量子点，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。采用上述的技术方案后，本发明取得的有益效果是，本发明提供的一种量子点标记蛋白的新方法，操作方法简单，可重复性高，与量子点结合速度快，稳定性高，解决了现有量子点蛋白结合的稳定性不足而导致其在生物体内的不稳定，进一步拓展了量子点一蛋白作为纳米荧光探针在生物中的应用。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。图I是二聚的蛋白SpeA与量子点结合的结构示意图。图2是聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实SpeA蛋白发生了二聚。
图3是用毛细管电泳检测SpeA 二聚体与QDs结合的稳定性。电泳条件25 mM硼酸缓冲液(pH 9. 3)，电压为18 kV。SpeA:QD=8:l，[QD] =0. 5 μΜ。其中a是对照试验，没有加取代分子咪唑。b加入咪唑取代小分子(咪唑最终浓度为250 mM)。检测波长为612nm0
具体实施方式
实施例本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。实施例I
带有Histag的SpeA蛋白表达
SpeA基因购自Genscript公司，并通过大肠杆菌(E . coli)表达。该基因被克隆到pET28a载体的Nde I和EcoR I位点，得到高产表达质粒pJX2，它包含全长SPEA蛋白和N-末端的Histag。通过电穿孔将质粒pJX2导入大肠杆菌。在重组基因转化入E . coli菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE以检测表达蛋白质，SpeA在溶液中会形成二聚的结构(图2)。将SpeA与CdSe/Zns量子点按照摩尔比为8:1的比例混合后，震荡30分钟，SpeA二聚体通过组氨酸与量子点结合，得到SpeA-QD的复合物(图I)。为了检测SpeA与QDs结合的稳定性,将QDs与SpeA混合后，加入咪唑取代SpeA(咪唑终浓度为250 mM)。咪唑能与Zn离子螯合，因此可与Histag产生竞争，有可能把结合到QDs上的SpeA取代下来，因此通过加入高浓度的咪唑来判断SpeA与QDs结合的稳定性。实验结果表明，加入大量取代分子后，电泳谱图几乎没有发生变化，说明QDs与SpeA的结合非常稳定，很难被咪唑分子取代(图3)。实施例2
所用量子点为CdTe/ZnS，蛋白与量子点的摩尔比为4:1，其他步骤同实施例I。实施例3
所用量子点为CdSe/ZnSe，蛋白与量子点的摩尔比为16:1，其他步骤同实施例I。
通过上述三个实施例可以看出，本发明可以实现量子点与SpeA蛋白二聚体的快速结合，并且稳定性高，操作方便。以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完 全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
权利要求
1.一种量子点标记蛋白的方法，其特征在于，是在蛋白上表达一个组氨酸标签序列，然后将带组氨酸标签的蛋白与量子点混合，得到量子点标记的复合物。
2.根据权利要求I所述的一种量子点标记蛋白的方法，其特征在于所述的蛋白为容易发生二聚的蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种量子点标记蛋白的方法，其特征在于所述的蛋白是SpeA 蛋白。
4.根据权利要求I所述的一种量子点标记蛋白的方法，其特征在于所述的蛋白与量子点之间的摩尔比为4:1-16:1。
5.根据权利要求I所述的一种量子点标记蛋白的方法，其特征在于所述的量子点为含有Zn的量子点。
6.根据权利要求I所述的一种量子点标记蛋白的方法，其特征在于含有Zn的量子点是 CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe 或者 CdTe/ZnSe。
全文摘要
本发明公开了一种量子点标记蛋白的新方法，属于纳米生物技术领域。其特征在于首先在蛋白上表达一个组氨酸标签序列(Histag)，通过蛋白二聚，得到含有两个Histag的蛋白二聚体。将蛋白与量子点按照一定的比例混合，震荡，使两个Histag同时与量子点结合，从而提高结合的稳定性。该方法操作简单，可以作为纳米荧光探针广泛应用于生物标记。
文档编号C07K1/13GK102924564SQ201210431798
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者王建浩, 王车礼, 蒋鹏举, 邱琳, 夏江 申请人:常州大学