专利名称：识别n-乙醇酰gm3神经节苷脂的重组抗体和片段以及其在肿瘤诊断和治疗上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域和特别是使用基因工程技术获得较少免疫原性的免疫球蛋白以用于癌症治疗方面。本发明特别地涉及编码识别抗原的单克隆抗体或其衍生片段的肽序列，所述抗原包含N-乙醇酰GM3神经节苷脂，但不包括其它相关的神经节苷脂如N-乙醇酰或N-乙酰，和硫酸化糖脂。
背景技术：
神经节苷脂是包含唾液酸的糖鞘脂并且其存在于脊椎动物的质膜中(Stults CLM等人，Methods Enzymology 179:167-214,1989)。在文献中已报道了这些分子中的一些是肿瘤相关抗原或肿瘤标记(Hakamori SH :Curr Opin Immunol 3 :646-653,1991),然后描述了抗神经节苷脂抗体在癌症的诊断和治疗中的用途(Hougton AN等人，NAS USA 82:1242-1246，1985 ;Zhang S 等人 Int J Cancer 73:42-49,1997)。哺乳动物中更普遍的唾液酸是N-乙酸(NAc)和 N-乙醇酸(NGc) (Corfield AP 等人，Cell Biol Monogr 10 :5-50,1982)。通常NGc不在人和鸡正常组织中表达但其广泛地存在于其它脊椎动物中(LeedenRW 等人，Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A 和 Shengtrund CL (Eds) PlenumPress, New York, 1-48,1976, KawaiT 等人，Cancer Research 51 :1242-1246, 2001)。然而来自文献的报道显示抗NGc抗体识别一些人肿瘤和肿瘤细胞系(Higashi H等人，Jpn J. Cancer Res. 79 :952-956,1988, Fukui Y 等人，BiochemBiophys Res Commun 160 1149-1154,1989) o已在人乳腺癌中发现GM3 (NGc)神经节苷脂水平的增加(Marquina G等人，Cancer Research 56 :5165_5171，1996)，所述发现使得该分子作为癌症治疗的靶标的用途非常具有吸收力。提交的专利EP0972782 Al描述了由根据Budapest条约保藏的保藏号为ECACC98101901的杂交瘤产生的鼠科动物单克隆抗体。该单克隆抗体具有IgGl同种型并通过免疫Balb/c小鼠产生，所述小鼠用疏水地缀合低密度脂蛋白(VLDL)的NGcGM3神经节苷脂和在弗氏佐剂存在的情况下进行免疫，所述抗体优选地结合NGcGM3神经节苷脂和识别在人乳腺和黑素瘤肿瘤中表达的抗原。(Carr A等人,Hybridomal9 :3 :241-247, 2000)。该抗体对含有所述序列的细胞表现出很强的细胞溶解活性，这可以使其成为治疗工具。此外已知由肿瘤诱导的新血管形成在肿瘤生长的控制中构成了其中一个主要参数。该参数已指导研究朝向寻找涉及抗原过程抑制的新的治疗武器。存在涉及该过程的 14F7抗体功效的实验证据。已在基质凝胶测定中发现所述证据(Angiogenesis.第4卷，Pags. 113-121,2001 ；Ant1-Cancer Res.第 18 卷，Pags. 783-790，1998)。基质凝胶是基底膜蛋白和围绕内皮细胞的细胞外基质的混合物。其在新血管形成过程中的有效性在于在新血管发育期间内皮-基质相互作用的生理学重要性。同样，该凝胶的组分例如层粘连蛋白被认为是该过程的重要标记。该模型类型也已用于涉及肿瘤诱导的血管发生的机制的研究中，允许评估能够调节直接涉及肿瘤的事件因而影响其生长和转移的药物。
使用非人单克隆抗体例如鼠科动物14F7对人的治疗具有某些不利方面，特别是在反复的治疗方案中。例如鼠科动物单克隆抗体具有相对较短的血液半衰期。此外在用于人时，其丧失了重要的免疫学特性例如效应物功能。并且更重要的是，鼠科动物单克隆抗体包含相当多的当注射入人时产生免疫原性的氨基酸序列。大量研究已表明在施用外源抗体后在患者体内产生的免疫应答可以相当强烈并且在最初的治疗后基本上消除了抗体的治疗功效。此外，甚至在用鼠科动物单克隆抗体对患者进行治疗后，用非相关的鼠科动物抗体进行的后续治疗可能会无效和甚至会因为称作 HAMA 应答(Khazaeli, M. B.,等人，Journal of Immunotherapy 15 :42-52,1994)的交叉反应性而造成危险。
Mateo等人(美国专利号US 5 712 120)描述了用于减少鼠科动物抗体免疫原性的方法。经Mateo等人(Mateo C等人,Hybridomal9 6 :463-471, 2000)描述的方法修饰的所述抗体保持了原始抗体的对抗原的识别和结合能力并产生较小的免疫原性，所述免疫原性的减小增加了其治疗有效性。通过该方法获得具有少量突变的经修饰的抗体，当与嵌合抗体比较时所述抗体表现免疫原性减小。从上面推知，需要以简单经济的方式获得免疫原性较小的治疗性抗体版本并且因此产生足够用于生产人使用的治疗性制剂。还已知抗体片段的使用在疾病的免疫诊断中非常有用。除其它以外，IraPastan(提交的欧洲专利EP 0796334 Al)描述了使用特异性识别涉及Lewis Y抗原的糖类的抗体的可变区构建Fv类型单链片段。基于所述片段，作者发展了用于检测含有所述抗原的细胞的方法并且也提供了这些片段对含有所述抗原的细胞的抑制效应的证据。由于该抗原在各种疾病的免疫治疗中的潜能，14F7单克隆抗体结合位点的知识在实践和理论上引人关注。Souriau, C 等人在 ExpertOpin. Biol. Ther. 1,845-855, 2001 和Chester, K. A.,等人在Dis. Markers. 16, 53-62, 2000中表明通过利用scFv类型的抗体片段的药物学特性例如在肿瘤组织中更好的穿透性，使用其可产生非常好的治疗用途。暴露在丝状噬菌体上的来自杂交瘤的抗体片段迷你文库的构建使得能够在该库中选择对所述抗原具有特异性识别能力的分子。目的是快速获得以更小的分子尺寸结合原始抗体并且能够由细菌宿主生产的抗体片段。该技术允许选出非功能性或不可能在细菌中生产的多个抗体片段的变体，所述变体是在用常规克隆技术(Roovers，R. C.等人，Br. J. Cancer. 78，1407-1416，1998)分离和操作杂交瘤基因的可变区的过程中获得的。丝状噬菌体中抗体片段呈递技术学提供了接近抗体结合位点以及在所述抗体中引入修饰以提高其亲和力(Chames, P.等人，J.1mmunol. 161, 5421-5429,1998,Lamminmaki, U 等人，J. Mol. Biol. 291, 589-602,1999, Parham1-Seren 等人，J. Tmmuno1.Methods. 259，43-53，2002)或调节其特异性(Iba, Y.等人，Prot. Engn.，11，361-370，1998, Miyazaki, C.等人，Prot. Engn. 12,407-415,1999, Darveau, R. P.等人，J. Clin.1mmunoassay. 15,25-29,1992)的独特机会。在丝状噬菌体中抗体片段的表达允许链的交换(Lantto, J.等人，Methods Mol. Biol. 178，303-316，2002)或反过来因而允许研究各链在抗原识别和其对抗体亲和力的影响上所起的作用(Kabat, E. A. , Wu, T. T. , J.1mmunol. 147,1709-1719,1991, Barbas III, C. F. , Lerner, R. A. Methods A companion to MethodsinEnzymology 2，119-124，1991)，所述链是各种不同VLs和原始抗体VH的组合。链的交换使得可以修饰结合位点的特性并且也使得可以组合来自不同物种的免疫球蛋白序列以及使得可以选择保持识别特异性的变体(Klimka，A.等人，Br. J. Cancer. 83，252-260，2000，Steinberger, P.等人，J. Biol. Chem. 275，36073-36078，2000，Rader, C.等人，Proc. Natl.Acad. Sc1. USA. 95，8910-8915，1998，Beiboer, S. ff. H.等人，J. Mol. Biol. 296，833-849，2000)。本发明涉及来源于鼠科动物14F7单克隆抗体的经修饰的抗体，所述经修饰的抗体以相同的亲和力识别原始抗原并且在给患者施用时产生较小的免疫原性。本发明的另一个发现是已获得来源于所述抗体的片段，所述片段包含不同于原始抗体但保持其的与特异性、亲和力以及识别特性相关的特性的轻链可变区，并且可通过细菌宿主以可溶性分子表达和呈现在丝状噬菌体表面。来源于14F7抗体的片段可用作治疗性武器。此外，14F7抗体的scFv类型片段在M13丝状噬菌体表面的表达使得可以操纵结合位点和获得具有用于治疗目的更高亲和力的变体。本发明的一个目的是表征抗体片段，所述抗体片段仅部分保存14F7的序列但仍保持其特异性、亲和力和识别特性。 经修饰的抗体和获得的片段都特异性地识别表达NGcGM3抗原的肿瘤细胞，因而使得其可用于诊断或治疗所述肿瘤，并且具有低于其所源自的鼠科动物抗体的免疫原性。包含经修饰的14F7抗体或其Fv单链片段的新的用于定位或治疗表达所述抗原的肿瘤的治疗性组合物是本发明的目的，其中所述抗体或片段可以结合放射性同位素。使用药物组合物对表达NGcGM3神经节苷脂的肿瘤进行放射性免疫诊断或放射性免疫治疗的方法也是本发明的目的，所述药物组合物包含经修饰的结合有放射性同位素的14F7抗体或其片段。发明详述在本发明中描述了来源于由保藏号为ECACC 98101901的杂交瘤产生的鼠科动物14F7单克隆抗体的嵌合抗体，其特征在于下列重链和轻链的高变区(CDRs)序列。CDRl SYffIHCDR2 YIDPATAYTESNQKFKDCDR3 ESPRLRRGIYYYAMDY轻链CDRl RASQSISNNLHCDR2 : YASQSISCDR3 =QQSNRffPLT优选地所述嵌合抗体的特征在于下列重链和轻链的构架区(FRs)的序列FRlQVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFTFR2 =WLKQRPDQGLEffIGFR3 KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCARFR4 WGQGTTVTVSS轻链
FRl :DLVLTQSPATLSVTP⑶SVSFSCFR2 WYQQRTHESPRLLIKFR3 GIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFCFR4 FGAGTKLELKRA此外嵌合抗体的特征在于包含人IgGl的重链恒定区和人Ck的轻链恒定区。在优选的实施方案中，本发明涉及来源于由保藏号为ECACC98101901的杂交瘤产生的鼠科动物14F7单克隆抗体的经修饰的抗体，其特征在于重链和轻链的构架区包含下列任何突变
MM.位点5 V替代Q位点9 A替代N位点11 :V替代L位点12 :V替代A位点18 : V替代M位点19: R替代K位点20 V替代M位点38: R替代K位点40: A替代R位点42 G替代D位点48 V替代I轻链位点39 K替代R位点40 P替代T位点41 :G替代H位点42 Q替代E位点58 V替代I优选地，所述经修饰的抗体特征在于含有人IgGl的重链恒定区和人Ck的轻链恒定区。本发明的另一个方面涉及来源于14F7抗体的Fv单链类型片段，所述片段包含获自杂交瘤(保藏号ECACC 98101901)的重链可变区的序列并保存14F7的识别特异性。优选地所述Fv片段包括来源于非免疫小鼠或人的轻链可变区，所述轻链可变区不同于由所述的杂交瘤产生的轻链可变区，所述Fv片段允许其通过细菌宿主以呈现在丝状噬菌体上的抗体片段或可溶性分子产生。本发明也涉及表达所述嵌合和人源化的抗体的细胞系和产生来源于14F7的片段的细菌克隆。此外，本发明涉及用于治疗和/或定位以及确定恶性乳腺和黑素瘤肿瘤及其转移和复发的药物组合物，其特征在于包含本发明的一种重组单克隆抗体或其片段以及适合于其应用的赋形剂。所述抗体或片段可结合用于定位和/或治疗恶性肿瘤的放射性同位素。最后本发明涉及使用所描述的重组抗体生产用于治疗和/或定位和鉴定恶性肿瘤的药物组合物。
下面涉及实施和使用本发明的详细说明书。1. PCR(聚合酶链式反应)合成和扩增14F7鼠科动物抗体的可变区的cDNA。通过在弗氏佐剂存在的情况下用疏水地缀合低密度脂蛋白的GM3 (NeuGc)神经节苷脂免疫Balb/c小鼠获得鼠科动物14F7抗体(EP0972782 ALCarr A等人，Hybridoma 19:3 =241-247, 2000) o根据厂商说明书使用TRIZOL提取方法(GIBCO BRL, NY)从IO6个产生14F7单克隆抗体(鼠科动物IgGl Mab)的杂交瘤细胞中获取RNA，所述14F7单克隆抗体识别NGcGM3神经节苷脂。根据厂商说明书通过使用成套试剂Access RT-PCR(Promega, USA)进行互补·DNA(cDNA)的合成以及VH和VL可变区的扩增。简短地说，在25皮摩尔dT寡核苷酸和对应于各可变区VH和VL的末端的寡核苷酸存在的情况下从5 y g RNA进行反应，所述dT寡核苷酸设计用来与RNA的多聚A尾巴杂交。在60°C下温育10分钟，然后加入混合物，所述混合物包含反应缓冲液中的0. 2mM各脱氧核糖核苷酸(dNTPs)、ImM MgSO4,5 u AMV-逆转录酶和5 u DNA聚合酶，总体积50 ill。将所述样品在48°C温育45分钟，94 °C进行2分钟，然后进行40个PCR循环94°C (30秒)，60。。(I分钟)，68°C (2分钟)，和最终在68°C下温育7分钟。2.嵌合基因的构建和扩增的cDNA的测序。 用限制性内切酶Eco RV-Nhe I (针对VH)和Eco RV-Sal I (针对VK)降解VH和VK的PCR产物，并克隆入各自的表达载体(Coloma MJ等人,J Immunol Methods 152:89-104,1992)。将VH区克隆入已包含人IgGl恒定区和抗L-组氨醇的选择标记基因的PAH4604载体。将VK区克隆入携带抗micophenolic acid的基因和人k恒定区的PAG4622载体。所得的基因构建体分别称为14F7VH-PAH4604和14F7VK-PAG4622。根据厂商描述的方案使用试剂盒T7 DNA Polymerase (Amershan-Pharmacia)通过双脱氧核苷酸方法(Sanger F等人，PNASUSA 74 :5463-5470,1979)对两个构建体进行测序。3.嵌合抗体的表达用酶Pvu I 线性化的 10 ii g 14F7VH-PAH4604 和 10 u gl4F7VK_PAG4622 经电穿孔导入NSO细胞中。用乙醇沉淀DNAs，混合并溶解在50 ii L PBS (磷酸缓冲盐溶液)中。当大约IO7个细胞长至半汇合时通过离心收集细胞。然后在电穿孔杯中将所述细胞与DNA —起重新悬浮于0. 5mL的PBS。在冰浴10分钟后，使所述细胞接受200V和960F的脉冲，并保持在冰上10分钟。将所述细胞培养在96孔板中的Modified Dulbecco (DMEM-F12)选择培养基中，所述培养基含有10%胎牛血清(FCS)和IOmM L-组氨醇。加入选择培养基后10天可观察到转染的克隆。通过克隆上清液的ELISA确定嵌合免疫球蛋白的产生。为此目的，用IOOmM碳酸盐碳酸氢盐缓冲液(pH9. 8)中的山羊抗人IgG血清包被聚苯乙烯板(High binding,Costar)，4°C过夜。然后用PBS-Tween(磷酸缓冲盐溶液，0. 5% Tween-20, pH7. 5)洗板，力口入在PBS-Tween-FCS中稀释的培养上清液样品并在37°C温育I小时。再用PBS-Tween洗板，然后用缀合过氧化物酶(Jackson)的山羊抗人k链血清在37°C温育I小时。然后以相同的方式洗板并用PH 4. 2包含底物0-fenilendiamine的柠檬酸盐-磷酸缓冲液温育。15分钟后在492nm测量吸光率。通过使用NGcGM3和NacGM3神经节苷脂进行竞争ELISA来确定嵌合抗体识别抗原的能力。简短地说，用50 ii L甲醇中的4 ii g/mL NGcGM3或NAcGM3的溶液包被聚苯乙烯板(PolysorpjNunc)并在 37°C下温育 I 小时。然后用 200 y L I % 的 Tris-HCl (pH7. 8-8. 0)缓冲液中的牛血清白蛋白溶液(BSA)在37°C下封闭板I小时。用PBS洗板3次后，在lmg/mL生物素化鼠科动物14F7抗体存在的情况下以2 u g/mL-0. 01 u g/mL之间的浓度范围加入在
I% Tris-HCl-BSA中稀释的样品，37°C温育2小时。在用PBS洗板之后，在37°C下用链霉抗生物素-过氧化物酶缀合物(Jackson)对反应显色I小时。在492nm测量吸光率。4.通过T表位的人源化来构建人源化的Ab 147FhTT表位的预测用AMPHI 程序(Margalit H 等人，J Immunol 138 =2213-2229,1987)分析 14F7 可变结构域的序列，所述程序允许鉴定具有与T细胞免疫原性相关的两亲性螺旋结构的7或11个氨基酸的片段。在这种情况下这些算法预测涉及鼠科动物14F7单克隆抗体的重链和 轻链可变区中的T表位呈递的片段。-与人免疫球蛋白的同源性分析将14F7的可变结构域的氨基酸序列与报道的人免疫球蛋白的可变区序列比较以鉴定与正被分析的鼠科动物分子具有最高同源性的人免疫球蛋白。可使用互联网上可获得的 SWISSPR0T 数据库通过 BLAST 程序(Altschul S F 等人，Nucleic Acids Res 25:3389-3402,1997)实现该目的。-免疫原性减小的分析所述方法的实质在于通过可能的T表位的断裂或人源化获得免疫原性减小，同时在FRs上特别是那些具有两亲性螺旋结构的片段上具有最少突变(排除那些参与抗原识别位点的三维结构的位点)。根据所述方法将鼠科动物免疫球蛋白的VH和VL可变区的序列与最高同源性的人的免疫球蛋白的进行比较并且只在FRs区内的两亲性区域中鉴定鼠科动物和人序列之间不同的残基(Kabat E, Sequencesof proteins of immunological interest, FifthEdition,NationalInstitute of Health, 1991)。这些“鼠科动物”残基可以与发现于人序列的相同位置上的残基互换。出现在FRs位置上负责规范结构的残基、出现在Vernier区域的残基或参与VH-VL界面相互作用的残基不能被突变，因为其可以影响抗体可变结构域的三维结构因而影响与抗原的结合。通过可变区域分子建模可获得额外的涉及替换对三级结构的影响的信息。由于在突变元件的分析中考虑例如在两亲性螺旋中存在脯氨酸残基或这样的事实某些鼠科动物残基不出现在最高同源性的人序列中的相同位置上但经常出现在其它的人免疫球蛋白中，因此可能获得包含最多突变的版本，即，所有不同于人序列的鼠科动物残基发生突变，但也可获得具有不同突变组合的其它版本。在鉴定鼠14F7序列中可能的T表位和鉴定这些片段内的不同于人的残基后，可通过常规的定向诱变技术进行替换。-人源化14F7hT抗体在NSO细胞内的克隆和表达。在通过前述方法获得对应于14F7hT抗体的VH和VL区的基因构建体后，将其克隆入各自的与上述在嵌合抗体构建情况下相似的表达载体中，获得如下基因构建体14F7hTVK-PAG4622和14F7hTVH_PAH4604。在与描述的用于嵌合抗体的完全相同的条件下将这些基因转染NSO细胞。同样通过ELISA检测产生所述人源化抗体的克隆。使用NGcGM3和NAcGM3神经节苷脂通过竞争性ELISA确定所述人源化抗体对抗原的特异性识别的能力。所述方法与描述用于嵌合抗体的方法一致。5.基于丝状噬菌体的来自14F7杂交瘤的抗体片段文库的构建。从14F7杂交瘤细胞中分离信使RNA，合成互补DNA，分别使用两套设计用来与广谱的鼠科动物可变区杂交的寡核苷酸来分别扩增对应于重链和轻链的可变区的序列。纯化各扩增的重链可变区，用合适的酶降解并连接入预先用相同酶降解的噬菌体PHG-1m载体(设计用来将单链抗体呈现在丝状噬菌体表面)。纯化结合反应的产物并通过电穿孔将其导入TGl大肠杆菌(E. coli)株系的细菌中。经转化的细胞构成了有限多样性(其所有都来源于14F7杂交瘤)的重链可变区半文库。纯化对应于该半文库的DNA并且分别连接至轻链可变区(预先纯化和用合适的酶降解)集合体中。最后通过电穿孔将其基因构建体导入TGl株系细菌中，形成不同种类的独立文库。其中一个是用也获自14F7杂交瘤的轻链可变区构建 的有限多样性的迷你文库。也获得了链交换文库，其中来自杂交瘤的重链可变区与多种获自鼠科动物和人淋巴细胞的轻链可变区集合体组合。6.产生抗N-乙醇酰GM3的抗体片段的克隆的分离和表征。随机挑取各文库的克隆，通过使用辅助噬菌体M13 K07从其中产生噬菌体。通过固相免疫酶检验(ELISA)直接分析携带所述抗体片段的噬菌体对N-乙醇酰GM3的识别。因此产生功能性片段的克隆被定位。产生携有抗体片段(来自形成各文库的转化细菌的总混合物)的噬菌体以获得富含功能性抗体片段的制备物并考察文库的多样性。将获得的噬菌体混合物与结合在固体表面的抗原N-乙醇酰GM3接触，携带具有结合能力的抗体片段的噬菌体被保留而其余被充分的洗涤除去。通过改变PH洗脱所述结合噬菌体和繁殖所述结合噬菌体以获得新的噬菌体混合物，所述混合物用作针对抗原进行新一轮选择的起始材料。在各轮选择后，分析呈现在来自集落的噬菌体上的抗体片段的识别功能。因此鉴定了稀释在起始文库中的产生功能性片段的另外的克隆。由所述克隆产生的抗体片段的表征包括通过ELISA分析抗成组的相关神经节苷脂的特异性、通过免疫组织化学进行的肿瘤识别研究、估计其在噬菌体外作为可溶性功能性抗体片段产生的能力以及其可变区的完全测序。
实施例在下列的实施例中，除非特别指出，使用的所有限制性酶或修饰以及试剂和材料获自商业来源。实施例1.获取14F7嵌合单克隆抗体通过使用具有限制性位点Eco RV-Nhe I (针对VH)和Eco RV-SalI (针对VK)的特异性寡核苷酸，用Vent聚合酶进行PCR以合成和扩增鼠科动物的VH和VK可变区cDNA。寡核苷酸引物如下对于VH 寡核苷酸I (在信号肽处杂交):5’ ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg ate ttt ctc ttcctg 3’寡核苷酸2 (在JHl处杂交):
5， ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3，对于VK 寡核苷酸I (在信号肽处杂交):5，ggg gatatc cacc atg gt (at) t (tc) c (ta) ca cct cag (at) t (ac) ctt gga ctt3，寡核苷酸2 (在VLJ5处杂交):5’ age gtcgac tta cgt ttc age tcc age ttg gtc cc 3’用限制性内切酶Eco RV-Nhe I (针对VH)和Eco RV-Sal I (针对VK)降解VH和VK的PCR产物，并克隆入其各自的分别对应于VH和VK的表达载体PAH4604和PAG4622中。这些载体用于在哺乳动物细胞中表达免疫球蛋白，由Sherie Morrison (UCLA, California,USA)提供。载体PAH4604包含人IgGl恒定区PAG4622包含人k恒定区(Coloma J等人，J Immunol Methods 152 :89_104，1992)。在14F7的VH和VK区被克隆入前面的载体中后，产生了构建体 14F7VH-PAH4604 和 14F7VK-PAG4622。根据厂商描述的实验方案使用17 DNA Polymerase测序试剂盒(Amershan-Pharmacia)通过双脱氧核苷酸方法(Sanger F 等人，DNAsequencing withchain-terminating inhibitors. PNAS USA1979 ；74 :5463-5470)对 12 个独立的克隆进行测序。根据 Kabat 分类(Kabat E, Sequences of proteins of inmunological interest,Fifth Edition, National Institute of Health, 1991), VH 和 VK 序列分别与 IIB 和 V 亚型高度相关(
图1A和B)。用Pvu I 酶线性化的 10 ii g 14F7VH-PAH4604 和 10 u gl4F7VK_PAG4622 对NSO 细胞进行电穿孔。用乙醇沉淀DNAs，混合和溶解在50 ii L PBS中。通过离心收集培养至半汇合的大约IO7个细胞并在电穿孔杯中与DNA —起重新悬浮于0. 5mL PBS中。在冰浴10分钟后，使所述细胞接受200V和960F的脉冲，然后冰浴10分钟。将所述细胞培养在96孔板的含有10% FCS和IOmM L-组氨醇的Dulbecco Modified(DMEM-F12)选择培养基中。在加入选择培养基10天后观察到转染的克隆。使用克隆的上清液通过ELISA确定嵌合免疫球蛋白的产生。为此目的,用IOOmM碳酸盐碳酸氢盐缓冲液(pH9. 8)中的山羊抗人IgG血清(Sigma)包被聚苯乙烯板(High binding, Co star)并在4°C过夜。然后用PBS-Tween (磷酸缓冲盐 溶液，0. 5% Tween-20, pH 7. 5)洗板，加入在PBS-Tween-FCS中稀释的培养上清液样品并在37°C温育I小时。然后再用PBS-Tween洗板，然后用缀合过氧化物酶的山羊抗人k链血清(Jackson)在37°C温育I小时。之后以相同的方法洗板并用含有底物o_fenilendiamine的柠檬酸盐磷酸缓冲溶液(pH 4.2)进行温育。15分钟后在492nm测量吸光率。实施例2. 14F7Q抗体对NGcGM3和NAcGM3的反应性。通过竞争ELISA确定14F7嵌合抗体(Ab)的反应性。图2显示与鼠科动物14F7比较的嵌合14F7对包被GM3 N-乙醇酰神经节苷脂的聚苯乙烯板(Polysorp, Nunc)的识别特异性。两种Abs都显示以相似的浓度达到鼠科动物生物素化的14F7 Ab对抗原识别的50%的抑制。然而当用N-乙酰化的GM3变体包被板时，对任何一个所述抗体都没有观察到免疫反应性。鼠科动物C5 Mab用作非相关Ab。实施例3.获得不同的人源化抗体版本。将14F7 VH和VK序列与人序列数据库进行比较以获得对VH和VK区(图1A和B)具有最高同源性的人14F7抗体序列。此外，确定两个序列中的两亲性区域或潜在的T表位。然后按照T表位人源化的方法确定将鼠科动物VH和VK序列转换成人序列所需的突变。我们下面涉及可以进行的最大可能的突变。在VH区的情况下，在位点5、9、11、12、18、19、20、38、40、42和48上引入突变，其中氨基酸Q，N，L，A，M，K，M，K，R，D和I分别被V，A，V，V，V，R，V，R，A，G和V取代。通过重叠PCR 产物(Kamman M 等人，Nucleic Acids Research 17 :5404-5410,1989)进行这些突变，方法为在第一轮PCRs中使用寡核苷酸I和2及3和4，然后所得PCR产物在另一轮PCR中重叠并只使用寡核苷酸2和4进行PCR。所使用的寡核苷酸序列显示如下用于重链的5、9、11和12突变的寡 核苷酸寡核昔酸1:5' gtc cag ctt gtg cag tct ggg get gaa gtg gtaaaa cct ggg
O /寡核苷酸2 :5’ ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3’寡核音酸 3:5' ccc agg ttt tac cac ttc age ccc aga ctg cacaag ctg gac
O /寡核音酸 4:5’ ggg gat ate cacc atg gaa agg cac tgg ate tttctc ttc ctg
O y在对前面的突变进行测序和鉴定后，在携带其的DNA的18、19和20位点上引入突变以分别用氨基酸V、R、V取代M、K、M0下面显示用于所述突变的寡核苷酸I和2及3和4。如前面所述进行PCR产物的重叠。用于重链的18、19和20突变的寡核苷酸寡核苷酸1:5' ggg gcc tea gtg agg gtg tcc tgc agg 3'寡核苷酸2 :5’ ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3’寡核苷酸3# cct gca gga cac cct cac tga ggc ccc 3!寡核音酸4:5，ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg ate tttctc ttc ctg 3，同样在对前面突变进行测序和鉴定后，在携带其的DNAs的38、40和42位点上引入突变R、A、G以分别替代氨基酸K、R、D。下面显示用于这些突变的寡核苷酸I和2及3和4。如前面所述进行PCR产物的重叠。用于重链的38、40和42突变的寡核苷酸寡核苷酸1:5' cac tgg tta aga cag gca cctggc cag ggt ctg3!寡核苷酸2 :5’ ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3’寡核苷酸3:5' cag acc ctg gcc agg tgc ctg tct taa cca gtg3!寡核音酸 4:5’ ggg gat ate cacc atg gaa agg cac tgg ate tttctc ttc ctg
O y最后在通过测序鉴定前面的突变后，在携带其的DNAs的位点48上引入突变以氨基酸V替代I。下面显示用于该突变的寡核苷酸I和2及3和4。如前面所述进行PCR产
物的重叠。用于重链的48突变的寡核苷酸
寡核苷酸1:5’ ctggaa tgg gtt gga tac att 3,寡核苷酸2:5’ ggggctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3,寡核苷酸3 :5，aatgta tcc aac cca ttc cag 3，寡核音酸 4:5’ ggggat ate cacc atg gaa agg cac tgg ate tttctc ttc ctg
O y通过测序鉴定所有这些突变。获得的基因构建体命名为14F7hTVH。在重链的情况下，在VH14F7和最相似的人抗体之间有不同的氨基酸没有进行取代，因为这些取代涉及Vernier区的氨基酸或这些取代是抗原识别中关键的位置。
对于轻链，在位置39、40、41、42和58上进行突变，分别用K、P、G、Q和V取代R、T、H、E、I。以与重链中相同的方式引入突变。下面描述所使用的寡核苷酸序列。用于轻链的39、40、41和42突变的寡核苷酸寡核苷酸1:5' tat caa caa aaa cca ggt cag tct cca agg 3!寡核苷酸2 :5，age gtcgac tta cgt ttc age tcc age ttg gtccc 3，寡核苷酸3 :5' cct tgg aga ctg acc tgg ttt ttg ttg ata 3'寡核苷酸4 :5，ggg gatatc cacc atg gt (at) t (tc) c (ta) cacct cag (at) t (ac) cttgga ctt 3’通过测序鉴定前面的突变后，在携带其的DNAs的位点58上引入突变以氨基酸V取代I。下面显示用于该突变的寡核苷酸I和2及3和4。如前面所述进行PCR产物的重叠。用于轻链的58突变的寡核苷酸寡核苷酸1:5，att tct ggg gtc ccc tcc agg 3，寡核音酸2 :5，age gtcgac tta cgt ttc age tcc age ttg gtccc 3，寡核苷酸3 :5，cct gga ggg gac ccc aga aat 3’寡核苷酸4:5，ggg gatatc cacc atg gt (at) t (tc) c (ta) ca cctcag (at) t (ac) cttgga ctt 3’在进行突变后通过测序确定之。所得的基因构建体称为14F7hTVK。将人源化的VK和VH区克隆入载体PAG4622和PAH4604，分别产生构建体14F7hTVH-PAH4604和14F7hTVK_PAG4622。分别用10 y g预先用Pvu I降解而线性化的载体14F7hTVH-PAH4604和14F7hTVK_PAG4622对NSO细胞进行电穿孔，所述各载体携带人源化的可变区。表达14F7hT人源化抗体的克隆的电穿孔方法和检测方法与所描述的用于嵌合抗体的方法相同。实施例4 :在体内血管形成模型中14F7 Ab对肿瘤生长减少的影响。将与作为血管发生诱导物的基质凝胶混合的黑素瘤B16肿瘤细胞系用作体内血管发生的模型。在C57/BL6雄性小鼠的中腹线处皮下移植带有基质凝胶的肿瘤系(B16)，测量肿瘤血管形成过程的诱导。为实现该目的，将黑素瘤B16细胞与0. 5mL基质凝胶和64个单位/mL肝素混合，单独地使用作为对照组或与其它抗体组合，通过皮下注射至动物腹部区域进行施用。接种15天后，杀死动物并将凝胶珠状物连同真皮和表皮残余取出，并宏观观察肿瘤的大小。图3显示用14F7处理的小鼠肿瘤的肿瘤团大小显著减小。为区分新血管，对用苏木精/曙红染色和用抗PECAM Mab (内皮标记)免疫染色的凝胶进行组织病理学分析。图4A和B显示与未处理动物的肿瘤切片相比，在用14F7处理的动物组织切片中观察到血管数目减少。实施例5 从14F7杂交瘤构建丝状噬菌体的抗体片段文库。用 TriPure Isolation Reagent(Boehringer Mannheim, Germany)从 5.OxlO614F7杂交瘤细胞中分离信使RNA并用Pro-STAR FirstStrand RT-PCR reagent试剂盒(Stratagene, USA)合成互补DNA。按照下列条件进行26个循环的聚合酶链式反应以扩增来自杂交瘤的重链和轻链可变区94°C进行50秒、55°C进行I分钟、72°C进行I分钟。为进行扩增，使用了所有可能的成套简并寡核苷酸组合(设计用来与广泛的小鼠可变区杂交)，所述寡核苷酸显示于下列表中
用于扩增VH和VL的寡核苷酸。在寡核苷酸序列中，简并位置出现在括号内。限制性位点的序列用下划线标示。5，VH Apa LI5，…ttc tat tct cac agt gca cag(gc)ag gt (gt)cag ct(gt)ac(ag)cag tc (at)gga 3，5，...ttc tat tct cac agt gca cag gc (ag)gt (ct)ca (ag)ctg cag cag ct (ct)ggg gc 3’5， ...ttc tat tct cac agt gca cag ga(ag)gtg aag ct(gt)(gc)t(gc)gag tctgg (ag)gga 3，3’ VH Sfi I5，... ga acc agt act cca rrc ctg aRR rrc crc aga gac agt gac cag agt ccc 3，5，... ga acc agt act cca rrc ctg aRR rrc cm gga gac ggt gac tga ggt tcc 3，5，...ga acc agt act cca rrc ctR aRR rrc CRa gga gac(gt)gt ga(gc)(ca)gtgga(gc)cc. . . 3'5，Vl Sal I. . . gta ctc caR tcR acR aca ttg tg (ca) tg (at) t (ac) c agt ctc c. . .. . . gta ctc caR tcR acR ata tcc aga tga c (ac) c a (ga) a ct (ac) c. . .5，. . . gta ctc cag_tcg_ac (eg) aaa ttg t (tg) c tea ccc agt ctc c. . . 3，3，Vl Not I5’ .. .aag gaa aaa aRC rrc crc ttt (tc)a (tg) (tc)tc cag ctt ggt. . . 3f5， aag gaa aaa aRC rrc crc ttt (tg)a (tg)ctc caa ctt gt (gt). . . 3f纯化扩增的重链可变区并随后用限制性酶Sfi I和ApaL I进行降解。纯化降解产物并与 phagomidium 载体 pHG_lm(Heber Biotec S. A.，Cuba)(图 5)的 DNA 连接。通过电穿孔用所得的基因构建体转化大肠杆菌株系TG1。转化的细菌群体组成2. 3X104个成员的中等大小的重链可变区半文库，所述重链可变区来源于14F7杂交瘤。纯化半文库的质粒DNA,随后用Not I和Sal I酶降解。将该DNA分别与4个预先用相同酶降解的轻链可变区集合体连接。用这些新的基因构建体转化TGl株系细菌从而获得4个独立的文库。其中一个是包含来源于14F7杂交瘤的重链和轻链可变区的大小为1. 6xl06个体的有限多样性迷你文库。其它三个是整合多种早先获自小鼠(K同种型)和人(K和X同种型)的轻链可变区集合体的链交换文库并且其大小分别为1. OxlO7U. 4xl06和1. 2xl06个成员。实施例6 :产生抗N-乙醇酰GM3的抗体片段的克隆的分离。根据前面(Marks,J. D.等人，J. Mol. Biol. 222，581-597. 1991)描述的方法在微量滴定板的小孔中产生携带抗体片段的噬菌体，所述噬菌体来自各文库随机挑取的92个克隆。通过在以I U g/ml N-乙醇酰GM3和N-乙酰GM3包被的聚氯乙烯板(Costar，USA)上进行ELISA来估计其特异性。用缀合过氧化物酶(Amersham, Sweden)的抗M13单克隆抗体检测结合的噬菌体。除了表征随机挑选的单个克隆，还进行从噬菌体混合物中选择具有结合N-乙醇酰GM3的能力的噬菌体，所述噬菌体混合物由形成各文库的细胞群产生。为了该目的，使用辅助噬菌体M13 K07产生噬菌体，根据提到的方法通过用聚乙二醇沉淀来纯化其并将其与结合在塑料表面(Inmuno tubes, Nunc, Denmark)的N-乙醇酰GM3接触。充分洗·涤管子并在lOOmmol/1三乙胺存在的情况下洗脱所述噬菌体。中和洗脱物并用于感染大肠杆菌株系TGl的细菌。从感染的细菌群中产生携带抗体的噬菌体并再次纯化噬菌体，将纯化的噬菌体用作起始材料在与所述条件相同的条件下进行新一轮筛选。经过4轮筛选后，随机挑选92个产生自各文库的噬菌体感染的细菌克隆和以与所述用于对从文库中随机挑选的克隆进行估计的方法相似的方法进行N-乙醇酰GM3识别。根据对产生克隆的文库的克隆(根据携带识别N-乙醇酰GM3的抗体片段的噬菌体分离的)的直接分析，发现所述克隆在三个链交换文库中频率不同。在专门由来源于14F7杂交瘤的可变区形成的迷你文库中没有阳性克隆。多轮选择后，从链交换文库中分离出另外的克隆，并且在原始序列的迷你文库中没有发现一个所述克隆。下表显示产生识别N-乙醇酰GM3的抗体片段的克隆的数量和其出现在经分析来自各文库的克隆总数中的频率。只有一个克隆产生呈现与N-乙酰GM3交叉反应性的噬菌体。
文犀？目性克隆频率V阳性克隆频率
______(直接筛选)(4轮筛选)
杂交瘤14F7文库0/920/92'
鼠科动物K轻链的交换31/92 (33. 7 ) 52/92 (56.52 )
人 K 糕链的交换2/92 17 8/92 (17, 39%)
人入轻链的交换4/92 (4. 35%)12/92 (13. 04%)一个克隆具有与N-乙酰GM3的交叉反应。实施例7.来源于14F7的识别N-乙醇酰GM3的抗体片段的表征。通过使用与pHG-lm载体的区域杂交的寡核苷酸用自动测序仪ALFExpressII (Pharmacia, Sweden)对11个抗体片段的可变区进行完全测序,所述pHG_lm载体的区域位于编码插入抗体片段的序列的5’和3’端的侧翼。可以确定所有重链可变区的序列对应于一个报道的14F7的重链可变区，仅在构架区I和构架区4区域出现变化，所述变化可假定是由PCR中简并寡核苷酸的使用引入的。包含3个CDRs的序列没有变化。相反地，所有
11个克隆的轻链可变区序列与14F7的不同并且被分入5个不同序列组，2个鼠科动物来源组和I个人来源(K同种型)组和2个其它的为\同种型的人来源组。各序列组挑选一个代表性克隆进行随后的表征。下表表示所选择的克隆的轻链可变区之间在其来源的一致性、其来源和同种型以及亚组分类(根据Kabat分类)方面的差异。
权利要求
1.一种来源于鼠科动物14F7单克隆抗体的并保存14F7的识别特异性的Fv单链类型片段，其中所述鼠科动物14F7单克隆抗体由保藏号为ECACC 98101901的杂交瘤产生，所述片段含有如下所示的重链的高可变区(CDRs)和FRs区的序列 重链CDRl =SYffIHCDR2 YIDPATAYTESNQKFKDCDR3 ESPRLRRGIYYYAMDYFRl QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFTFR2 =WLKQRPDQGLEffIGFR3 KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCARFR4 WGQGTTVTVSSo
2.权利要求1的片段，其进一步含有具有如下序列的VL结构域Frl DIVMFQSPASLAVSLGQRATISCCDRl RASQSVSSSSYSYMHFr2 WYQQKPGQPPKLLIKCDR2 YASNLESFr3 GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCCDR3 QHSRDVPLTFFr4 GAGTKLEIK。
3.权利要求1的片段，其进一步含有具有如下序列的VL结构域Frl DIQMTQTPSSLSASLGDRVTISCCDRl RASQDISNYLNFr2 WYQQKPDGTVKLLIVCDR2 YTSRLHSFr3 GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCCDR3 QQGNTLPPTFFr4GAGTKLELK。
4.权利要求1的片段，其进一步含有具有如下序列的VL结构域FrlDIQMTQTPSSLSASVGDRVTITCCDRlRASQSISSFLNFr2WYQQKPGKAPKLLIYCDR2AASNLQSFr3GVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFAAYYCCDR3QQGYTTPLTFFr4GQGTKLELKo
5.权利要求1的片段，其进一步含有具有如下序列的VL结构域FrlQSVVTQPPSASGGPGQSLTISCCDRlTGTSSDVGGYNHVSFr2WYQQHPGKAPKLMIYCDR2DVSKRPSFr3GVPHRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEAVYYCCDR3SSYAGSNNLVFFr4GGGTKVTVLo
6.权利要求1的片段，其进一步含有具有如下序列的VL结构域FrlSSELTQDPAVSVALGQTVRITCCDRlQGDSLRSYYASFr2WYQQKPGQAPVLVIY
全文摘要
本发明主要涉及通过基因工程生产免疫原性较少的免疫球蛋白，更具体地涉及识别抗原的单克隆抗体，所述抗原包括N-乙醇酰GM3神经节苷脂而不包括其它的N-乙醇酰或N-乙酰类型的神经节苷脂或硫酸化糖脂。更特别地本发明涉及编码重组单克隆抗体的肽序列或其衍生片段以及含有所述重组抗体或其片段的药物组合物和其在乳腺癌和黑素瘤的诊断和治疗上的用途，所述重组单克隆抗体抗N-乙醇酰GM3神经节苷脂。
文档编号C07K16/30GK103012586SQ20121051726
公开日2013年4月3日 申请日期2004年4月22日 优先权日2003年4月23日
发明者L·T·罗奎纳瓦罗, C·M·马提奥德阿克斯塔德尔里奥, M·罗德里戈兹冈萨雷兹, G·罗扎斯多兰特斯, A·塔拉维拉佩雷兹, E·莫利诺弗里亚斯 申请人:分子免疫中心