专利名称：重组人长效白介素1受体拮抗剂融合蛋白的纯化方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质纯化领域，更具体地，本发明提供了一种重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白的纯化方法。
背景技术：
作为一个主要的免疫调节因子，白介素-l(Interleukin-l，IL-1)在机体的免疫及能量代谢调节中起到重要的作用。研究发现，IL-I在自身免疫性疾病如类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)、多发性硬皮病(Systemic sclerosis)、II 型糖尿病(Type2diabetes)、肥胖症(Obesity)的发病过程中起到非常重要的作用，最近的研究表明，IL-I还与某些种类的心血管疾病的发生相关。白介素 I 受体拮抗剂(Interleukin-1 receptor antagonist, IL-1 Ra)是人体内 天然存在的一种蛋白质分子，其在体内可以与IL-I的受体特异性地结合，灭活相应的信号传导途径，从而对IL-I引起的机体损伤有保护作用。通过GenBank查询可以得到人白介素I受体拮抗剂的全基因序列，本专利中IL-IRa的基因序列对应GenBank号为M63099. I。美国食品和药品管理局(FDA)在2001年11月批准Amgen(安进)公司的重组人IL-IRa(Kineret ，Anakinra)上市，主要用于对常规药物无效的顽固性类风湿关节炎患者，目前该药也用于II型糖尿病的治疗，并取得了良好的效果。Anakinra为大肠杆菌表达的重组IL-IRa蛋白质，治疗期间需每天注射给药，频繁的用药加重了病人的身体、心理和经济负担，因此长效的IL-IRa的研究开发具有重要意义。将目的蛋白质与生物体内天然存在的蛋白质进行融合表达，是一种延长药物生物学半寿期的主要方式之一。目前常用的载体蛋白质有两种人血清白蛋白(Human serumalbumin，HSA)，通过GenBank查询可以得到人血清白蛋白的全基因序列，本专利中HSA基因序列对应GenBank号为NM_000477。通过酵母细胞分泌表达获得融合蛋白，如美国HGS公司研制的长效HSA-干扰素融合蛋白，目前已经进入临床使用。其在体内的平均半衰期为157个小时，只需每二周注射一次即可获得比较满意的临床治疗效果；另一种载体为免疫球蛋白的Fe片段，通常选择CHO细胞作为宿主细胞进行表达，如上海中信国健药业有限公司生产的益赛普注射液为人II型肿瘤坏死因子受体-抗体的融合蛋白，临床上用于中度及重度活动性类风湿性关节炎患者的治疗。目前，陈枢青等已经构建了四种由HSA与ILl-Ra通过不同方式融合的重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白的表达载体，分别为pPIC9-HSA-ILl-Ra质粒、pPIC9-HSA-(G)n-ILl-Ra 质粒、pPIC9-ILl-Ra-HSA 质粒和 pPIC9-ILl-Ra- (G)n-HSA 质粒(专利号ZL200810060568. 7)，本发明将该专利全文引用，这四种表达载体通过电击转化插入到毕赤酵母菌株GS115或SMD1168中，表达出的四种融合蛋白分别为HSA-IL_lRa (无连接肽，本文简称HI融合蛋白)、HSA-(G)n -IL-IRa (本文简称H(G)nI融合蛋白)、IL-IRa-HSA (无连接肽，本文简称IH融合蛋白)、IL-I-(G)n -HSA (本文简称I (G)nH融合蛋白)；所述(G)n的序列为[GlyGlyGlyGlySer]η，η为1-4的整数。沈其等对HSA-G-IL-IRa的摇瓶发酵液上清在实验室规模进行纯化，先经亲和层析，最后用Q Sepharose XL层析得到纯化产物(沈其，陈枢青.HSA / ILlra融合蛋白的纯化及生物学活性研究.浙江大学学报，2009，Vol 38, No3:260-264)。我们在对融合蛋白进行纯化研究时发现，四种融合蛋白自身含有一些水解酶的酶切位点，会被发酵过程中产生的一些水解酶所识别并切断从而产生一些降解蛋白，这种现象在大规模发酵中比摇瓶发酵更为明显，其中一些降解蛋白由于性质与融合蛋白极为接近，因此很难除去，给纯化工作带来了很大不便。同时，在酵母细胞的大规模发酵中，由于发酵条件不同，其发酵液上清中的杂质成分较摇瓶发酵液上清复杂得多，除了一些不同于摇瓶发酵的杂蛋白外，还会产生大量色素类物质，正是由于蛋白降解程度和杂质成分相差较大，所以实验室规模的摇瓶发酵纯化方法过于简单，不能完全够除去大规模发酵生产时产生的降解蛋白以及其他一些杂质。此外，在实验室规模摇瓶发酵实验中，发酵液上清除了目的蛋白和降解蛋白几乎没有其他杂质，因此第一步纯化采用亲和层析即可有效捕获目的蛋
白。而由于在大规模发酵生产中的杂质成分较复杂，其中一些杂质很容易损坏亲和层析填料从而降低其使用寿命。由于亲和层析填料成本较高，所以在大规模发酵生产中亲和层析并不适合用于第一步纯化。
发明内容
本发明提供了一种重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白(简称为融合蛋白)的纯化方法，在经过了大量改进和条件优化后，得到了较佳的工艺路线。本纯化方法能够有效除去在大规模发酵生产融合蛋白时产生的杂蛋白和降解蛋白，既可以节约成本，又可以得到高纯度的目的蛋白。本发明所提供的纯化方法包括(I)将能够表达重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白的基因工程菌株进行发酵表达，获得含有目的蛋白的发酵液，经预处理制得含目的蛋白的浓缩液，所述目的蛋白为HSA-IL-IRa, HSA- (G) n_IL_lRa、IL-IRa-HSA 或 IL-IRa- (G) n_HSA，其中(G) n 为肽接头，G的序列为GlyGlyGlyGlySer, η为1-4的整数；(2)将上步所得的浓缩液进行强阴离子交换层析，获得含目的蛋白的洗脱液，所用层析介质含有季铵基或季铵乙基配基且所用介质的基质为琼脂糖或葡聚糖；(3)将上步所得洗脱液进行蓝胶亲和层析，获得含目的蛋白的洗脱液，所用层析介质含有Cibacron Blue配基；(4)将上步所得洗脱液进行弱阴离子交换层析，获得含目的蛋白的洗脱液，其中弱阴离子交换层析所用介质含有二乙基氨基乙基配基，所述介质的基质为琼脂糖、葡聚糖或聚甲基丙烯酸甲酯；所用洗脱目的蛋白的缓冲液含有l(T50mM NaH2PO4 (表示在缓冲液中的终浓度，全文均沿用此表述方式)和2(T35mM NaCl，pH为5. 5飞.5。进一步，所述重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白为IL-IRa-G-HSA融合蛋白(本文简称IGH融合蛋白)，G的序列为GlyGlyGlyGlySer。进一步，步骤I发酵中，目的蛋白的表达形式为分泌表达，所用表达载体为pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPIC9 或 pPIC9K :当载体为 pPICZ a A、pPICZ a B 或pPICZ a C时，所用宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X33 ；当载体为pPIC9或pPIC9K时，所用宿主细胞为巴斯德毕赤酵母GSl 15或巴斯德毕赤酵母SMDl 168。其中重组酵母使用本领域常规方法构建，如利用我公司专利ZL 200810060568. 7(CN101255197B)中四种融合蛋白表达载体 pPIC9-HSA_ILl-Ra 质粒、pPIC9_HSA_(G)n-ILl-Ra 质粒、pPIC9-ILl-Ra-HSA 质粒和 pPIC9_ILl_Ra-(G)n-HSA 质粒得到四种融合蛋白基因片段，此基因片段也可以通过基因工程方法插入到其他表达载体当中；人血清白蛋白天然存在多态性，本发明融合蛋白中的人血清白蛋白部分也包括这些多态型；可根据Invitrogen公司毕赤酵母发酵手册上提供的BSM基础盐培养基和培养方法对融合蛋白进行100L发酵培养，从而得到含有目的蛋白的发酵液。进一步，步骤4所用的弱阴离子交换层析介质选自DEAE Sepharose CL_6B、DEAE Sepharose F. F.、DEAE Sephadex A-50、DEAE-650M、DEAE-650C 和 Macro-Prep DEAE,优选DEAE Sepharose CL-6B。因这些介质均含有二乙基氨基乙基(DEAE)配基，经过此步层析，最终可以有效将融合蛋白的降解蛋白等一些顽固杂质成分除去，得到高纯度的融合蛋白。进一步，步骤4中层析前预先将柱平衡，所用平衡缓冲液含有l(T50mM NaH2POjP20mM NaCl, pH 为 5. 5 6. 5，优选平衡缓冲液含有 20mM NaH2PO4 和 20mM NaCl, pH 为 5. 5 或
6.5 ;所用洗脱目的蛋白的缓冲液为含有20mM NaH2PO4和35mM NaCl, pH为5. 5的缓冲液，或为含有20mM NaH2PO4和20mM NaCUpH 6. 5的缓冲液。事实上，本文所有缓冲液中，两性盐NaH2PO4均可优选为20mM，当然，缓冲液中NaH2PO4处于l(T50mM范围内其他浓度条件的，最终亦可达到同样的纯化效果。进一步，步骤2所述的强阴离子交换层析介质为Q Sepharose Fast Flow、QAESephadex A_50或QAE-550C，这几种强阴离子交换层析填料为常用的粗提纯介质，有着高流速高载量的特点，都有着良好的粗纯效果，能够在有效捕获目的蛋白的同时除去大部分杂质，优选 Q Sepharose Fast Flow。进一步，步骤2中层析前预先将柱平衡，所用平衡缓冲液A1含有l(T50mM Tris和l(T50mM NaCl，pH 为 6. 5 7. 5，优选平衡缓冲液 A1 含有 20mM Tris 和 20mM NaCl，pH 为 7. O;所用洗脱缓冲液B1含有l(T50mM Tris和10(T200mM NaCl，pH为6. 5 7. 5，优选洗脱缓冲液B1含有20mM Tris和160mM NaCl，pH为7. O。上样前，可将样品电导调整到6mS/cm，pH调整到7.0。进一步，步骤3所述的亲和层析介质选自AF-Blue HC-650M、Blue Sepharose 6Fast Flow CL-6B、Capto Blue、Capto Blue (high sub)和 Affi-GeI Blue,优选 AF-BlueHC-650M。进一步，步骤3中层析前预先将柱平衡，所用平衡缓冲液A2含有l(T50mM的Tris和20 200mM NaCl，pH为6. 5 7. 5，优选平衡缓冲液A2含有20mM Tris和O. IM NaCl，pH为
7.O ;所用洗脱缓冲液B2含有10 50mM Tris和800 1300mM NaCl，pH为6. 5 7. 5，优选洗脱缓冲液B2含有20mM Tris和IOOOmM NaCl, pH为7. O。上样前，可将样品电导调整到6mS/cm, pH调整到7. O。进一步，由于蓝胶亲和层析所用洗脱液的电导较高，所以步骤4弱阴离子交换层析上样前，预先调低样品电导，以免上样过程中样品流穿无法挂柱。所述调整方法包括稀释、超滤置换或凝胶脱盐，优选G25凝胶脱盐。进一步，所述调整方法包括G25凝胶脱盐法，所用的脱盐介质选自S^hadex G25Fine, Sephadex G25 Medium, Sephadex G25 Coarse 或 Sephadex G25 superfine,优选Sephadex G25 Fine ;使用的脱盐缓冲液含有5 10mM的Tris，pH值为6· 5 7· 5，优选脱盐缓冲液含有8mM Tris，pH为7. O。上样前，可将样品pH调整到7. O。当紫外吸收峰出现时开始收取样品，当紫外峰降到基线、电导峰出现时停止收集样品。进一步，所述预处理包括离心、超滤澄清与超滤浓缩，可按下述步骤进行a)离心发酵液，收取上清；b )将发酵液上清用500K超滤膜进行澄清；c)将澄清液用30K超滤膜进行10倍浓缩， 制得含有融合蛋白的样品浓缩液。用本方法纯化的IGH融合蛋白经过SDS-PAGE和SEC-HPLC检测，纯度可达到98%以上，能够达到药效学研究的标准；通过另外三种融合方式形成的融合蛋白(即HI、H (G)nI,IH融合蛋白)，与I (G) nH性质接近，用本方法可制备其同样高纯的融合蛋白产品。本发明的优势在于I)在大规模发酵产物的第一步纯化使用了高流速高载量性质的强阴离子交换层析填料，耐用性较好且成本相对亲和层析填料较低，在有效捕获目的蛋白的同时可以去除大部分不同于摇瓶发酵的杂蛋白和色素类物质，因此降低了后续亲和填料的损耗，从而节约了成本。2)采用的Blue介质可特异性吸附含rHSA结构的物质，可以有效除去在融合蛋白的大规模发酵中产生的杂蛋白，特别是最后一步层析改用配基为二乙基氨基乙基的介质，该层析填料可以在有效吸附与目的蛋白性质接近的降解蛋白和其他一些顽固杂质的同时，于低电导条件下将目的蛋白选择性洗脱，从而得到较高纯度的目的蛋白，有效解决了在大规模发酵生产中无法得到足够纯度的目的蛋白的难题。
以下电泳图谱中所涉及的M均表示蛋白Marker 图I、IGH融合蛋白Q Sepharose Fast Flow层析柱纯化前后的SDS-PAGE电泳图谱。I :融合蛋白Q Sepharose Fast Flow层析柱纯化前即实施例I所得蛋白样品的电泳结果；2 :融合蛋白Q Sepharose Fast Flow层析柱纯化后即实施例2所得蛋白样品的电泳结
果O图2、实施例2 IGH融合蛋白Q Sepharose Fast Flow层析柱纯化后样品SEC-HPLC检测图谱，目的蛋白于9. 2分钟出峰，蛋白峰面积比例为45%。。图3、IGH融合蛋白AF-Blue HC-650M层析柱纯化前后的SDS-PAGE电泳图谱。I :融合蛋白AF-Blue HC-650M层析柱纯化前即实施例2所得蛋白样品的电泳结果；2 :融合蛋白AF-Blue HC-650M层析柱纯化后即实施例3所得蛋白样品的电泳结果。图4、实施例3 IGH融合蛋白AF-Blue HC-650M层析柱纯化后样品SEC-HPLC图谱，目的蛋白于9. 2分钟出峰，降解蛋白于9. 6分钟出峰，目的蛋白峰面积比例为65%。图5、IGH融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B层析柱纯化前后的SDS-PAGE电泳图谱。I :融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B层析柱纯化前即实施例4所得蛋白样品的电泳结果；2 :融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B层析柱纯化后即实施例5所得蛋白样品的电泳结果O
图6、实施例5 IGH融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B层析柱纯化后样品SEC-HPLC图谱，目的蛋白于9. 2分钟出峰，目的蛋白峰面积比例大于98%。图7、实施例6 IGH融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B层析柱纯化前后的SDS-PAGE电泳图谱。I :融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B层析柱纯化前即实施例4所得蛋白样品的电泳结果；2 :实施例6单用含20mM NaCl的缓冲液洗脱所得蛋白样品的电泳结果；3 :实施例6单用含35mM NaCl的缓冲液洗脱所得蛋白样品的电泳结果。图8、实施例6单用含35mM NaCl的缓冲液洗脱所得样品的SEC-HPLC图谱，目的蛋白于9. 2分钟出峰，目的蛋白峰面积比例大于88%。图9、实施例5 IGH融合蛋白最终纯化结果SDS-PAGE电泳图谱。M :蛋白Marker ；Γ6 :实施例5 IGH融合蛋白最终纯化所得6份样品的电泳结果。·图10、IGH融合蛋白纯化过程SDS-PAGE电泳硝酸银染色图谱。I :实施例2融合蛋白Q Sepharose Fast Flow层析柱纯化后电泳硝酸银染色结果；2 :实施例3融合蛋白AF-Blue HC-650M层析柱纯化后电泳银染结果；3 :实施例5融合蛋白DEAE SepharoseCL-6B层析柱纯化后电泳银染结果。
具体实施例方式实施例I重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白发酵液的预处理(以IGH融合蛋白为例)一实验材料500K和30K超滤膜包以及超滤夹具均购自密理博公司。二操作步骤I发酵采用的菌株为pPIC9_IGH/GS115,根据Invitrogen公司毕赤酵母发酵手册上提供的BSM基础盐培养基和培养方法对融合蛋白进行IOOL发酵培养，从而得到含有目的蛋白的发酵液。2将发酵液IOOOOrpm离心，弃菌体，收取上清液备用。3将发酵上清液用等体积的纯化水稀释后用500K超滤膜包进行澄清，入口压力<20psi,回流压力〈lOpsi,弃截留液,滤过液备用。4将500K超滤澄清液用30K超滤膜包进行浓缩，入口压力<20psi，回流压力〈lOpsi,弃滤过液,截留液备用。实施例2重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白Q Sepharose Fast Flow层析柱纯化(以IGH融合蛋白为例)一实验材料蛋白层析柱购自GE公司；Q Sepharose Fast Flow填料购自GE公司；AKTA蛋白纯化系统购自GE公司。二操作步骤I溶液配制平衡缓冲液A1 20mM Tris+20mM NaCl，pH 值为 7· O洗脱缓冲液B1 20mM Tris+160mM NaCl，pH 值为 7· O2 平衡
用缓冲液A1冲洗柱床2个柱体积以上，直到流入层析柱的缓冲液与流出层析柱的缓冲液电导值与PH相同，于此时紫外调零。3 上样将实施例I制得的、含有重组人长效白介素I受体拮抗剂蛋白样品的超滤浓缩液，电导调整到6mS/cm，pH调整到7. O后，进行上样。4 洗脱上样结束后，继续用缓冲液A1平衡I个柱体积，然后缓冲液B1液冲洗层析柱以洗脱目的蛋白，收集紫外吸收峰样品，直至出峰结束，基线回到上样前的水平。所得纯化样品SDS-PAGE检测结果参见图1，HPLC检测结果参见图2。实施例3重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白AF-Blue HC-650M层析柱纯化(以IGH融合蛋白为例)一实验材料蛋白层析柱购自GE公司；AF_Blue HC-650M填料购自TOSOH公司；AKTA蛋白纯化系统购自GE公司。二操作步骤I溶液配制平衡缓冲液A2 20mM Tris+0. IM NaCl，pH 值为 7· O洗脱缓冲液B2 20mM Tris+1M NaCl，pH 值为 7· O2 平衡用缓冲液A2冲洗柱床2个柱体积以上，直到流入层析柱的缓冲液与流出层析柱的缓冲液电导值与PH相同，于此时紫外调零。3 上样将实施例2制得的、经过第一步强阴离子交换层析洗脱的蛋白样品电导调整到6mS/cm, pH调整到7. O后，进行上样。4 洗脱上样结束后，继续用缓冲液A2平衡I个柱体积，然后缓冲液B2洗脱，收集紫外吸收峰样品，直至出峰结束，基线回到上样前的水平。纯化样品SDS-PAGE检测结果参见图3，HPLC检测结果参见图4。实施例4重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白S印hadex G25 Fine层析柱脱盐(以IGH融合蛋白为例)一实验材料蛋白层析柱购自GE公司；S^)hadex G25 Fine填料购自GE公司；AKTA蛋白纯化系统购自GE公司。二操作步骤I溶液配制脱盐缓冲液8mM Tris, pH值为7. O2 平衡用脱盐缓冲液冲洗柱床2个柱体积以上，直到流入层析柱的缓冲液与流出层析柱的缓冲液电导值与PH相同，于此时紫外调零。
3 上样将实施例3制得的、经过第二步亲和层析洗脱的蛋白样品pH调整到7.0，根据层析介质柱体积确定上样体积后进行上样。4样品收集收集出峰样品，直至紫外出峰结束，此时电导曲线开始上升，停止收集样品。当电导曲线下降到基线时，继续上样，反复数次，直至所有样品脱盐结束为止。实施例5重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B层析柱纯化(以IGH融合蛋白为例)一实验材料
蛋白层析柱购自GE公司；DEAE Sepharose CL-6B填料购自GE公司；AKTA蛋白纯化系统购自GE公司。二操作步骤I溶液配制平衡缓冲液A3 20mM NaH2P04+20mM NaCl，pH 值为 6· 5洗脱缓冲液与平衡缓冲液A3相同2 平衡用A3液冲洗柱床2个柱体积以上，直到流入层析柱的缓冲液与流出层析柱的缓冲液电导值与PH相同，于此时紫外调零。3 上样将实施例4制得的脱盐样品进行上样。4 洗脱上样结束后，继续用缓冲液A3平衡I个柱体积左右会有紫外吸收峰出现，收集出峰样品，直至紫外出峰结束，基线回到上样前的水平，此样品为最终目的蛋白。纯化样品SDS-PAGE检测结果参见图5，HPLC检测结果参见图6。实施例6重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B层析柱纯化(以IGH融合蛋白为例)一实验材料蛋白层析柱购自GE公司；DEAE Sepharose CL-6B填料购自GE公司；AKTA蛋白纯化系统购自GE公司。二操作步骤I溶液配制平衡缓冲液A4 20mM NaH2P04+20mM NaCl，pH 值为 5· 5洗脱缓冲液B4 20mM NaH2P04+35mM NaCl，pH 值为 5· 52 平衡用A4液冲洗柱床2个柱体积以上，直到流入层析柱的缓冲液与流出层析柱的缓冲液电导值与PH相同，于此时紫外调零。3 上样将实施例4制得的脱盐样品进行上样。4 洗脱
上样结束后，继续用缓冲液A4平衡I个柱体积左右会有紫外吸收峰出现，收集出峰样品，直至紫外出峰结束，基线回到上样前的水平，然后用缓冲液比洗脱，收集紫外吸收峰样品，直至出峰结束，基线回到上样前的水平。纯化样品SDS-PAGE检测结果参见图7，HPLC检测结果参见图8。实施例7重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白的纯度检测(以IGH融合蛋白为例)一实验材料TSKgel G2000SWXL液相层析柱购自TOSOH公司。二操作步骤I、蛋白电泳检测上述实施例所得纯化样品经过非还原电泳SDS-PAGE (分离胶浓度为15%)、考马斯亮兰染色，对实施例5所得的样品，除目的蛋白外，无明显杂蛋白出现，结果参见图9 JfIGH融合蛋白各步纯化样品经过非还原电泳SDS-PAGE (分离胶浓度为15%)硝酸银染色发现，最终纯化样品除目的蛋白外无明显杂蛋白出现，结果参见图10。2、HPLC 检测I)溶液配制流动相为50mM NaH2P04+0. 3%NaCl, pH6. 52)实验方法 上述实施例所得纯化样品液相检测方法为SEC-HPLC，样品进样量为50 μ 1，流速为O. 7ml/min,目的蛋白在9. 2min出峰。对实施例5所得样品，参见图6，结果判定目的蛋白峰面积大于98%,即纯度大于98%。
权利要求
1.一种重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白的纯化方法，该方法包括 (1)将能够表达重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白的基因工程菌株进行发酵表达，获得含有目的蛋白的发酵液，经预处理制得含目的蛋白的浓缩液，所述目的蛋白为HSA-IL-IRa, HSA- (G) n_IL_lRa、IL-IRa-HSA 或 IL-IRa- (G) n_HSA，其中(G) n 为肽接头，G的序列为GlyGlyGlyGlySer, η为1-4的整数； (2)将上步所得的浓缩液进行强阴离子交换层析，获得含目的蛋白的洗脱液，所用层析介质含有季铵基或季铵乙基配基且所用介质的基质为琼脂糖或葡聚糖； (3)将上步所得洗脱液进行蓝胶亲和层析，获得含目的蛋白的洗脱液，所用层析介质含有 Cibacron Blue 配基； (4)将上步所得洗脱液进行弱阴离子交换层析，获得含目的蛋白的洗脱液，其中弱阴离子交换层析所用介质含有二乙基氨基乙基配基，所述介质的基质为琼脂糖、葡聚糖或聚甲基丙烯酸甲酯；所用洗脱目的蛋白的缓冲液含有l(T50mM NaH2PO4和2(T35mM NaCl，pH为5.5 6. 5。
2.如权利要求I所述的纯化方法，其特征在于，所述重组人长效白介素I受体拮抗剂融合蛋白为IL-IRa-G-HSA融合蛋白，G的序列为GlyGlyGlyGlySer。
3.如权利要求I所述的纯化方法，其特征在于，步骤I发酵中，目的蛋白的表达形式 为分泌表达，所用表达载体为pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPIC9或pPIC9K :当载体为pPICZ a A、pPICZ a B或pPICZ a C时，所用宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X33 ；当载体为pPIC9或PPIC9K时，所用宿主细胞为巴斯德毕赤酵母GS115或巴斯德毕赤酵母SMD1168。
4.如权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤4所用的弱阴离子交换层析介质选自 DEAE Sepharose CL-6B、DEAE Sepharose F. F.、DEAE Sephadex A-50、DEAE-650M、DEAE-650C 和 Macro-Pr印 DEAE，优选 DEAE Sepharose CL-6B。
5.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤4中层析前预先将柱平衡，所用平衡缓冲液含有l(T50mM NaH2PO4和20mM NaCl，pH为5. 5 6. 5，优选平衡缓冲液含有20mMNaH2PO4和20mM NaCl，pH为5. 5或6. 5 ;所用洗脱目的蛋白的缓冲液为含有20mM NaH2PO4和35mM NaCUpH为5. 5的缓冲液，或为含有20mM NaH2PO4和20mM NaCUpH 6. 5的缓冲液。
6.如权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤2所述的强阴离子交换层析介质为 Q Sepharose Fast Flow、QAE Sephadex A-50 或 QAE-550C,优选 Q SepharoseFast Flow。
7.如权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，步骤2中层析前预先将柱平衡，所用平衡缓冲液A1含有10 50mM Tris和10 50mM NaCl，pH为6. 5 7. 5，优选平衡缓冲液A1含有20mM Tris和20mM恥(14!1为7.0;所用洗脱缓冲液81含有10 501111 Tris和100 200禮NaCl，pH 为 6. 5 7. 5，优选洗脱缓冲液 B1 含有 20mM Tris 和 160mM NaCl，pH 为 7. O。
8.如权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤3所述的亲和层析介质选自 AF-Blue HC_650M、Blue Sepharose 6 Fast Flow CL_6B、Capto Blue、Capto Blue(highsub)和 Affi-Gel Blue，优选 AF-Blue HC-650M。
9.如权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，步骤3中层析前预先将柱平衡，所用平衡缓冲液A2含有l(T50mM的Tris和2(T200mM NaCl，pH为6. 5 7. 5，优选平衡缓冲液^含有20mM Tris和O. IM NaCl，pH为7. O ;所用洗脱缓冲液民含有10 50禮Tris和80(Tl300mMNaCl，pH 为 6. 5 7· 5，优选洗脱缓冲液 B2 含有 20mM Tris 和 IOOOmM NaCl，pH 为 7. O。
10.如权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤4弱阴离子交换层析上样前，预先调低样品电导，所述调整方法包括稀释、超滤置换或凝胶脱盐，优选G25凝胶脱盐。
11.如权利要求10所述的纯化方法，其特征在于，所述调整方法包括G25凝胶脱盐法，所用的脱盐介质选自 Sephadex G25 Fine, Sephadex G25 Medium, Sephadex G25 Coarse或Sephadex G25 superfine,优选Sephadex G25 Fine ;使用的脱盐缓冲液含有5 IOmM的Tris, pH值为6. 5 7. 5，优选脱盐缓冲液含有8mM Tris，pH为7. O。
12.如权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述预处理包括离心、超滤澄清与超滤浓缩。
全文摘要
本发明提供了一种重组人长效白介素1受体拮抗剂融合蛋白的纯化方法，包括发酵表达获得含有目的蛋白的发酵液、预处理、强阴离子交换层析、蓝胶亲和层析、弱阴离子交换层析。本发明得到较高纯度的目的蛋白，有效解决了在大规模发酵生产中无法得到足够纯度的目的蛋白的难题。
文档编号C07K1/36GK102952836SQ20121043364
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者徐岩, 李征, 王海彬, 陈枢青, 沈其, 聂磊, 白骅 申请人:浙江海正药业股份有限公司