C型凝集素及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物医药【技术领域】，涉及C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段的获得方法及其在微生物及其相关分子模式检测、诱导昆虫产生抗菌肽、制备C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段抗体等方面的应用。本发明的C型凝集素氨基酸序列如图2—（A）所示，C型凝集素衍生物或类似物或活性片段的序列如图3所示。本发明的C型凝集素原料液经过离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化，或通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤分离纯化方法中的两个或多个的组合以及其分离纯化方法顺序的重排组合获得电泳纯乃至HPLC纯度的C型凝集素。
【专利说明】C型凝集素及其制备方法和应用【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药【技术领域】，涉及C型凝集素的结构及其获得方法与应用，具体地说，本发明涉及C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备生产方法，以及其在微生物及其相关分子模式检测、诱导昆虫产生抗菌肽、制备C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段抗体等方面的应用。
【背景技术】
[0002]凝集素(lectin)是一类能专一识别糖结构并与之非共价可逆结合的非酶、非抗体蛋白，其活性依赖于Ca2+，称为C型凝集素(C-type lectin)。由于种类繁多，构成了一个庞大的C型凝集素超家族(C-type lectin superfamily, CLSF)0其成员多为整合型跨膜蛋白，也有水溶性蛋白，但都是多结构域的分子，且具有一个共同的结构特征:含有一个或多个C型糖识别结构域(carbohydrate recognition domain, CRD)。C型凝集素普遍存在于哺乳动物、无脊椎动物、植物、甚至微生物体内。甘露糖结合凝集素(mannose-bindinglectin,MBL)作为哺乳动物体内典型的C型凝集素，在结合甘露糖后，通过凝集素调节通路激活体内补体系统。在昆虫体内，C型凝集素不仅作为模式识别受体(pattern recognitionproteins, PRPs)识别病原相关分子模式(PAMPs)，从而激活体内一系列的免疫应答，同时它也是一种可诱导的免疫 蛋白直接作用于外源入侵微生物。
[0003]无脊椎动物体腔液内存在天然的凝集素最早由Nogochi (1903)发现，此后关于无脊椎动物凝集素的报道，主要集中于甲壳纲软体动物。20世纪80年代以来，昆虫C型凝集素的报道逐渐增多，特别是关于昆虫C型凝集素作为免疫效应分子和分子识别功能方面，受到昆虫发育生理学者和免疫学者的广泛重视。到目前为止，在果蝇中已经成功钓取至少19个属于C型凝集素超家族成员的基因，但是他们的功能目前仍不清楚。在一些昆虫血淋巴中分离纯化获得的C型凝集素已被证实在酚氧化酶原激活系统、对外源微生物的包埋以及血细胞结节的形成等免疫防卫功能中起作用。如，从美国大蠊血淋巴中分离的C型凝集素在Ca2+存在时，能特异性地与大肠杆菌的脂多糖(LPS)结合，这种结合可能主要通过LPS中的多糖结构而实现的。在对这个蛋白的cDNA序列分析时发现其羧基结构与哺乳动物C型凝集素有明显的同源性，这种蛋白的mRNA浓度强烈地被注射的外源细菌所诱导，因此推测，这种可结合LPS的诱导蛋白可能参与细菌物质的清除作用。
[0004]凝集素不仅具有与细胞表面寡糖结构结合的能力，而且许多凝集素都具有多个结合位点，结果产生凝集素连结的靶标细胞凝聚物，这种细胞凝聚活性已从一些昆虫血淋巴中被检测出来。少数昆虫的凝集素已从血淋巴中分离纯化，它们都是多聚体蛋白(7(Tl500kDa)，由3(T40kDa亚基构成。一种从烟草角虫血淋巴中分离出来的，称为M13的细菌诱导C型凝集素是一个有36kDa亚基的同源二聚体，这种凝集素对葡萄糖具有很高的亲和性，可与血细胞相互作用，从而将其加入血淋巴时会很快诱导一种细胞性的凝集反应。
[0005]综上所述，C型凝集素是普遍存在的特异性糖类结合的非酶类蛋白，C型凝集素不仅在昆虫免疫防卫中具有辨别‘自己’和‘非己’的模式识别功能，同时，作为免疫蛋白，C型凝集素可与红细胞或其他有糖结合物的细胞结合，使后者凝集或沉淀，而这种凝集能力可被某些糖所抑制。
[0006]目前尚未见对鳞翅目(I^pidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫C型凝集素的结构、制备、生物学功能的研究。
【发明内容】
[0007]本发明是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的C型凝集素，研究天然C型凝集素的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组C型凝集素及其衍生物或类似物或活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组C型凝集素及其衍生物或类似物或活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。
[0008]本
【发明内容】
的陈述，是使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
[0009]在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
[0010]本发明所指昆虫是鳞翅目昆虫，鳞翅目昆虫优选天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以柞蚕作为代表来描述下面的内容，而选择柞蚕作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
[0011]本发明所解决的技术问题是提供一种从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中获取C型凝集素的制备方法、结构、生物学功能及其应用。首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然C型凝集素。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析C型凝集素的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现C型凝集素基因在宿主细胞的表达，结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组C型凝集素。同时，利用基因重组技术，获得了 C型凝集素的衍生物或类似物或部分片段。天然、重组C型凝集素以及其衍生物或类似物或部分片段，能特异性识别脂多糖、β -1, 3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸等多种微生物相关分子模式以及细菌、真菌等微生物，并造成微生物发生凝集现象。同时，上述结合可在昆虫体内激活酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递途径，通过激活的Toll信号传递途径而使昆虫体内诱导产生抗菌肽，同时。本发明的天然、重组C型凝集素以及其衍生物或类似物或部分片段以及其抗体，可广泛应用于针对微生物的预防、检测、治疗药物等领域；同时，利用本发明的天然、重组C型凝集素以及其衍生物或类似物或部分片段作为抗原产生抗体，制备获得的抗体可应用于微生物的预防、检测、治疗药物等领域。
[0012]一、天然C型凝集素的制备
本发明所获得天然C型凝集素是通过如下技术方案实现的，包括:(I)昆虫血淋巴作为原料；昆虫血淋巴(简称血淋巴)，是昆虫血液(或血细胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液，用缓冲溶液或酸性溶液或碱性溶液溶解提取，离心除去不溶杂质得到抽提液作为原料；(2)原料分别通过亲和层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、盐析、超滤或上述方法的不同组合，分离纯化得到不同纯度乃至电泳纯或HPLC纯的C型凝集素。
[0013]C型凝集素的提取、分离、纯化体系基本条件的特征:(I)操作温度在(TC -45 0C，优选(TC -10°C; (2)溶液的酸碱度在PH2-PH12，优选pH4_pH10 ; (3)调节溶液酸碱度的化学试剂是常规、通用的酸或碱及其溶液，酸及其溶液优选HC1、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸，碱及其溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂；(4)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对、上述各缓冲离子的组合；(5)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.5mol/L,优选0.01mol/L-0.lmol/L。上述条件既不破坏提取、分离、纯化所采用介质的理化性质，又不影响C型凝集素的生物活性。[0014]将昆虫用蒸馏水或去离子水反复清洗，采用常规方法，如蜡盘法、离心法、背血管取血法、灌注法、压榨、匀浆法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪开法、穿刺法等，在10°C至-5 V条件下收集昆虫血淋巴。
[0015]1.离子交换层析分离纯化C型凝集素
取上述方法所获昆虫血淋巴，按C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。将处理好的样品上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐浓度阶段方式，分别用 0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、lmol/L、2mol/L、3mol/L 盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度从0.00mOl/L-3mOl/L。利用抗C型凝集素抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有C型凝集素的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐，或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
[0016]离子交换层析分离纯化的特征:(I)层析介质选择阳离子交换层析添料，如CM-离子交换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料等阳离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在PH2-PH7 ; (2)层析介质选择阴离子交换层析添料，如Q-离子交换层析添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料等离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在ρΗ7-ρΗ12 ； (3 )缓冲液及其浓度选择，按上述C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(4)洗脱的盐溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；(5)中性盐选择(NH4) #04或Na2SO4或NaCl或KCl，优选NaCl ；
(6)分离纯化操作温度按上述C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。上述条件既不影响C型凝集素的生物活性，又不影响活性成分的分离纯化。
[0017]2.亲和层析分离纯化C型凝集素
取上述方法所获昆虫血淋巴，按C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至C型凝集素的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。将处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的亲和层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐(或化学试剂)浓度梯度(0.0mol/L~3.0mol/L或0.0mol/L~6.0mol/L或0.0mol/L~8.0mol/L)方式洗脱；也可以米用盐(或化学试齐Li)阶段浓度洗脱方式，分别米用 0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、lmol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗C型凝集素抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有C型凝集素的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐(或化学试剂)或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
[0018]亲和层析分离纯化的特征:(1)亲和填料的配基选择C型凝集素抗体、肝素、刀豆素、甲醒固定后的细菌或真菌、丝氨酸蛋白酶抑制剂(如苯甲咪)、sepharose CL-4B、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖胺等；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(3)洗脱的盐(或化学试剂)溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加盐(或化学试剂)到需要的浓度；(4)洗脱用盐(或化学试剂)可以选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl或尿素或盐酸胍；(5)洗脱用盐(或化学试剂)选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl的最高浓度为3.0mol/L,选择尿素的最高浓度为8.0mol/L,选择盐酸胍的最高浓度为6.0mol/L ； (6)如果洗脱用盐(或化学试剂)选择了尿素或盐酸胍而使C型凝集素发生变性作用，可以通过常规、通用的蛋白质复性方法进行复性而获得C型凝集素。
[0019]3.疏水层析分离纯化C型凝集素
取上述方法所获昆虫 血淋巴，按C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至β -1, 3-葡聚糖识别蛋白的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。加中性盐至2mol/L浓度，上样于预先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用中性盐浓度梯度(2.0mol/L~0.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐浓度阶段洗脱方式，分别米用 1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.lmol/L、0.0mol/L中性盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗C型凝集素抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有C型凝集素的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
[0020]疏水层析分离纯化的特征:(1)疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料或正辛烷-疏水层析添料-或己烷-疏水层析添料-或丁烷-疏水层析添料；(2)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl ；(3)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按β -1, 3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
[0021 ] 4.凝胶层析分离纯化C型凝集素
取上述方法所获昆虫血淋巴，按C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至C型凝集素的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。样品液上样于预先用缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行分离纯化洗脱，利用抗C型凝集素抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有C型凝集素的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
[0022]凝胶层析分离纯化的特征:(I)层析介质可以选择Sephacryl S-100 HR或Sephacryl S_200 HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75 或Sephadex G-100 或SephadexG-150 或 Superose 12 prep grade 或 Superose 6 prep grade 或 Superdex 30 prep grade或 Superdex 75 prep grade 或 Superose 12 HR 或 Superose 6 HR 或 Superdex PeptideHR或Superdex75 HR或Superdex Peptide PE等凝胶层析添料；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征，此外洗脱液的浓度，优选在离子浓度大于0.15M及以上。
[0023]5.盐析分离纯化C型凝集素
取上述方法所获昆虫血淋巴，按C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至C型凝集素的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。在样品溶液中加入蛋白质盐析常规、通用的中性盐，至浓度达到C型凝集素仍处于溶解状态，而一些杂蛋白处于沉淀。离心取其上清溶液继续加入盐析常规、通用的中性盐至浓度达到C型凝集素沉淀状态。离心弃上清，沉淀溶于C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件特征的溶液或缓冲液储存备用；沉淀的溶解液，也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去其中的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
[0024]盐析分离纯化的特征:(I)分离纯化的缓冲液、酸碱度选择，是按C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(2)分离纯化操作温度在0°C -45°C，优选0°C; (3)盐析使用的中性盐，选择(NH4) #04或Na2SO4或NaCl，优选(NH4) 2S04或Na2SO4 ; (4)在使C型凝集素处于溶解状态时，选择中性盐在5% — 50%，优选25% — 40% ；(5)在使C型凝集素处于盐析沉淀状态时，选择中性盐在45% — 90%，优选55% — 70%。
[0025]6.超滤分离纯化C型凝集素以及处理C型凝集素溶液
取上述方法所获昆虫血淋巴，按C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调PH至C型凝集素的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。利用常规、通用超滤方法，分离纯化C型凝集素。一种方案，选择一定规格的超滤膜，使C型凝集素透过超滤膜，而一些杂蛋白则被超滤膜截留，从而使C型凝集素得以分离纯化；透过超滤膜的C型凝集素溶液，再选择一定规格的超滤膜，使C型凝集素被截留，而一些杂蛋白则透过超滤膜，从而使C型凝集素得以分离纯化。另一种方案，是选择一定规格的超滤膜，使C型凝集素先被超滤膜截留，随后再选择一定规格的超滤膜，使C型凝集素透过超滤膜，从而使C型凝集素得以分离纯化。
[0026]超滤处理C型凝集素溶液的目的，是除去C型凝集素溶液中的盐或小分子杂质或更换缓冲液。此外，对C型凝集素溶液进行浓缩。处理方法同上所述，选择一定规格的超滤膜，使C型凝集素被超滤膜截留，而盐或小分子杂质或缓冲液的缓冲离子对则透过超滤膜，从而实现去除盐、小分子杂质或更换缓冲液或浓缩的目的。
[0027]超滤分离纯化和处理的特征:(I)透过C型凝集素的超滤膜选择分子量为20kDa或30kDa或40kDa或50kDa或60kDa规格的超滤膜，优选20kDa — 50kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；(2)截留C型凝集素的超滤膜选择是分子量为3 kDa或IOkDa或20kDa或30kDa的超滤膜，优选IOkDa — 30kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；(3)超滤分离纯化或处理的操作温度、缓冲液及其酸碱度或浓度选择，是按C型凝集素提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。[0028]通过上述方法所获得的C型凝集素纯度，有时无法满足相应需要。本发明是从昆虫血淋巴中分离纯化高纯度C型凝集素，并可以达到电泳纯乃至HPLC纯度。其特征在于，将上述六种分离纯化方法(离子交换柱层析、亲和柱层析、疏水柱层析、凝胶过滤柱层析、盐析、超滤)，进行两种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或三种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或四种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或五种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或六种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，直至样品纯度得到预期要求。
[0029]二、C型凝集素结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对C型凝集素进行结构解析。其特征在于，(I)利用生物质谱测定天然C型凝集素的分子量；(2)采用常规蛋白水解酶及其水解条件，针对
【发明内容】
所获得C型凝集素进行降解，通过HPLC分离降解片段，利用生物质谱或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，从而获得C型凝集素分子内许多片段的氨基酸序列；(3)利用分子生物学技术、方法，从昆虫脂肪体提取总RNA，利用RACE技术构建昆虫cDNA pooL.根据目的蛋白降解片段的氨基酸序列，设计引物，PCR扩增片段基因。随后结合RACE技术获得C型凝集素基因一cDNA，通过基因序列测定分析获得其碱基序列并由其开放阅读框碱基序列推导获得C型凝集素全长一级结构；(4)利用分子生物学技术、方法等，从昆虫脂肪体提取其染色体基因。设计PCR扩增上下游引物，以昆虫染色体基因为模板，PCR扩增C型凝集素染色体基因，通过基因序列测定分析获得C型凝集素染色体基因中的内含子、外显子序列；(5)通过上述1-4所获得C型凝集素的分子量、分子内部分氨基酸序列、cDNA开放阅读框序列、染色体基因中的外显子序列，彼此相互验证上述结构信息，获得C型凝集素序列。[0030]三、重组C型凝集素及其部分片段或衍生物或类似物的制备
本发明的C型凝集素及其部分片段或衍生物或类似物通过基因工程表达制备获得，通过如下技术方案实现，包括:⑴将C型凝集素及其部分片段或衍生物或类似物编码DNA重组至表达载体；⑵用步骤⑴的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；⑶在适合的诱导表达条件下，培养步骤⑵的被转化的宿主细胞K4)收获并纯化所得到的目的蛋白。
[0031]本发明同时提供上述C型凝集素及其部分片段或衍生物或类似物的表达产物分离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法以及上述方法的多种组合，从基因工程细胞的溶胞产物或培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(Western)检测表达产物的存在及相应分子大小。
[0032]四、C型凝集素及其部分片段或衍生物或类似物的结合特异性及其应用
本发明再一个目的是针对天然、重组C型凝集素及其部分片段或衍生物或类似物的体外结合特异性、对微生物的凝集作用以及对激活酚氧化酶原激活系统和Toll途径的激活情况的对比，确定了天然、重组C型凝集素及其部分片段或衍生物或类似物的生物活性。同时，考察C型凝集素在机体免疫应答过程的表达，也研究了天然、重组C型凝集素及其部分片段或衍生物或类似物的应用。
[0033]此外，本发明也研究了天然、重组C型凝集素及其部分片段或衍生物或类似物作为抗原刺激机体产生抗体、抗体的制备以及其应用。
[0034]本发明所述的天然、重组C型凝集素及其部分片段或衍生物或类似物获得方法常
规、简单、产量高。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为天然C型凝集素的分离结果:
(A):实施例1中方法I分离获得天然C型凝集素的电泳图谱；⑶:实施例1中方法I所获天然C型凝集素的纯度分析图谱；(C):实施例2，3分离获得天然C型凝集素的电泳图
-1'TfeP曰。
[0036]图2为C型凝集素序列:
(A):氨基酸序列；(B):核苷酸序列。
[0037]图3为C型凝集素衍生物、类似物、活性片段结构；
(1)为C型凝集素全长氨基酸序列及其基因序列；
(A):氨基酸序列；(B):核苷酸序列:
(2)为Met— C型凝集素序列；
(3)为Met—组氨酸标签一C型凝集素序列；
(4)为Met-C型凝集素一组氨酸标签序列；
(5)Met一GST标签一凝血酶酶切位点一C型凝集素序列；
(6)Met 一C型凝集素一凝血酶酶切位点一GST标签序列。
[0038]图4为分离纯化的重组C型凝集素(原核表达体系)电泳图谱。
[0039]图5为分离纯化的重组C型凝集素(昆虫表达体系)电泳图谱。
[0040]图6为分离纯化的重组C型凝集素(哺乳动物细胞表达体系)电泳图谱。
[0041 ] 图7为C型凝集素的结合特异性:
(A):与微生物相关分子模式的结合特异性；
(B):与微生物的结合特异性；
(C):对微生物的凝集作用。
[0042]图8 C型凝集素及其抗体在酚氧化酶原激活系统中的作用:
(A):在脂多糖诱导的酚氧化酶原激活系统中的作用；
(B):在Lys-PGN、DAP-PGN、脂磷壁酸、甘露聚糖、可溶性β_1，3-葡聚糖所诱导的酚氧化酶原激活系统中的作用。
【具体实施方式】
[0043]下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
[0044]实施例1
天然C型凝集素的分离纯化 1.方法-1
将预冷的饱和硫酸铵搅拌并缓慢加入血淋巴中，进行硫酸铵分级沉淀。取30-50%沉淀组分用柠檬酸-磷酸缓冲体系溶解稀释，以此作为上样初始液上样于Q-S^harose阴离子层析柱进行梯度洗脱。将含有目的蛋白的组分上样于SP-Sepharose阳离子层析柱进行梯度洗脱，各洗涤洗脱组分用C型凝集素抗体进行Western blot跟踪监测。最后，利用凝胶过滤层析柱S^harose CL-6B对上述组分进行凝胶过滤及亲和层析的双重分离纯化，从而得到具有天然活性的C型凝集素纯品。
[0045]采用高压液相色谱(Tsk-gel G4000)检测获得单一组分。试验结果如图1一(A)，天然β -1, 3-葡聚糖识别蛋白的纯度约99.9%以上；电泳为单一条带(图1一 (B))。
[0046]2.方法-2
将收集于抗凝缓冲溶液(15 mmol.L-1 NaCl ；136 mmol.L-1梓檬酸钠；26 mmol.L-1柠檬酸；20 mmol -L-1 EDTA，pH 5.0)的血淋巴原料液，上样至反相高效液相色谱一硅基C4柱或十八烷基硅烷柱(ODS)。分别以含有0.05%三氯醋酸的水溶液和乙腈作为A相和B相，0-80%梯度洗脱，收集各组分峰。采用C型凝集素抗体进行跟踪监测，将只含有目的蛋白的组分超滤复性，即可得到有天然活性的目的蛋白。
[0047]试验结果如图1一(C)泳道I。 [0048]3.方法-3 将溶于昆虫生理盐水的真菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌混合物(1Oul)注射柞蚕体内，诱导24-48小时后，采用含有酚氧化酶原激活系统抑制剂的昆虫生理盐水收集血淋巴作为初始原料液。上样至亲和层析填料一甘露聚糖-agarose进行(O mol/L _3 mol/LNaCl)梯度洗脱，将含有目的蛋白的组分上样至苯基疏水层析柱，lmol/L~O mol/L NaCl昆虫生理盐水梯度洗脱。最后，将含有目的蛋白的洗脱组分利用凝胶层析柱Sephadex G-100洗脱并分离。采用C型凝集素抗体监测上述分离过程。
[0049]试验结果如图1一(C)泳道2。
[0050]实施例2:
C型凝集素结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对C型凝集素进行结构解析。具体方法、手段按照
【发明内容】
二中所列内容实施。
[0051]获得天然C型凝集素(也称成熟肽链，在本专利简称C型凝集素)的一级结构一氨基酸序列以及编码天C型凝集素的基因及其序列(如图2所示)。
[0052]利用生物信息学技术、方法等，针对本发明C型凝集素的结构进行同源比对分析，结果表明:本发明的C型凝集素属于C型凝集素超家族成员，该序列和与它同源性最高的十种昆虫来源凝集素比对，同源性仅有20%左右，且高保守氨基酸主要集中在两个CRD区(钙依赖型糖识别区域)，进化树显示该片段与任何已知凝集素进化关系都很远。
[0053]实施例3:
利用原核生物表达系统获得重组C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段本实施例列举描述原核生物表达系统表达本发明C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
[0054]原核生物表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
[0055]本实施是为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。[0056]对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。
[0057]1.C型凝集素基因的表达载体构建
根据C型凝集素(结构如图3)的N末端和C末端氨基酸序列，分别设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5'端，分别加上限制性核酸内切酶水解位点序列；以昆虫脂肪体cDNA pool为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过限制性核酸内切酶酶切后与同样进行双酶切表达质粒，在DNA连接酶的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞；经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。通过上述基因工程的方法，构建C型凝集素基因的表达载体。[0058]本实施例表达载体构建的特征:1.以大肠杆菌为宿主，表达载体可选择pTYBll、PMAL-C2X、pET-28a、pGEX_2T、pBV220、pQE30、pET20b 等；2.可以在 C 型凝集素的 N 端前融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag) ；3.可以在C型凝集素的C段后融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag) ；4.标签可以选择His-Tag (连续六个及以上组氨酸)、GST-Tag等；
5.可以在亲和层析标签与C型凝集素之间，添加蛋白水解酶水解位点的氨基酸序列，如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等，以获得与天然C型凝集素蛋白结构一致的重组C型凝集素蛋白。
[0059]2.重组C型凝集素蛋白及其衍生物、类似物、活性片段的获得
利用基因工程技术，将C型凝集素基因表达载体转化大肠杆菌，挑取单菌落后接种至含抗生素的LB，诱导C型凝集素基因的表达，从而获得含有C型凝集素的培养液或菌体。含有C型凝集素的菌体首先经裂解液裂解、超声破碎，释放目的蛋白后利用离心方法收集上清液作为重组C型凝集素的原料液备用。
[0060]重组目的基因表达的特征:1.表达载体转化进入宿主的方式可以选择热转化法和电转化方法；2.诱导表达的方式包括化学诱导一异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和加温诱导；3.C型凝集素基因可表达于细胞内或细胞外；3.存在于细胞内的C型凝集素需通过裂解液裂解、超速破碎等方式，将目的蛋白释放至溶液中。
按照实施例1的方法、原理、策略等，从上述含C型凝集素的原料液中分离纯化重组C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段至需要的纯度，直至达到电泳纯或HPLC纯。
[0061]例如:(1)采用pTYBll构建无标签C型凝集素表达载体，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经IPTG诱导，C型凝集素表达于细胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化C型凝集素的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化C型凝集素至电泳纯(图4中I)。
[0062](2)采用pET_28a构建N端前融合组氨酸标签的C型凝集素基因，热转化大肠杆菌，经IPTG诱导，His-C型凝集素表达于细胞内。采用裂解缓冲液(50m mol/LPBS, 0.15mol/L NaCl, 50 m mol/L咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化C型凝集素的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化C型凝集素至电泳纯(图4中2)。
[0063](3)采用pGEX-2T构建C端后融合GST标签的C型凝集素表达载体，热转化大肠杆菌，经加温诱导表达，C型凝集素一GST表达于胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化C型凝集素的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化C型凝集素至电泳纯(图4中3)。
[0064](4)采用pET20b构建C端后融合组氨酸标签的C型凝集素基因，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经加温诱导表达，C型凝集素一His表达于胞外。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化C型凝集素至电泳纯(图4中4)。
[0065]上述表达重组的C型凝集素结构如图3所示，分离纯化获得的重组表达产物，经过SDS-PAGE验证其纯度如图4所示。
[0066]上述含标签的纯化后表达产物经过上述常规、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表达产物中的融合肽段，再经分离纯化从而获得C型凝集素，该重组C型凝集素的结构与天然的C型凝集素的结构相同。
[0067]实施例4:
利用昆虫细胞表达系统获得重组C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段本实施例列举描述昆虫细胞表达系统表达本发明C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
[0068]昆虫细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
[0069]本实施例是使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
[0070]对于表达产物的分离纯化方法，采用实施例1的方法、原理、策略等。
[0071]1.利用pFastBacl—sf9昆虫表达体系获得重组C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段
将C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段基因连接到pFastBacl质粒中，构建PFastBacl-^GRP重组表达质粒。转座大肠杆菌DHlO，Bluo-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞sf9, Western blot验证重组C型凝集素在细胞内表达。
[0072]收集细胞，用裂解缓冲液(0.05 mol/L Tris-HCl, 0.5 mol/L NaCl, pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于抗C型凝集素抗体一sepharose CL-6B为配基的亲和层析柱,采用O mol/L _3 mol/L NaCl的裂解缓冲液进行梯度洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。表达产物的结构如图3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图5中I。
[0073]2.利用pMIB/V5_His—Sf21昆虫表达体系获得重组C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段
将C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段基因连接到pMIB/V5-His质粒中，构建pMIB/V5-His-^GRP重组表达质粒。转座大肠杆菌DH5，Bluo-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞Sf21, Western blot验证重组C型凝集素在细胞内表达。
[0074]收集细胞，用裂解缓冲液(0.05 mol/L Tris-HCl,0.5 mol/L NaCl，pH8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02 mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2 mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。表达产物的结构如图3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图5中2。
[0075]实施例4:
利用酵母表达系统获得重组C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段本实施例列举描述酵母细胞表达系统表达本发明C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
[0076]酵母细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
[0077]为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以PPIC9K表达载体、毕赤酵母GS115为代表进行描述。
[0078]对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。
[0079]利用常规、通用的基因工程技术，将C型凝集素基因连接到PPIC9K表达载体中，构建pPIC9K-His6-0 GRP (或pPIC9K_0 GRP)重组表达质粒，转化大肠杆菌，挑取阳性重组菌中重组质粒，经酶切形成线性分子，利用电转化方法将其转入毕赤酵母GS115中与基因组同源重组，经过初筛、复筛及Mut表型鉴定，筛选出阳性重组子，进行发酵及诱导表达，经Western blot验证，N末端带有His6_tag的重组C型凝集素为分泌型表达。
[0080]将重组菌GS115/pPIC9K-His6-Lectin (或 GS115/pPIC9K_Lectin)接种于50mlBMGY液体培养基中，于30°C，250rpm/min，震荡培养过夜。3000 g、4°C离心5 min，收集菌体。用10 ml BMMY培养基重悬菌体并开始甲醇诱导表达6h，重组蛋白以分泌表达形式存在于培养基中，12，000g、4°C离心4 min，得上清液，并以此为纯化初始液。
[0081]如果表达产物是His6_Lectin，直接将纯化初始液上样于0.05 M Tris-HCl (pH8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02 mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2 mol/L 咪唑(pH 8.0)进行洗脱并收获该洗脱液。该表达产物为His6_Lectin0
[0082]如果表达产物是C型凝集素，采用实施例1的方法、原理、策略等分离纯化获得重组C型凝集素。
[0083]实施例5:
利用哺乳动物细胞表达系统获得重组C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段本实施例列举描述哺乳动物表达系统表达本发明C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
[0084]哺乳动物细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
[0085]为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以P⑶NA3.0(neo+)质粒、CHO-Kl细胞为代表进行描述。
[0086]对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1和实施例2的方法、原理、策略等。
[0087]利用常规、通用的基因工程技术，将C型凝集素基因连接到P⑶NA3.0 (neo+)质粒中，构建 PCDNA3.0 (neo+)-His6_Lectin (或 pCDNA3.0 (neo+)-Lectin)重组表达质粒。将其转染哺乳动物细胞株CH0-K1，对转染成功细胞株于5%C02培养箱中，37°C贴壁培养72h，收集细胞及培养液，经Western blot验证，N末端带有His6_tag的重组C型凝集素得以表达。[0088]用15ul 重组质粒 pCDNA3.0 (neo+) -His6_Lectin (或 pCDNA3.0 (neo+) -Lectin)转染 8ml IMDM medium (含有 CHO-Kl cell, 2X105 cell/ml),于 37°C，15%C02 培养箱中，37°C贴壁培养72h。用0.25%胰蛋白酶消化细胞2~3min，使细胞悬浮，收集细胞。用5 ml裂解液(NP40)使细胞裂解，12，000g、4°C离心5 min，得上清液作为纯化初始液。
[0089]如果表达产物是His6_Lectin，直接将纯化初始液上样于0.05 M Tris-HCl (pH
8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02 mol/L咪唑(pH 8.0)分别充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2 mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱并收获该洗脱液。该表达产物为His6-C型凝集素。表达产物的结构如图3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图6。
[0090]如果表达产物是C型凝集素，采用实施例1的方法、原理、策略等分离纯化获得重组C型凝集素。
[0091]实施例6:
C型凝集素抗体的获得
按照常规、通用的抗体产生的技术，利用实施例1、3、4、5获得的各种C型凝集素作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生相应抗体。
[0092]利用常规、通用的抗体检测方法，检测被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清中C型凝集素抗体产生情况。
[0093]当被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛产生了 C型凝集素抗体后，采用常规、通用的动物血清采集与存 储方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清并存储，该血清可以直接应用。
[0094]利用常规、通用的抗体分离纯化技术，如盐析、各种类型层析介质、抗体亲和层析介质等，从存储的含有C型凝集素抗体的血清中分离纯化不同纯度的C型凝集素抗体，直至获得电泳纯或HPLC纯的C型凝集素抗体，以适于不同要求的应用。
[0095]实施例7:
重组以及天然C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段的生物活性为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。本实施例中重组、天然C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段具有相同的生物活性。以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段的生物活性为核心与基础，进一步拓展C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段的应用范围。
[0096]1.C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段与微生物相关分子模式的结合特异性
采用ELISA方法，以磷酸缓冲溶液为阴性对照，分别将可溶性微生物相关分子模式一Lys-PGN, DAP-PGN、脂磷壁酸、脂多糖、甘露聚糖、可溶性β -1, 3-葡聚糖固定于96孔板后，加入天然C型凝集素或重组C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段共孵育，利用C型凝集素抗体检测C型凝集素与微生物相关分子模式的结合程度。试验结果如图7- (A)所示，C型凝集素与六种不同类型微生物相关分子模式均可结合，其中，与脂多糖及可溶性β -1, 3-葡聚糖的结合程度强于其他类型微生物相关分子模式。
[0097]2.C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段与典型微生物的结合特异性
采用ELISA方法，以磷酸缓冲溶液为阴性对照，分别将不同类型微生物一大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、白色念珠菌固定于96孔板后，加入天然C型凝集素或重组C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段共孵育，利用C型凝集素抗体检测C型凝集素与微生物的结合程度。试验结果如图7- (B)所示，C型凝集素与六种不同类型微生物均可结合，其中，与枯草芽胞杆菌、白色念珠菌的结合能力较强，而与藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌的结合能力较弱。
[0098]3.C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段对微生物的凝集作用
在0.1mM Ca2+存在的情况下，将IOul 100ug/ml重组蛋白Ap_H6CTL (溶于PBS)与IOul溴乙锭染色的微生物细胞一大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌(2X108个/ml)于室温下孵育30min。以牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照。取IOul孵育后的混合物置于载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞凝集情况。如图7- (C)所示，C型凝集素对三种微生物具有明显的凝集作用。[0099]4.参与昆虫的酚氧化酶原激活系统以及激活Toll信号传递途径
根据专利“昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物和应用”(张嵘，专利申请号201210436927.0),以及专利“ β -1, 3-葡聚糖识别蛋白及其制备方法和应用”张嵘，专利申请号201210437330.8)，所述，昆虫体内存在受微生物及其相关分子模式诱导的酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递途径。
[0100]将天然、重组C型凝集素以及其衍生物、类似物、活性片段分别注入柞蚕幼虫体内后，柞蚕均没有发生黑化乃至死亡。同时，也检测不到因激活柞蚕体内酚氧化酶原激活系统进而激活Toll信号传递途径而诱导产生的抗菌肽。将天然、重组C型凝集素以及其衍生物、类似物、活性片段加入柞蚕血淋巴后，柞蚕血淋巴均没有发生黑化作用。
[0101]将天然、重组C型凝集素以及其衍生物、类似物、活性片段分别与真菌(死菌)或真菌的分子模式一 β -1, 3-葡聚糖或细菌或细菌分子模式之一一脂多糖混合，洗涤去除没有结合天然、重组C型凝集素以及其衍生物、类似物、活性片段的微生物或相关分子模式。将复合物分别注入柞蚕幼虫体内后，均可以使柞蚕体黑化乃至死亡。并且，在剂量相同的情况下，复合物引发血淋巴黑化程度，较之不含有C型凝集素的情况具有非常显著差异。同时，也能够检测到，因激活柞蚕体内酚氧化酶原激活系统进而激活Toll信号传递途径而诱导产生的抗菌肽。
[0102]上述实验结果表明:本发明专利的天然、重组C型凝集素以及其衍生物、类似物、活性片段，一方面具有微生物凝集的作用，一方面是昆虫体内酚氧化酶原激活系统的成分，作为结合蛋白与微生物及其分子模式结合后，激活了昆虫体内酚氧化酶原激活系统进而也激活Toll信号传递途径。
[0103]实施例9:
天然、重组C型凝集素以及其衍生物、类似物、活性片段及其抗体的应用为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以C型凝集素的生物活性为代表进行描述，C型凝集素衍生物、类似物、活性片段也具有相同的生物活性。同时也以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段及其抗体的生物活性为核心与基础，进一步拓展C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段及其抗体的应用范围。[0104]1.C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段诱导昆虫产生抗菌肽
如实施例8中所描述，利用微生物或结合了微生物相关分子模式的C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段可以诱导昆虫产生抗菌肽。基于此,从产生抗菌肽的昆虫体内制备相应的抗菌肽，该抗菌肽可以用于医药领域。
[0105]2.C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段用于微生物的检测
如实施例8中所描述，C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段作为酚氧化酶原激活系统的成分一起始激活因子，与微生物或其分子模式结合后，能够激活昆虫体内酚氧化酶原激活系统(激活的酚氧化酶引发黑化)进而也激活Toll信号传递途径的生物活性。
[0106]取任何待检测真菌的样品，首先与C型凝集素(包括及其衍生物、类似物、活性片段)混合，注入柞蚕幼虫体内，在一定时间观察柞蚕黑化程度和死亡率；对照组是将同样剂量的待检测微生物的样品注入柞蚕幼虫体内，在相同时间观察柞蚕黑化程度和死亡率。实验组与对照组具有显著差异，表明检测样品中含有微生物或其相关分子模式。
[0107]同样，利用柞蚕血淋巴替代柞蚕观察血淋巴的黑化程度。在一定时间，实验组与对照组的黑化程度具有显著差异；或血淋巴黑化程度达到同一程度所需时间缩短并具有显著差异；表明检测样品中含有微生物或其相关分子模式。
[0108]3.C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段抗体的应用 针对实施例6获得的C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段作的抗体，利用免疫学以及分子生物学等常规、通用的技术、方法等，通过C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段的抗体，用于鳞翅目昆虫样品的C型凝集素免疫检测。同样，也适用于从鳞翅目昆虫分离纯化制备C型凝集素过程中免疫检测跟踪分析以及样品的定性、定量检测分析。此方面的实验已经在上述的天然、重组C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段分离纯化制备过程中的实施例应用。
[0109]将足够剂量的C型凝集素抗体首先注入柞蚕幼虫体内，再将脂多糖注入该柞蚕幼虫体内后，脂多糖并不能引发柞蚕的黑化乃至死亡；同样，用柞蚕血淋巴替代柞蚕，事先加入足够剂量的C型凝集素抗体也可以阻断柞蚕血淋巴的黑化。同理，如图8 —(A)所示，将充分结合C型凝集素抗体的脂多糖注入柞蚕幼虫体内，β脂多糖不引发柞蚕的黑化乃至死亡；同样，用柞蚕血淋巴替代柞蚕，充分结合C型凝集素蛋白抗体的脂多糖也不引发柞蚕血淋巴的黑化。如图8 —(B)所示，以其他类型微生物相关分子模式代替脂多糖重复上述试验，均可得到相同的试验结果，说明，C型凝集素抗体可以抑制由微生物及其相关分子模式诱导的酚氧化酶原激活系统的激活。
[0110]在任何待检测微生物的样品中，加入足够剂量的C型凝集素抗体。按照本实施例中的C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段用于微生物的检测所述方法，进行待检测样品的微生物检测。同上结果，即便是样品中有能够被检测出微生物的量也不能检测出(阴性结果)，此实验的设计作为样品微生物检测的阴性对照组加以应用。
[0111]上述结果表明:C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段的抗体，通过与C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段的结合而屏蔽了与微生物及其相关分子模式的结合生物活性，从而使C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段失去了原有的生物活性。基于这种结合屏蔽作用原理可以广泛应用。
【权利要求】
1.C型凝集素，其特征在于，其氨基酸序列如图2 —(A)所示。
2.编码权利要求1所述的C型凝集素的基因，其特征在于，其序列如图2—(B)所示。
3.根据权利要求1所述的C型凝集素，其特征在于，所述的C型凝集素来源于鳞翅目(Lepidoptera)天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫,选自昨蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度昨蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，所述的昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。
4.C型凝集素衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，包含图2 —(A)所述的氨基酸序列全序或片段。
5.如权利要求4所述的C型凝集素衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，其序列如图3所示，选自Met-C型凝集素、Met-组氨酸标签-C型凝集素、Met -C型凝集素-组氨酸标签、Met-GST标签-C型凝集素、Met -C型凝集素-GST标签；C型凝集素全长肽链、Met-组氨酸标签-C型凝集素全长肽链、Met-C型凝集素全长肽链-组氨酸标签、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-C型凝集素全长肽链或Met-C型凝集素全长肽链-凝血酶酶切位点-GST标签。
6.重组C型凝集素及其衍生物、类似物、活性片段，其特征在于，表达产物具有C型凝集素的生物学活性。
7.如权利要求1所述的C型凝集素的制备方法，其特征在于，利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴，以昆虫血液或血细胞裂解物和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液作为分离纯化的原料液，原料液经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化C型凝集素，或通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤分离纯化方法中的两个或多个的组合以及其分离纯化方法顺序的重排组合获得电泳纯乃至HPLC纯度的C型凝集素。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于:所述的离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中: (1)操作温度在0°C-450C，优选0°C -1O0C ； (2)溶液的酸碱度在pH2-pH12，优选pH4-pH10； (3 )调节溶液酸碱度的试剂为是常规、通用的酸、碱、酸溶液或碱溶液，酸或酸溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸或它们的溶液，碱或碱溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂或它们的溶液； (4)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对或上述各缓冲离子的组合； (5)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.5mol/L，优选0.01mol/L-0.lmol/L。
9.根据权利要求1所述的C型凝集素或权利要求4所述的C型凝集素衍生物或类似物或活性片段的基因表达方法，其特征在于，所述的基因表达体系包括(I)原核生物系统的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞，(2)酵母细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为酵母细胞，(3)昆虫细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞，(4)哺乳动物细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为哺乳动物细胞，(5)上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达。
10.权利要求1所述的C型凝集素或权利要求4所述的C型凝集素衍生物或类似物或活性片段的基因表达产物的制备方法，其特征在于，它包括: (1)利用基因工程技术表达C型凝集素、C型凝集素衍生物或类似物或活性片段； (2)从上述表达体系中分离纯化重组的C型凝集素、重组的C型凝集素衍生物或类似物或活性片段； (3)上述表达产物经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化重组C型凝集素活性组分、重组C型凝集素衍生物或类似物或活性片段； (4)上述表达产物通过离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化方法中两个或几个分离纯化方法的组合以及其分离纯化方法顺序的重排组合获得电泳纯乃至HPLC纯度的重组C型凝集素、重组C型凝集素衍生物或类似物或活性片段。
11.C型凝集素或其衍生物或类似物或活性片段的抗体，其特征在于，以权利要求1所述的天然C型凝集素或权利要求5所述的重组C型凝集素以及其衍生物或类似物或活性片段作为抗原。
12.权利要求1所述的C型凝集素或权利要求4所述的C型凝集素衍生物或类似物或活性片段或权利要求11所述的抗体在微生物凝集、激活酚氧化酶原激活系统、诱导昆虫产生抗菌肽或微生物及其相关分子模式检测中的应用。
【文档编号】C07K1/16GK103833839SQ201210489807
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月27日 优先权日:2012年11月27日
【发明者】张嵘, 张景海, 吴春福 申请人:沈阳药科大学