专利名称：以固定的纳米材料微球作基底的dna或rna合成装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA/RNA的合成技术，具体地说,涉及一种以固定的纳米材料微球作基底的DNA或RNA合成装置。
背景技术：
近年来，基因工程因其在疾病诊断、治疗领域上的应用前景而备受关注。常规技术手段中，长链DNA均由化学合成的短链寡核苷酸通过聚合酶反应拼接而成。因此，短链寡核苷酸的合成正确率、成本、效率直接决定了长链DNA的质量与生产成本。商用合成仪的最小产量为IOnmol量级，这超出了大多实验室的需求量，许 多研究致力于合成pmol量级的短链寡核苷酸，恰能满足一般需求。微流体方法及微阵列方法是合成pmol量级短链寡核苷酸的主要手段，大多研究也基于此开展。其中，Quake小组是研究微流体合成方法的代表，在“A microfluidic oligonucleotidesynthesizer，，Vol. 38 I 21February 2010, Nucleic Acids Research 中，充分体现了微流体合成DNA的优点，如合成量适中(一般为nmol量级)、无交叉污染、可实现高通量合成等。但这种方法亦存在诸多问题尚未解决，如操作复杂、结构或原料昂贵、原料溶液消耗过剩、因微泵和微阀的引入导致成本上升和效率下降等。Jingdong Tian小组是研究微阵列合成方法的代表，在“Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNAmicrochips” Vol. 432 | 23/30 December, Nature 中，详细阐述了微阵列方法合成 DNA 的优点，如合成密度高、高通量、精度高、合成效率高等。但该方法也存在若干问题，如产量太小，甚至不足以引发PCR反应；单独处理某种特定的寡核苷酸难度很大等。因此，开发一种合成量为pmol量级、高正确率、高效率、低成本的DNA合成仪，以满足实验室需求成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种以固定的纳米材料微球作基底的DNA或RNA合成装置。为了实现本发明目的，本发明的一种以固定的纳米材料微球作基底的DNA或RNA合成装置，其包括供液装置和基片；其中，基片上设有通孔阵列，纳米材料微球固定于各孔中，所述纳米材料微球经表面化学修饰后作为DNA或RNA合成的基底材料，将脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸单体溶液及反应试剂通过供液装置加入到固定有微球的各孔中，在微球表面完成DNA或RNA合成。所述纳米材料微球为二氧化娃微球，或者适合用于在其表面合成DNA或RNA的材料制成的微球，比如聚苯乙烯微球等。优选通过烧结的方法将纳米材料微球固定于通孔阵列的各孔中。优选所述基片为硅片。以硅片为衬底，采用低压化学气相淀积形成内外共两层掩膜层，其中，内层为二氧化硅掩膜层，外层为氮化硅掩膜层，制成基片。所述供液装置优选使用喷墨打印机，且在不同墨盒中分别装载四种脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸单体溶液及反应试剂，不同的溶液及试剂对应于打印机调色系统中相应的RGB 值。所述纳米材料微球表面经化学修饰后含-NH-CO-基团，并在最外端形成-OH基团。
优选所述通孔为倒楔形。本发明进一步提供采用上述合成装置合成DNA或RNA的方法将脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸单体溶液及反应试剂通过供液装置加入到基片上的通孔阵列中，基片的通孔中有固定的微球，在微球表面完成DNA或RNA合成，反应结束后，冲洗或浸泡基片，回收合成的 DNA 或 RNA。本发明的一种以固定的纳米材料微球作基底的DNA或RNA合成装置，综合了微流体合成方法和微阵列合成方法的优势，既具有微流体合成方法合成量适中、高通量、无交叉污染的特点，又具有微阵列合成方法合成工艺简单、合成效率高的特点，有望应用于合成特 异性短链寡核苷酸的场合，例如引物、探针和由短链组成长链的合成工作等。与现有技术相t匕，优点在于(一)采用固定在孔或腔体内的纳米材料微球作合成DNA/RNA的基底，一方面可同时高通量合成不同种类的DNA/RNA，且其产量适中；另一方面在保证反应腔集成密度的基础上，腔体间的物理隔离亦可避免交叉污染。( 二)采用喷墨打印机将合成反应中所需的微量试剂输送至相应的反应腔中进行合成反应，可避免因引入微泵、微阀所致的试剂流通速率小、成本高的问题，且具有通量高、操作简单、效率高等优势。
图I为本发明较佳实施例中基片及基片上通孔阵列的制备流程示意图。图2为本发明较佳实施例中对二氧化硅微球表面进行化学修饰的流程示意图。图3本发明较佳实施例中DNA化学合成示意图。图4本发明较佳实施例中DNA或RNA合成装置工作原理示意图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。 实施例以固定的纳米材料微球作基底的DNA或RNA合成装置I. I以硅片为衬底采用薄膜生长、光刻、干法刻蚀和湿法腐蚀的方法制作硅阵列式通孔操作步骤如下I)以厚度为400 μ m的双抛硅片I为衬底，采用低压化学气相淀积双面生长两层掩膜层(内层为二氧化娃掩膜层2,厚度IOOnm,外层为氮化娃掩膜层3,厚度IOOnm),如图IA ；2)正面光刻制作阵列式通孔所需的图形，背面保护，湿法腐蚀或干法刻蚀步骤I)中生长的掩膜层，然后以光刻胶为掩膜，采用反应离子刻蚀技术刻蚀氮化硅掩膜层，再用氢氟酸溶液腐蚀二氧化硅掩膜层，如图IB ；3)用氢氧化钾溶液腐蚀硅片至硅片穿通，如图IC ；
4)采用背面反应离子刻蚀技术去除氮化硅掩膜层和二氧化硅掩膜层，形成阵列式倒楔形通孔4，且倒角为53°。当底开口边长为120 μ m时，其容积为78. 5nL，如图1D，得到硅阵列式通孔。I. 2将二氧化硅微球固定于倒楔形硅通孔中操作步骤如下5)硅片正面键合一层干膜5，光刻形成与倒楔形硅通孔阵列相同的图形，如图IE ；6)用移液器将配好的含有浓度为10%的二氧化硅微球浊液滴入已贴上干膜的倒楔形通孔，重复多次，完成自组装，使倒楔形通孔中装满二氧化硅微球6，后续化学合成反应均在微球表面进行，该倒楔形通孔即为反应腔，如图1F(该工艺既可以保证通孔内的合成量适中，又能避免引入微泵、微阀所致的成本上升和试剂流通速率下降问题)；
7)先将硅片浸入丙酮，使其上的干膜发生卷曲而剥离，以去除反应腔间、干膜上过量的二氧化硅微球7，再用氢氧化钾去除残余干膜，如图IG ；8)将娃片于1050°C烧结处理12h,使二氧化娃微球表面熔化,实现微球间及微球与倒楔形侧壁间的物理性粘结，即可将微球固定于通孔中，形成有阵列式反应腔的芯片8，以满足后续化学合成实验中冲洗反应腔内残余试剂的要求，如图1G。I. 3在反应腔/孔内进行DNA/RNA合成反应首先化学修饰微球，使其形成-NH-CO-基团，以便灵活切割合成后的DNA/RNA ;继续进行化学修饰，使其最外端形成-OH基团，以使所需的第一个核苷酸与之反应，链接其上，如图2。本发明采用典型的“脱保护-偶联-盖帽-氧化”合成方法。具体的化学合成实施方法为=EPSON六色压电式喷墨打印机的不同墨盒中装入合成反应所需的试剂，分别为四种不同脱氧核苷酸溶液、一种脱保护的弱酸(例如四唑)及一种切割产物用的弱碱(例如氨水)。将六种试剂作为打印机相应颜色的墨水处理，六种墨水均有唯一的RGB值。本发明在Microsoft PPT中设置与六种墨水RGB值完全一致的色块作为输入，通过控制不同色块的位置、大小来控制打印头喷出液体种类、位置和数量，实现将合成反应中所需的微量试剂输送至芯片上装满微球的腔体中，完成DNA的化学合成，如图3。基本工作原理如图4。倒楔形通孔阵列的芯片8及其支架9等均固定不动，支架下端真空泵接口 10可产生负压，以冲洗化学合成过程中的残余试剂；芯片上有装满固定二氧化硅微球的倒楔形通孔阵列，所有化学合成均在孔中进行；打印机将实验中所需不同液体通过不同颜色的墨盒及管路11，输送至确定的倒楔形反应腔，此时打印头12的运动方向是左右方向，喷出试剂13不是单一种类，图4A为系统工作的正视图，图4B为系统工作的侧视图。此时打印头的运动方向是垂直于纸面向里或向外方向，喷出试剂14是单一种类。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种以固定的纳米材料微球作基底的DNA或RNA合成装置，其特征在于，包括供液装置和基片；其中，基片上设有通孔阵列，纳米材料微球固定于各孔中，所述纳米材料微球经表面化学修饰后作为DNA或RNA合成的基底材料，将脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸单体溶液及反应试剂通过供液装置加入到固定有微球的各孔中，在微球表面完成DNA或RNA合成。
2.根据权利要求I所述的合成装置，其特征在于，所述纳米材料微球为二氧化硅微球或聚苯乙烯微球。
3.根据权利要求I所述的合成装置，其特征在于，通过烧结的方法将纳米材料微球固定于通孔阵列的各孔中。
4.根据权利要求I所述的合成装置，其特征在于，所述基片为硅片。
5.根据权利要求I所述的合成装置，其特征在于，以硅片为衬底，采用低压化学气相淀积形成内外共两层掩膜层，其中，内层为二氧化硅掩膜层，外层为氮化硅掩膜层，制成基片。
6.根据权利要求I所述的合成装置，其特征在于，所述供液装置为喷墨打印机，且在不同墨盒中分别装载四种脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸单体溶液及反应试剂，不同墨盒中的溶液及试剂对应于打印机调色系统中相应的RGB值。
7.根据权利要求I所述的合成装置，其特征在于，所述纳米材料微球表面经化学修饰后含-NH-CO-基团，并在最外端形成-OH基团。
8.采用权利要求1-7任一项所述合成装置合成DNA或RNA的方法，其特征在于，将脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸单体溶液及反应试剂通过供液装置加入到基片上的通孔阵列中，在微球表面完成DNA或RNA合成，反应结束后，冲洗或浸泡基片，回收合成的DNA或RNA。
全文摘要
本发明提供了一种以固定的纳米材料微球作基底的DNA或RNA合成装置，包括供液装置和基片；其中，基片上设有通孔阵列，纳米材料微球固定于各孔中，所述纳米材料微球经表面化学修饰后作为DNA或RNA合成的基底材料，将脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸单体溶液及反应试剂通过供液装置加入到固定有微球的各孔中，在微球表面完成DNA或RNA合成。该装置综合了微流体合成方法和微阵列合成方法的优势，既具有微流体合成方法合成量适中、高通量、无交叉污染的特点，又具有微阵列合成方法合成工艺简单、合成效率高的特点，有望应用于合成特异性短链寡核苷酸的场合，例如引物、探针和由短链组成长链的合成工作等。
文档编号C07H21/04GK102962015SQ20121047282
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者李志宏, 梁子才, 李辉, 余怀强, 王玮, 王任鑫 申请人:北京大学