专利名称：一种高纯度达托霉素的制备方法
技术领域：
本发明涉及工业微生物技术领域，具体的说是一种高纯度达托霉素的制备方法。
背景技术：
达托霉素是脂肽类家族的一员，属于环十脂肽结构群，由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵而得,是目前全球首个成功开发的环脂肽类抗生素。达托霉素结构新颖，杀菌机制独特，能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，并杀死革兰氏阳性菌，特性表现为抑制作用迅速、体内与体外杀菌作用所需的浓度低，抗生素作用的有效性时间长。达托霉素的化学式为C72HltllN17O26，分子量为1620. 67，其结构式如下
O NH2
MCkf 八、ZΓ Y" I
f 丫_4<^ 0 H °
Η\^( ° O.I- (CH-I)8CH'
_CO2Hpj
HN>/=OΗ
HCteMN
HO2C^
达托霉素由美国礼来公司于20世纪80年代末发现，1997年Cubist公司获得了达托霉素的全球独家开发、生产及销售权。Cubist公司经过长达六年的体外试验证实达托霉素对多重耐药革兰氏阳性菌有快速有效的浓度依赖性杀菌作用。在临床上与万古霉素相比表现出抗菌谱广、药效快、给药量少、毒副反应轻等优点，是目前世界上公认的万古霉素等现用抗生素的最佳替代品。此外更重要的是，达托霉素在体外对已呈现甲氧西林、万古霉素和利奈唑烷等耐药性质的分离菌株如耐甲氧西林金葡菌、糖肽类敏感的金葡菌、耐青霉素类肺炎链球菌)等均有高效低毒的杀菌效果，并且用药次数少，治疗成本低。2003年FDA批准了达托霉素注射剂用于治疗由革兰氏阳性菌所致的复杂皮肤和软组织感染，以及金葡菌引起的菌血症和右侧心内膜炎，其安全性和耐受性好，是一种应用前途广阔的抗生素。目前，关于高纯度达托霉素制备方法的报道不多。美国卡比斯特制药公司申请的中国专利CN1404487公开了一种用阴离子树脂纯化达托霉素的方法，该方法交替使用阴离子树脂FP-DA13、大孔树脂HP-20SS、阴离子树脂PorosD50或Poros 150对达托霉素进行分离提纯，可以得到纯度98%的达托霉素产品，但该工艺繁琐，且成本高，难于实现工业化规模生产。中国专利CN101830970A和CN102276696A在CN1404487基础上进行了工艺改进，CN101830970A是采用缓冲溶液将达托霉素粗品配成样品溶液，然后上复合型YT-Ol反相硅胶材料柱吸附，再用强极性溶剂的水溶液作解吸剂进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱；CN102276696A是将半纯化的达托霉素加载结合到凝胶型弱阴离子树脂后进行洗脱。这两个专利技术虽然简化了流程、降低了成本，但仍难以实现工业化生产。达托霉素难以实现规模化生产，一是因为没有好的工业化生产菌种，二是因为没有合适的工业化后提取技术。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种操作简便、成本低廉，适于工业化规模生产的高纯度达托霉素的制备方法。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种高纯度达托霉素的制备方法，包括对达托霉素发酵液的滤液进行粗提的步骤、精提的步骤，所述粗提是将达托霉素发酵液的滤液导入大孔吸附树脂进行吸附，用解吸剂对大孔吸附树脂进行梯度解吸，然后对解吸液进行减压浓缩、结晶、干燥，得到达托霉素粗品，粗品的HPLC含量为90%左右；所述精提是将达托霉素粗品用极性溶剂溶解，然后将所得的溶解液注入聚合物纳米微球柱进行层析分离，再用洗脱剂对聚合物纳米微球柱进行梯度洗脱，并收集HPLC含量大于等于 98. 5%的洗脱液，再将此洗脱液减压浓缩、结晶、干燥，得到HPLC含量大于等于98. 5%的达托霉素O本发明的进一步改进在于所述达托霉素发酵液的滤液的制备是向达托霉素发酵液中加入助滤剂，经搅拌混合后对达托霉素发酵液进行过滤，而制得达托霉素发酵液的滤液。本发明的进一步改进在于上述助滤剂的用量为每100L达托霉素发酵液中加入O. 5kg 5kg助滤剂。优选为I kg 3 kg。本发明的进一步改进在于上述助滤剂为珍珠岩或硅藻土的其中一种或者其混合物。本发明的进一步改进在于所述大孔吸附树脂为LX-50、D113或D312树脂的其中一种。优选为D312树脂。本发明的进一步改进在于对大孔吸附树脂进行梯度解吸的解吸剂的体积百分浓度分别为30% 40%和70% 75%。本发明的进一步改进在于所述聚合物纳米微球为UNIPS30RPC。本发明的进一步改进在于所述对聚合物纳米微球进行梯度洗脱的洗脱剂的体积百分浓度分别为30% 40%和55% 60% ;所述极性溶剂为70%体积百分浓度的甲醇或者乙醇水溶液。本发明的进一步改进在于所述解吸剂或洗脱剂为乙醇水溶液或甲醇水溶液。本发明的进一步改进在于所述粗提和精提步骤中对解吸液或者洗脱液的浓缩是将解吸液或者洗脱液中达托霉素的浓度浓缩为100 120g/L ;所述结晶是向浓缩液中加入6 8倍量的丙酮或者异丙醇进行重结晶，结晶后所得的结晶粉在40°C 50°C条件下真空干燥24h。由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是本发明的方法是一种制备高纯度达托霉素的方法，其操作简便、成本低廉，适于工业化规模生产。本发明在固液分离过程中加入助滤剂，在提高过滤速度、缩短工艺周期的同时提高了滤液质量。本发明采用大孔吸附树脂对目的产物进行富集和纯化，去除了发酵次级代谢产物的干扰，提高了目的产物的质量。本发明采用新型层析介质一聚合物纳米微球，稳定提高了层析效果，一步层析分离便可得到纯度大于98. 5%的达托霉素产品。本发明工艺简单易行，样品收率稳定，收率高，过程总收率达到50%以上。所用溶剂均为常规溶剂，毒性小，适宜于工业化生产。
图I本发明实施例I所制备达托霉素精粉的液相色谱图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明做进一步详细说明 本发明所使用的达托霉素发酵液为华北制药集团股份公司研发中心用微生物培养手段得到的达托霉素发酵液。大孔树脂LX-50为西安蓝晓公司的产品；大孔树脂D113、D312为安徽三星树脂科技有限公司的产品；聚合物纳米微球UNIPS30RPC为苏州纳微科技公司生产；乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇等试剂均为市售。本发明进行HPLC检测所使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵(Waters公司)。实施例I
取发酵单位为1960μ g/mL的达托霉素发酵液100L，在上述发酵液中加入3000g珍珠岩作为助滤剂，搅拌Ih后板框过滤，得到达托霉素滤液。将达托霉素滤液以40L/h的流速导入大孔树脂D312柱(装量为20L)进行吸附富集，吸附完毕先用35%的乙醇水溶液洗涤，再用72%的乙醇水溶液解吸，解吸流速控制在10L/h，当HPLC检测解吸液中达托霉素浓度高于200 μ g/mL时开始收集，当浓度低于200 μ g/mL时，停止收集。减压浓缩收集的解吸液至达托霉素浓度为120g/L，得到达托霉素浓缩液。然后缓慢加入浓缩液体积7倍量的丙酮进行结晶，将结晶液过滤、45°C下干燥得到195g达托霉素粗品，此粗品的HPLC含量为89. 1%，粗提过程中收率为88. 6%。称取上述所得达托霉素粗品10g(HPLC含量为89. 1%)，用20mL 70%的乙醇水溶液溶解，注入聚合物纳米微球UNIPS30RPC柱(装量为1L)进行层析分离，然后依次用浓度分别为35%、55%的甲醇水溶液作为洗脱剂对UNIPS30RPC柱进行梯度洗脱，并分析洗脱液的HPLC含量。根据HPLC检测结果，收集HPLC纯度大于等于98. 5%的洗脱液，减压浓缩收集到的洗脱液至达托霉素浓度为120g/L，再缓慢加入浓缩液体积8倍量的丙醇进行结晶，将结晶液过滤，在真空度大于O. 08Mpa、40°C下干燥，得到HPLC纯度为98. 6%的达托霉素精粉6. Og,UNIPS30RPC柱层析收率为66. 4%。实施例2
用发酵单位为2060 μ g/mL的达托霉素发酵液10L，在发酵液中加入IOOg珍珠岩作为助滤剂，搅拌30分钟后真空抽滤，得到达托霉素滤液。将此达托霉素滤液以4L/h的流速导入装量为2000mL的大孔树脂LX-50柱进行吸附富集，吸附完毕先用体积浓度为30%的甲醇水溶液洗涤，再用体积浓度为70%的甲醇水溶液解吸，解吸流速控制在lL/h，当HPLC检测解吸液中达托霉素浓度高于200 μ g/mL时开始收集解吸液，当浓度低于200 μ g/mL时，停止收集。将上述解吸液在50°C下减压浓缩至达托霉素浓度为100g/L，然后缓慢加入浓缩液体积CN 102924572 A书明说4/5页8倍量的丙酮进行结晶，得到结晶液，将结晶液过滤、干燥得到20. Ig达托霉素粗品，此粗品的HPLC含量为89. 6%，粗提过程中收率为87. 4%。
称取上述所得达托霉素粗品I. Og (HPLC含量为89. 6%)，用2mL70%的甲醇水溶液溶解，注入聚合物纳米微球UNIPS30RPC柱(装量为IOOmL)进行层析分离，然后依次用40%、 60%的甲醇水溶液梯度洗脱。根据HPLC检测结果，收集HPLC含量大于等于98. 5%的洗脱液，减压浓缩收集到的洗脱液至达托霉素浓度为100g/L，再缓慢加入浓缩液体积6倍量的异丙醇进行结晶，结晶液过滤、干燥(温度45°C，真空度大于O. OSMpa)，得到达托霉素精粉O.6g, HPLC含量为98. 6%，层析收率为66. 0%。
实施例3取发酵单位为2300 μ g/mL的达托霉素发酵液10L，在发酵液中加入200g硅藻土作为助滤剂，搅拌30分钟后真空抽滤，得到达托霉素滤液。将滤液以4L/h的流速导入装量为2000mL的大孔树脂D113柱进行吸附富集，吸附完毕先用40%的乙醇水溶液洗涤，再用 75%的乙醇水溶液解吸，解吸流速控制在lL/h，当HPLC检测解吸液中达托霉素浓度高于 200 μ g/mL时开始收集，当浓度低于200 μ g/mL时，停止收集。解吸完毕，将收集的解吸液减压浓缩至达托霉素浓度为110g/L，然后缓慢加入浓缩液体积6倍量的异丙酮进行结晶，将结晶液过滤、40°C干燥得到达托霉素粗品22. 5g，达托霉 素粗品的HPLC含量为90. 2%，粗提收率为88. 2%ο
称取上述所得达托霉素粗品10g(HPLC含量为90. 2%)，用20mL 70%的甲醇水溶液溶解，注入聚合物纳米微球UNIPS30RPC柱(装量为1L)进行层析分离，然后依次用30%、58% 的甲醇水溶液梯度洗脱。根据HPLC检测结果，收集HPLC纯度大于等于98. 5%的洗脱液， 50°C减压浓缩洗脱液至达托霉素浓度为110g/L，再缓慢加入浓缩液体积7倍量的异丙醇进行结晶，将结晶液过滤，真空度大于O. 08Mpa，40°C下干燥，得到纯度为98. 7%的达托霉素精粉5. 9g，层析收率为64. 5%。
实施例4本实施例与实施例I的不同之处在于粗提过程中制备达托霉素发酵液的滤液时加入的助滤剂为珍珠岩或硅藻土的混合物， 其中珍珠岩Ikg ,娃藻土 3kg。
精提过程按照以下方法进行称取实施例I粗提所得达托霉素粗品IOg (HPLC含量为89. 1%)，用70%的甲醇水溶液溶解，注入装量为IOOOmL的聚合物纳米微球UNIPS30RPC 柱进行层析分离，然后依次用浓度分别为30%、60%的甲醇水溶液作为洗脱剂对UNIPS30RPC 柱进行梯度洗脱，并分析洗脱液的HPLC含量。根据HPLC检测结果，收集HPLC纯度为98. 5% 及以上的洗脱液，在50°C的温度下减压浓缩洗脱液至达托霉素浓度为110g/L，再缓慢加入浓缩液体积6倍量的异丙醇进行结晶，将结晶液过滤，在真空度大于0. 08Mpa、45°C下干燥， 得到HPLC纯度为98. 7%的达托霉素精粉5. 9g，UNIPS30RPC柱层析收率为65. 3%。
实施例5本实施例与实施例I的不同之处在于以下精提方法称取上述所得达托霉素粗品IOg (HPLC含量为89. 1%)，用70%的乙醇水溶液溶解，注入装量为IOOOmL的聚合物纳米微球UNIPS30RPC柱进行层析分离，然后依次用浓度分别为 30%、55%的乙醇水溶液作为洗脱剂对UNIPS30RPC柱进行梯度洗脱，并分析洗脱液的HPLC含6量。根据HPLC检测结果，收集HPLC纯度等于大于98. 5%的洗脱液，在50°C的温度下减压浓缩洗脱液至达托霉素浓度为120g/L，再缓慢加入浓缩液体积8倍量的异丙醇进行结晶，将结晶液过滤，在真空度大于O. 08Mpa、50°C下干燥，得到HPLC纯度为98. 6%的达托霉素精粉 6. 0g, UNIPS30RPC 柱层析收率为 66. 4%。
权利要求
1.一种高纯度达托霉素的制备方法，包括对达托霉素发酵液的滤液进行粗提的步骤、精提的过程，其特征在于所述粗提是将达托霉素发酵液的滤液导入大孔吸附树脂进行吸附，用解吸剂对大孔吸附树脂进行梯度解吸，然后对解吸液进行减压浓缩、结晶、干燥，得到达托霉素粗品；所述精提是将达托霉素粗品用极性溶剂溶解，然后将所得的溶解液注入聚合物纳米微球柱进行层析分离，再用洗脱剂对聚合物纳米微球柱进行梯度洗脱，并收集HPLC含量大于等于98. 5%的洗脱液，再将此洗脱液减压浓缩、结晶、干燥，得到HPLC含量大于等于98. 5%的达托霉素。
2.根据权利要求I所述的高纯度达托霉素的制备方法，其特征在于所述达托霉素发酵液的滤液的制备是向达托霉素发酵液中加入助滤剂，经搅拌混合后对达托霉素发酵液进行过滤，而制得达托霉素发酵液的滤液。
3.根据权利要求2所述的高纯度达托霉素的制备方法，其特征在于所述助滤剂的用量为每IOOL达托霉素发酵液中加入O. 5kg 5kg助滤剂。
4.根据权利要求2或3任一项所述的高纯度达托霉素的制备方法，其特征在于所述助滤剂为珍珠岩或硅藻土的其中一种或者其混合物。
5.根据权利要求I所述的高纯度达托霉素的制备方法，其特征在于所述大孔吸附树脂为LX-50、Dl 13或D312树脂的其中一种。
6.根据权利要求5所述的高纯度达托霉素的制备方法，其特征在于所述对大孔吸附树脂进行梯度解吸的解吸剂的体积百分浓度分别为30% 40%和70% 75%。
7.根据权利要求I所述的高纯度达托霉素的制备方法，其特征在于所述聚合物纳米微球为 UNIPS30RPC。
8.根据权利要求7所述的高纯度达托霉素的制备方法，其特征在于所述对聚合物纳米微球进行梯度洗脱的洗脱剂的体积百分浓度分别为30% 40%和55% 60% ;所述极性溶剂为70%体积百分浓度的甲醇或者乙醇水溶液。
9.根据权利要求5 8任一项所述的高纯度达托霉素的制备方法，其特征在于所述解吸剂或洗脱剂为乙醇水溶液或甲醇水溶液。
10.根据权利要求I所述的高纯度达托霉素的制备方法，其特征在于所述粗提和精提步骤中对解吸液或者洗脱液的浓缩是将解吸液或者洗脱液中达托霉素的浓度浓缩为100 120g/L ;所述结晶是向浓缩液中加入6 8倍量的丙酮或者异丙醇进行重结晶，结晶后所得的结晶粉在40°C 50°C条件下真空干燥24h。
全文摘要
本发明公开了一种高纯度达托霉素的制备方法，包括对达托霉素发酵液的滤液进行粗提的步骤、精提的步骤，粗提是将达托霉素滤液导入大孔吸附树脂进行吸附，吸附饱和后的树脂用解吸剂梯度解吸，然后对解吸液进行减压浓缩、结晶、干燥，得到达托霉素粗品；精提是将达托霉素粗品用极性溶剂溶解，然后将所得的溶解液注入聚合物纳米微球柱进行层析分离，再用洗脱剂对聚合物纳米微球柱进行梯度洗脱，并收集HPLC含量大于等于98.5%的洗脱液，再将此洗脱液减压浓缩、结晶、干燥，得到HPLC含量大于等于98.5%的达托霉素。本发明的优点是可以制备纯度大于98.5%的达托霉素产品，该方法操作简便，收率稳定、成本低，适宜工业化规模生产高纯度的达托霉素产品。
文档编号C07K1/14GK102924572SQ20121044765
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者段宝玲, 张雪霞, 任风芝, 李晓露, 朱秀良, 李宁, 陈书红, 成晓迅, 林毅, 王海燕, 李丽红, 张艳立, 董爱华 申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司