专利名称：一种目的蛋白制备方法及其用途的制作方法
一种目的蛋白制备方法及其用途
技术领域：
本发明涉及基因工程技术，特别涉及一种目的蛋白制备方法及其用途。
背景技术：
神经生长因子(NGF)是1951年是由诺贝尔生理学和医学奖获得者R. Levi-Montalcini和S. Cohen在小鼠肉瘤细胞内发现的[1，2]。NGF在神经元的发育、生长、分化以及轴突的生长、递质的合成及细胞的凋亡等阶段均起着重要作用。它促进发育中 的交感、感觉神经元的分化和成熟。维持成年交感神经元的正常功能。经典的NGF是从小鼠颌下腺中分离所得的分子量为140000的糖蛋白，由a、P、Y三种肽链按a 20 Y2的比例构成，在NGF三种亚基中，^亚单位是NGF的活性区，因而习惯上所谓的NGF就是指其3亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成二聚体，与人体NGF的结构具有高度的同源性，生物效应也无明显的种间特异性[3，4]。天然NGF蛋白主要是从成年雄性小鼠颌下腺分离和纯化而得的，方法包括，利用Varon等(1967，1972)的方法通过辅助修饰分离出7s NGF复合物；利用Smith等(1968)的方法分离出7s NGF中的P-NGF亚单位，即用0. 05M,pH 10. 3硼酸钠缓冲液(sodium boratebuffer)(含有 1.5M NaCl)从 CM 纤维柱(CM-cellulose column)上洗脱得到 P-NGF ;利用Bocchini和Angeletti (1969)的方法可制备2. 5s NGF ;利用Smith等(1968)的方法亦可获得7s NGF的a和Y亚单位，较为经典的是Mobley等(1976)的方法。用基因工程方法表达和纯化人神经生长因子，近年来一直备受关注，有报道用昆虫、酵母细胞和大肠杆菌等表达系统表达NGF [5-8]。目前，存在的主要问题是如何提高表达量、易于纯化和保持良好的生物学活性。目前需要一种解决以上问题的蛋白制备方法。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种提高表达量、易于纯化和保持良好的生物学活性的蛋白制备方法。为实现上述目的，本发明提供以下技术方案，包括以下步骤目的蛋白核苷酸序列片段的获得；目的蛋白重组表达载体的构建；目的蛋白的诱导表达；目的蛋白的纯化；纯化产物的切割；所述目的蛋白的核苷酸序列片段的前面插入单体切割的识别位点；所述目的蛋白通过PCR扩增得到，通过引物引入单体切割的识别位点；优选的，目的蛋白是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽。在纯化之前还包括鉴定蛋白表达的步骤。
所述目的蛋白重组表达载体构建中的目的蛋白基因是一个或一个以上拷贝；所述目的蛋白基因的一个以上拷贝数通过将含有一个以上拷贝目的蛋白基因的表达盒与表达载体构建来实现。所述的单体切割的识别位点是根据密码子规则编码的氨基酸序列，优选地，切割位点序列编码为单个氨基酸或两个氨基酸或三个氨基酸或六个氨基酸；更优选地，所述单个氨基酸为R或W或M或D或E或K ;两个氨基酸为D-P或N-G ;三个氨基酸为R-K-R或R-R-R ;六个氨基酸为L-V-P-R-G-S。所述的英文大写字母为氨基酸的代码，比如R表示精氨酸，W表示色氨酸,M表示甲硫氨酸,D表示天冬氨酸,E表示谷氨酸,P表示脯氨酸,N表示天冬酰氨，G表示苷氨酸，K表示赖氨酸，L表示亮氨酸，V表示缬氨酸，S表示丝氨酸。遵守20种氨基酸的密码子表。所述的单体切割的识别位点可通过定点突变目的基因来实现；优选地将人神经生长因子的第158和第213位的甲硫氨酸突变为苏氨酸。 当所述目的蛋白基因是一个以上拷贝时，是以目的蛋白表达盒为单位进入表达载体进行克隆的；优选地，当得到一个拷贝数的重组表达载体时，在此基础上经过酶切连接等手段重组得到两个拷贝数的重组表达载体；依次类推，得到一个以上拷贝数的各重组表达载体。每个单拷贝均含有完整的表达盒，其中包含目的基因、标签蛋白编码序列和各类表达元件的完整操纵子序列，确切的，标签蛋白编码序列包括但不限于6XHis或GST蛋白或MBP蛋白编码序列，表达元件包括启动子、操纵子、核糖体结合位点、多克隆位点和转录终止信号，并且，采用该方法构建P-hNGF串联多拷贝时，具有定向连接特征。所述的表达载体为原核表达系统，优选为pET系统、pGEX系统、pMAL系统；优选地，原核表达系统经过了改造，以使载体上的酶切位点不被相应的酶识别，其中所述酶切位点在后期被用于目的蛋白与表达载体的构建；比如，改造后的PET系统的多克隆位点上的BamHI.Sall和XhoI酶切位点已被消除，且载体转录启动子上游含有BglII酶切位点，而转录终止子下游添加串联的BamHI、SalI和XhoI酶切位点；上述酶切位点在载体上的前后顺序为 XhoI、Sail、BamHI、BglII。所述的目的蛋白的纯化为采用亲和层析柱进行纯化，优选为，亲和层析柱的标签为His标签、GST标签、MBP标签；任选地，所述纯化产物的切割包括化学试剂或酶切割，以获得纯化的目的蛋白重组蛋白；优选地，化学试剂为溴化氰、甲酸或羟胺，酶试剂为胰蛋白酶、梭菌蛋白酶、弗林蛋白酶、凝血酶或亮氨酸氨肽酶；本发明还保护由该方法所得的目的蛋白制品。本发明还保护由该方法所得的目的蛋白制品用于医药的用途。本发明以人神经生长因子P -hNGF为例来说明本发明的方法。本发明提供的方法具有普遍应用性，其具有如下设计方案I、设计扩增P -hNGF的特异性引物，从人胎盘中PCR扩增获得P -hNGF基因编码序列。设计的3 -hNGF引物具有如下特征编码链和模板链的5’端上游及3’端下游含有改造后载体MCS的不相同的酶切位点，使得P-hNGF基因能正向插入改造后的原核表达载体中，且插入的P -hNGF基因位于设计的BamHI、Sail和XhoI串联酶切位点之间。
2、利用寡核苷酸杂交之后与载体连接的方法消除载体多克隆位点(MCS)的BamHI、Sail和XhoI切点，同时在转录终止子下游引入串联的BamHI、Sail和XhoI酶切位点，该串联酶切位点序列为5’ -CTCGAGTCGACGGATCC-3’。所述改造载体用两对同尾酶(Bglll/BamHI和Sall/Xhol)及T4连接酶多次酶切连接后，可构建P -hNGF定向多拷贝克隆体。3、在P -hNGF基因的5’端上游序列引入切割位点序列，切割位点序列具有如下特征根据密码子规则编码的氨基酸序列可被化学试剂或酶切割。优选的，所述切割位点序列编码为单个氨基酸或两个氨基酸或六个氨基酸，确切的，单个氨基酸为R或W或M或D或E或K ;两个氨基酸为D-P或N-G ;三个氨基酸为R-K-R或R-R-R ;六个氨基酸为L-V-P-R-G-S。4、所述多拷贝构建体亚克隆至原核表达载体中形成原核表达构建体。所述构建体可在原核表达系统中进打原核表达，所述原核表达系统包括pET系统、pGEX系统、pMAL系统等，不排除其他原核表达系统。5、所述原核表达构建体在所述原核表达系统中原核表达后的产物可利用原核表达系统中的标签进行亲和层析纯化，所述标签包括His标签、GST标签、MBP标签等，不排除其他亲和层析标签。6、所述原核表达产物可被化学试剂或酶切割，获得纯化的P-hNGF重组蛋白，确切的，化学试剂包括溴化氰、甲酸和羟胺，酶试剂包括胰蛋白酶(Trypsin)、梭菌蛋白酶(Clostripain)、弗林蛋白酶(Furin)、凝血酶(Thrombin)和亮氨酸氨肽酶(Leucineaminopeptidase)。7、所述纯化后的P -hNGF重组蛋白，采用PC12细胞或鸡胚背根神经节进行培养检测，具有显著生物活性，与鼠颌下腺中提取的天然NGF无明显差异。8、采用本发明方法构建重组P -hNGF,降低了目的蛋白二硫键复性与构象折叠的难度，基因表达产物即为目的蛋白单体，不带额外氨基酸残基，既保证了产物活性，也省去了多拷贝的切割成本，纯化简单，易于大量生产。本发明的一个实施例提供了用本发明的方法制备人神经生长因子制品的步骤，与现有技术相比，本发明的制备方法表达量高、易于纯化、并保持了目的蛋白良好的生物学活性。本发明的一个实施例通过鸡胚背根神经节培养鉴定试验证明了该方法得到的人神经生长因子单体产物具有3 -NGF的活性。在本发明中，术语“定向”是指感兴趣多肽基因DNA片段按照编码链5’ -3’方向相互连接，还指表达多肽产物按氨基端-羧基端方向相互连接。在本发明中，术语“多拷贝”是指感兴趣多肽基因DNA片段大于或等于两个拷贝数。
图I为PCR介导的定点诱变技术的原理图。图2为hNGF与其他同源NGF序列保守性分析图。图3为表达盒(带有P -hNGF基因)串联构建流程图。图4为检测pET28a_NGFl，2，3酶切产物凝胶电泳图。
图5为鸡胚背根神经节培养鉴定P -NGF的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。以下目的蛋白是以P -hNGF为例来进行说明本发明的方法，其它目的蛋白类似。以下引物合成、序列合成和序列测序均为Invit rogen公司实施例I :利用串联多拷贝表达盒的方法高效表达P -hNGF
I、原核表达质粒的改造I. I 消除 pET_28a ( + )载体多克隆位点(MCS)中的 BamHI-SalI-XhoI 切点合成如下寡核苷酸片段pET28a-deBam-Xho-F:5’ -GATCTGAATTCGAGCTCCTGCAGCAAGCTTGCGGCCGCA-3’ (SEQID NO:I)pET28a-deBam-Xho-R:5， -TCGATGCGGCCGCAAGCTTGCTGCAGGAGCTCGAATTCA-3’ (SEQID NO :2)pET28a-deBam-Xho-F和pET28a-deBam_Xho-R变性杂交形成杂交片段产物，如下示例5’-GATCTGAATTCGAGCTCCTGCAGCAAGCTTGCGGCCGCA-3’I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I3，-ACTTAAGCTCGAGGACGTCGTTCGAACGCCGGCGTAGCT-5’将杂交产物与经BamHI/XhoI双酶切的pET_28a ( + )载体片段回收产物连接，转化DH5 a感受态细胞；挑选10个单菌落进行PCR鉴定，引物为pET_28a ( + )载体通用上下游引物；T7:5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，(SEQ ID NO:3)T7TER:5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’ (SEQ ID NO:4)菌落PCR鉴定为阳性的克隆经质粒提取后直接送测序公司测序，测序结果提示正确的克隆命名为pET28a-de-Bam-Xho。I. 2利用PCR介导的定点诱变技术(原理见图1，其中F和R为载体通用引物，IM和2M为诱变引物)在上述步骤所得的pET28a-de-Bam-Xho载体多克隆位点紧挨着转录终止子的下游引入BamHI-SalI-XhoI酶切位点。I)合成如下寡核苷酸片段pET28a-4383-F* :GGTTGCATTCGATTCCTGTT (SEQ ID NO:5)pET28a-647-R* CCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGT (SEQ ID NO:6)pET28a-Bam-Sal-Xho-F** :ATACTCGAGTCGACGGATCCGGATATAGTTC (SEQ IDN0:7)pET28a-Bam-Sal-Xho-R** :TCCGTCGACTCGAGTATGGCGAATGGGACGC (SEQ IDN0:8)注*为外围引物；**为诱变引物。2)突变位点片段扩增以pET_28a ( + )载体为模板，利用pET28a_4383_F*/pET28a-Bam-Sal-Xho-R# 引物和 pET28a-Bam-Sal-Xho-F#/pET28a_647-R* 引物分别扩增获得带有突变位点的5’侧翼和3’侧翼的扩增产物。PCR反应体系
权利要求
1.一种目的蛋白的制备方法，其特征是包括如下步骤， 目的蛋白核苷酸序列片段的获得； 目的蛋白重组表达载体的构建； 目的蛋白的诱导表达； 目的蛋白的纯化； 纯化产物的切割； 所述目的蛋白核苷酸序列片段的前面插入单体切割的识别位点； 所述目的蛋白通过PCR扩增得到，通过引物引入单体切割的识别位点； 优选的，目的蛋白是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽。
2.权利要求I的制备方法，其特征在于，在纯化之前还包括鉴定蛋白表达的步骤。
3.权利要求I或2的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白重组表达载体构建中的目的蛋白基因是一个或一个以上拷贝； 任选地，所述目的蛋白基因的一个以上拷贝数通过将含有一个以上拷贝目的蛋白基因的表达盒与表达载体构建来实现； 任选地，当得到一个拷贝数的重组表达载体时，在此基础上经过酶切连接等方法重组得到两个拷贝数的重组表达载体； 依次类推，得到两个以上拷贝数的各重组表达载体。
4.权利要求I或2的制备方法，其特征在于，所述的单体切割的识别位点是根据密码子规则编码的氨基酸序列，优选地，单体切割的识别位点序列编码为单个氨基酸或两个氨基酸或三个氨基酸或六个氨基酸；更优选地，所述单个氨基酸为R或W或M或D或E或K;两个氨基酸为D-P或N-G ;三个氨基酸为R-K-R或R-R-R ;六个氨基酸为L-V-P-R-G-S。
5.权利要求4的制备方法，其特征在于，所述的单体切割的识别位点可通过定点突变目的基因来实现；优选地将人神经生长因子的第158和第213位的甲硫氨酸突变为苏氨酸。
6.权利要求3的制备方法,其特征在于,所述的表达载体为原核表达系统,优选为pET系统、pGEX系统、pMAL系统；更优选地，原核表达系统经过了改造，以使载体上的部分酶切位点不被相应的酶识别。
7.权利要求I或2的制备方法，其特征在于，所述的目的蛋白的纯化为采用亲和层析柱进行纯化，优选地，亲和层析柱的标签为His标签、GST标签、MBP标签。
8.权利要求I或2的制备方法，其特征在于，所述纯化产物的切割包括化学试剂或酶切害I]，以获得纯化的目的蛋白重组蛋白；优选地，化学试剂为溴化氰、甲酸或羟胺，酶试剂为胰蛋白酶、梭菌蛋白酶、弗林蛋白酶、凝血酶或亮氨酸氨肽酶。
9.权利要求1-8任一方法所得的目的蛋白。
10.权利要求9的目的蛋白用于医药的用途。
全文摘要
本发明涉及一种目的蛋白制备方法及其用途。其制备方法为目的蛋白核苷酸序列片段的获得；目的蛋白重组表达载体的构建；目的蛋白的诱导表达；目的蛋白的纯化；纯化产物的切割；所述目的蛋白核苷酸序列片段的前面插入单体切割的识别位点；所述目的蛋白通过PCR扩增得到，通过引物引入单体切割的识别位点；其中的目的蛋白可以是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽等等。采用本发明的制备方法制备得到的目的蛋白表达量高、易于纯化、降低了目的蛋白二硫键复性与构象折叠的难度，基因表达产物即为目的蛋白单体，不带额外氨基酸残基，既保证了目的蛋白产物良好的生物学活性，也省去了多拷贝的切割成本，纯化简单，易于大量生产。
文档编号C07K14/48GK102978211SQ20121046700
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者任宏伟, 章永磊, 邹有土, 凡复, 汤黎娜 申请人:厦门北大之路生物工程有限公司