专利名称：用Morpholino对其互补DNA进行保护的方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA的保护方法,特别涉及一种利用DNA类似物Morpholino(MO)与DNA形成双链，从而保护DNA不被核酸酶切的方法，属于生物化学领域。
背景技术：
DNA是一种重要的生命物质，是大多数生物的遗传信息载体。基于DNA的杂交/去杂交、在特定环境下的结构互变、酶切前后的构型改变等原理的DNA传感器或其他分子器件，已经成为现代生命分析领域的研究热点。核酸酶是一类可以将核酸链水解成低聚核苷酸或者单核苷酸的酶，它通过水解核酸链中的磷酸二酯键来打断长链，根据其作用机制，又可分为内切酶与外切酶等类别。能够专一识别特定序列并切断核酸链的限制性内切酶，已经广泛应用用基因测序及分子克隆工作中。核酸酶的存在导致DNA分子器件的使用寿命十分有限，使得其实际应用受到了极大的制约。而且，在分子器件的实际检测中，固定在表面的探针DNA分子由于荷负电而在固液界面间形成具有高电荷密度的界面电场。所以DNA的杂交需要克服极高的静电排斥力，也需要较高盐浓度的溶液体系。综上所述，如何提高DNA链在分子器件中的稳定性，是一个具有实际意义的问题。
发明内容
为了解决DNA分子器件中DNA链的稳定性问题，本发明考虑到了使用中性的DNA类似物，是一类与DNA具有相同碱基，但骨架结构为中性的人工核酸分子。这些类似物在生物学中通常用于抗转录研究。DNA中性类似物的链状分子结构与目标DNA间不存在静电排斥力，在低盐浓度下即可与DNA形成热力学稳定性的双链复合结构，并具有优良的抵抗核酸酶降解作用的能力，因此适合应用于DNA分子器件中。本发明中使用的Morpholino (以下可简称MO)是一种不带电荷的人造核酸,其分子结构与DNA类似(DNA结构式见图1-1)，只是糖环被吗啉基取代，磷酸骨架上一个O原子被-N(CH3)2取代。(MO结构式见图1-2)。与其他中性类似物诸如磷酸甲基化的核酸(methylphosphonated nucleotides,MP)、肽核酸(P印tide nucleic acid, PNA)相比，MO具有更加灵活的骨架结构，分子内碱基堆积作用的增强使其水溶性达到或超过相同序列的DNA分子，且MO形成的单层具有较高的分散性，有利于实现目标DNA的快速充分杂交；同时，由于MO高的水溶性，合成难度，价格均低于PNA，因此，MO在分子器件中具有极大的应用前景。研究已经表明，Morpholino本身具有抗核酸酶切的性质,可以考虑将它应用到分子器件的构建中。本发明的目的则是在于提供一种用Morpholino对其互补DNA进行保护的方法，为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种用Morphol ino对其互补DNA进行保护的方法,通过在金电极表面修饰Morphol ino单链，再将该Morpholino单链同相应序列的DNA单链进行杂交,使其具有抗酶切保护作用。具体地，上述方法包括如下步骤
(1)将巯基修饰的Morpholino单链固定到金电极表面,然后用3-巯基丙醇封闭；
(2)将修饰好Morpholino单链的金电极放在含其互补DNA单链的杂交溶液中进行杂交。其中，所述的步骤I为对金电极进行预处理后放入以去离子水配制的
O.5-1. 5 μ M的MO-SH溶液中修饰25_35min，优选放入以去离子水配制的I μ M的MO-SH溶液中修饰30min。上述步骤中，将金电极先后用O. 3 μ m>0. 05 μ m的氧化招粉打磨后,用去离子水超声清洗；用电化学方式抛光后，再次用去离子水洗净，完成预处理。本发明所述的方法，所述步骤I中，3-巯基丙醇浓度为O. 8-1. 5mM，封闭时间为
O.5-1. 5h ;优选所述3-巯基丙醇浓度为ImM，封闭时间为lh。本发明所述的方法，所述杂交溶液为DNA浓度为O. 5-1. 5 μ M的MgCl2溶液，其中MgCl2溶液的浓度为O. 8-1. 2Μ，杂交时间为3-5h ;优选DNA浓度为I μ M的MgCl2溶液，其中MgCl2溶液的浓度为IM ;杂交时间为4h。本发明所述方法在25_35°C恒温水浴中进行。此外，本发明所述的方法还包括检测步骤，所述的检测步骤为在所述DNA单链上设置电化学活性基团亚甲基蓝，将双链修饰的金电极放入含有内切酶的电解质溶液中，用时间间隔扫循环伏安的方式，测定酶切动力学曲线。其中，所述内切酶为脱氧核糖核酸I型酶。作为优选方案，本发明所述电解质溶液为2. 5mg/mL DNase I , 50mM PBS, 25mMMgCl2, Mg2+是该酶的活性中心，Mg2+的存在保证了该酶溶液的活性。此外，本发明优选电解液溶液pH=7.0。本发明通过Au-S键作用将巯基修饰的Morpholino单链固定到金电极表面,然后用3-巯基丙醇(MCP)封闭。将修饰好单链的电极放在其互补DNA溶液中进行杂交。该链上还有电化学活性基团亚甲基蓝(MB)，其还原峰的大小可直接指示留在电极表面的核酸链的量。将这些双链修饰的金电极放入含有酶的电解质溶液中，用时间间隔扫循环伏安的方式，测定酶切动力学曲线。从上述技术方案以及结果可知，这种保护方法行之有效，操作极为简单，而且Morpholino与其他常用DNA类似物诸如PNA，MP相比，价格更为低廉，而且水溶液性加，容易操作，极易推广使用。
图1-1和图1-2分别为DNA预期类似物Morpholino的分子结构图。图2实验原理示意图。图3-1和图3-2分别为相同序列的FC-DNA和FC-MO单链修饰的金电极在不同时间的循环伏安图，扫描范围0-0. 6V，扫速5V/S。图4-1和图4-2分别为将图3-1和图3_2所示循环伏安图中氧化峰峰面积进行积分，作出的相应峰面积随时间变化曲线。图5-1和图5-2分别为相同序列的MB-DNA-DNA双链、MB-DNA-M0双链修饰的金电极在不同时间的循环伏安图，扫描范围-O. 5-0V，扫速500mV/s。图6-1和图6-2分别为将循环伏安图中还原峰峰面积进行积分，作出的相应峰面积随时间变化曲线。
具体实施例方式实施例I
如图2所示,本发明提供的Morpholino保护DNA的具体步骤如下
O将金电极先后用O. 3 μ m、0. 05 μ m的氧化铝粉打磨后，用去离子水超声5min清洗。在O. IM H2SO4中扫循环伏安，电压范围-O. 2V I. 75V (vs. Ag/AgCl)，扫速O. 2v/s， segments :60,用电化学方式抛光后,再次用去离子水洗净。2)将清洗好的电极放入I μ M的M0-SH溶液中组装30min，取出后用去离子水冲洗。3)清洗后的电极放入ImM的MCP溶液中组装Ih。4)将上述单链修饰过的电极，浸泡到I μ M的互补DNA溶液中杂交4h。5)将修饰好单链或者双链的金电极，放入相对应的电解质溶液中，隔一段时间扫一次循环伏安，记录下电化学信号随时间的变化。本实施例的具体方法及其结果可参考附图3-图6，其中，图3-1和图3-2分别为相同序列的FC-DNA和FC-MO单链修饰的金电极在不同时间的循环伏安图，扫描范围0-0. 6V,扫速5V/s ;图4-1和图4-2分别为将图3-1和图3_2所不循环伏安图中氧化峰峰面积进行积分，作出的相应峰面积随时间变化曲线；图5-1和图5-2分别为相同序列的MB-DNA-DNA双链、MB-DNA-MO双链修饰的金电极在不同时间的循环伏安图，扫描范围-O. 5-0V，扫速500mV/s ;图6-1和图6_2分别为将循环伏安图中还原峰峰面积进行积分，作出的相应峰面积随时间变化曲线。从上述结果中可以看出，峰面积代表的是酶切过程中某一时刻电极表面留下的电化学物质的量，指示了酶切反应进行的程度，峰面积随时间变化的趋势线代表了这一反应进行的速度。由图3和图4中可得知，单链DNA会被DNase I切断而单链MO不会；从图5和图6中可以看出，DNA-DNA双链被快速切断，而相同序列的DNA-MO双链的酶解速度则缓慢得多，表明MO对其互补DNA确实有保护作用。实施例2
与实施例I相比，本实施例部分步骤不同，具体而言，本实施例步骤2-4为
2)将清洗好的电极放入O. 5 μ M的MO-SH溶液中组装25min，取出后用去离子水冲洗。3)清洗后的电极放入O. 5mM的MCP溶液中组装O. 5h。4)将上述单链修饰过的电极，浸泡到O. 5 μ M的互补DNA溶液中杂交3h。实施例3
与实施例I相比，本实施例部分步骤不同，具体而言，本实施例步骤2-4为
2)将清洗好的电极放入I. 5 μ M的MO-SH溶液中组装35min，取出后用去离子水冲洗。3)清洗后的电极放入I. 5mM的MCP溶液中组装I. 5h。
4)将上述 单链修饰过的电极，浸泡到I. 5 μ M的互补DNA溶液中杂交5h。
权利要求
1.一种用Morpholino对其互补DNA进行保护的方法，通过在金电极表面修饰Morpholino单链,再将该Morpholino单链同相应序列的DNA单链进行杂交,使其具有抗酶切保护作用。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，包括如下步骤 (O将巯基修饰的Morpholino单链固定到金电极表面,然后用3-巯基丙醇封闭； (2)将修饰好Morpholino单链的金电极放在含其互补DNA单链的杂交溶液中进行杂交。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步骤I为对金电极进行预处理后放入以去离子水配制的O. 5-1. 5 μ M的MO-SH溶液中修饰25-35min，优选放入以去离子水配制的I μ M的MO-SH溶液中修饰30min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将金电极先后用O.3 μ m、0. 05 μ m的氧化铝粉打磨后，用去离子水超声清洗；用电化学方式抛光后，再次用去离子水洗净，完成预处理。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤I中，3-巯基丙醇浓度为O.8-1. 5mM，封闭时间为O. 5-1. 5h ;优选所述3-巯基丙醇浓度为ImM，封闭时间为lh。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述杂交溶液为DNA浓度为O.5-1. 5μ M的MgCl2溶液，其中MgCl2溶液的浓度为O. 8-1. 2Μ，杂交时间为3_5h ;优选DNA浓度为I μ M的MgCl2溶液，其中MgCl2溶液的浓度为IM ;杂交时间为4h。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法在25-35°C恒温水浴中进行。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括检测步骤，所述的检测步骤为在所述DNA单链上设置电化学活性基团亚甲基蓝，将双链修饰的金电极放入含有内切酶的电解质溶液中，用时间间隔扫循环伏安的方式，测定酶切动力学曲线。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述内切酶为脱氧核糖核酸I型酶。
全文摘要
本发明涉及一种DNA的保护方法，该方法是一种利用DNA类似物Morpholino与DNA形成双链，从而保护DNA不被核酸酶切的方法。Morpholino是一种结构为DNA中的糖环被吗啉基取代形成的人工核酸，本发明让DNA与其互补的Morpholino杂交形成双链，用电化学的方法验证该双链具有抗脱氧核糖核酸Ⅰ型酶切的性质，证明这种保护作用行之有效，易应用于DNA分子器件中。
文档编号C07H1/00GK102943072SQ201210497199
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者王康, 夏兴华, 曹雷, 王凤彬, 吉丽娜 申请人:南京大学