专利名称：一种水稻MYB转录因子蛋白基因OsMyb1及其应用的制作方法
—种水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybI及其应用技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl及其应用。
背景技术：
MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。MYB结构域是一个含有 52个氨基酸的DNA结合域。植物中的MYB类转录因子以在其N端含有一段约52个氨基酸组成的MYB结构域为共同特征。玉米的Clorless I (C I)是植物中第一个被分离鉴定的MYB转录因子(Paz-Areset et al.，1987Paz_Ares J，Ghosal Dj Wienand U (1987) The regulatory cl locus of Zea mays encodes a protein with homology to myb proto-oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators. EMBO J. 6 (12) : 3553-3558)，随后，拟南芥(Romero et al.，1998 Romero I，Fuertes A，Benito MJ，Malpica JMj Leyva A,Paz-Ares J. More than 80 R2R3-MYB regulatory genes in the genome of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal，1998，14 (3) : 273-284)、金鱼草(Waites et al. ,1998 Waites Rj Selvadurai HR，Oliver IR(1998)The PHANTASTICA gene encodes a MYB transcription factor involved in growth and dorsoventrality of lateral organs in antirrhinum. Cell，93 (5) : 779-789)、棉花(Loguerico et al. , I 999Loguerico LL，Zhang JQ，Wilkins TA(1999)Differential regulation of six novel MYB—domain genes defines two distinct expression patterns in allotetrapIoid cotton(Gossypium hirsutum L.). Mol Gen Genet. 261:660-67 1),苹果(Takos et al.，2006 Takos AM，JaffeFWj Jacob SR，Bogs J，Robinson SPj Walker AR (2006) Light-1nduced expression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples. Plant Physiol. 142:1216-1232)等植物中也分离鉴定出功能各异的MYB蛋白。对MYB类转录因子的功能研究结果表明，MYB蛋白主要作用有参与植物次级代谢过程，调节细胞形态，参与植物对生物和非生物胁迫的应答，在植物对激素反应中起作用， 调节植物的生物钟，在细胞循环和增殖中起作用等(刘蕾，2008刘蕾，杜海，唐晓凤，吴燕民，黄玉碧，唐益雄(2008)MYB转录因子在植物抗逆胁迫中的作用及其分子机理.遗传，30 (10): 1265-1271)。Vailleau 等(2002 Vailleau Fj Daniel X，Tronchet M(2002) A R2R3-MYB gene，AtMYB30， acts as a positive regulator of the hypersensitive cell death program in plants in response to pathogen attack. PNAS 99 (15):10179-10184) 发现在AtMYB30过量表达的拟南芥与病原细菌互作过程中表现出抗病反应，抑制表达 AtMYB30的拟南芥对几种病原细菌的抗性下降；Van等(2008 Van SC, Van S (2008)Plant immune responses triggered by beneficial microbes[J]. Current Opinion in Plant Biology, 11:443-448)通过基因敲除的方法构建MYB72缺陷型拟南芥，对假单胞菌、寄生霜霉、链格孢菌、灰霉菌的抵抗能力降低，说明拟南芥MYB72在植物抗病方面起作用；Fekete 等(2009 Fekete C，Fung RWj Szabo Z (2009)Up-regulated transcripts in a compatiblepowdery mildew-grapevine interaction. Plant Physiol Biochem. 47:732-738)通过构建白粉病菌诱导葡萄藤的SSH文库，发现MYB转录因子及一些抗病相关基因的表达，这说明 MYB可能参与葡萄藤对白粉病的防御过程。目前，越来越多的研究结果表明植物中MYB类转录因子在抗病性方面的功能。发明内容
本发明的目的在于公开水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl的抗病性基因工程应用，该基因来自水稻，可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，进行植物品种改良。
本发明的目的可通过如下技术方案实现
水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl编码的水稻MYB转录因子蛋白， 其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
含有本发明所述的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl的表达载体。
所述的表达载体优选将所述的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl插入双元表达载体pCAMBIA1300S的Kpn I酶切位点所得。
水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl的基因工程应用。
优选本发明所述的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。
水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl的基因工程应用，优选包括如下步骤
I)总RNA的提取选用水稻抗稻瘟病菌品种“黑壳子粳”(太湖流域粳稻地方品种)， 待水稻幼苗长至3-4叶期，用稻瘟病菌孢子(5X IO4Hir1)接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于_80°C冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1. 5mL EP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量；
2)水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl的克隆分析黑壳子粳接种稻瘟病前后的基因芯片表达数据发现芯片探针OsAffx. 21972.1. Sl_at受到稻瘟病的诱导(未发表的数据)。 以该探针序列搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到858bp水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl的全长序列，并设计两端引物
Pl:5-ATGGAGATGGTGCTG-3 (SEQ ID NO. 3),
P2:5-TTATTGCATCTTCCATATG-3 (SEQ ID NO. 4)。
将步骤I)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶进行PCR扩增，PCR程序如下94°C预变性5分钟，94°C变性45s，56°C复性lmin，72°C延伸1.5min, 35个循环后，72°C延伸5min，最后Tag酶72°C保温IOmin末端加A后克隆至pGEM_T 载体，委托上海英骏公司测序获得水稻Myb转录因子蛋白基因OsMybl的cDNA序列SEQ ID NO.1 ；
3)植物表达载体的构建根据水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl的cDNA序列SEQ ID NO. 1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上均引入限制性内切酶位点Kpn I，P3和P4引物序列为
P3 5-GGTACCATGGAGATGGTGCTG-3 (SEQ ID NO. 5),
P45-GGTACCTTATTGCATCTTCCATATG-3 (SEQ ID NO. 6),
以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsMybl的cDNA克隆至中间载体pGEM-Τ，利用引入的限制性内切酶位点Kpn I进一步将OsMybl克隆到双元表达载体pCAMBIA1300S上，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确；
4)转基因植株的获得将步骤3)获得的表达载体PCAMBIA1300S转入农杆菌，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及 RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价，将生长至3-4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。
有益效果
1、本发明公开了水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl及其所编码的蛋白质。水稻 MYB转录因子蛋白基因OsMybI为水稻中首次报道，基因芯片和mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种诱导，转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病菌的抗性。因此有望可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。
2、本发明的OsMybl基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。
3、对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价。将生长至3-4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的平均病级数为2. 8级，发病叶片平均病斑数目为6. 2个，而对照植株的平均病级数为 7级以及发病叶片平均病斑数目为21. 4个，结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。
4、利用本发明OsMybl基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括具·有抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如β -葡糖醛酸糖苷酶 GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
具体实施方式
实施例1
选用水稻品种“黑壳子粳”(为太湖流域粳稻地方品种，为抗稻瘟病菌品种)，待水稻幼苗长至3-4叶期后，用稻瘟病菌孢子进行接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻， 保存于_80°C冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1. 5mL EP管 (TRIzol Reagents,购自Invitrogen, USA),充分振荡后,抽提总RNA,电泳鉴定总RNA质量。
分析“黑壳子粳”接种稻瘟病前后的基因芯片表达数据发现芯片探针 OsAffx. 21972.1. Sl_at受到稻瘟病的诱导。以该探针序列搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到858bp水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl的全长序列，并设计两端引物
Pl:5，-ATGGAGATGGTGCTG-3，(SEQ ID NO. 3),
P2:5’-TTATTGCATCTTCCATATG-3’ (SEQ ID NO. 4)。
以总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板用高保真Pfu酶(购自Roche )进行PCR 扩增，PCR程序如下94°C预变性5分钟，94°C变性45s，56°C复性lmin，72°C延伸1. 5min， 35个循环后，72°C延伸5min，最后Tag酶(购自天根公司，北京)72°C保温IOmin末端加A 后克隆至pGEM-Τ载体(购自Promega)，委托上海英骏公司测序获得水稻转录因子蛋白基因 OsMybl 的 cDNA 序列。
分析上述获得的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl的cDNA序列SEQ ID NO.1及其编码蛋白SEQ ID NO. 2，存在保守结构域Myb结构域。
实施例2
用实施例1中设计的引物P1、P2进行半定量RT-PCR分析接种处理后水稻3_4叶期地上部幼苗的表达，结果表明，接种稻瘟病菌孢子4小时后OsMybl的表达增强，经灰度扫描分析，其mRNA表达量为接种处理前的30倍，表明OsMybl基因的表达与稻瘟病菌处理有关。
实验例3
根据实施例1得到的OsMybl的cDNA全长序列(见SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上均引入限制性内切酶位点Kpn I， P3和P4引物序列为
P3 :5’ -GGTACCATGGAGATGGTGCTG-3’ (SEQ ID NO. 5),
P4 :5’ -GGTACCTTATTGCATCTTCCATATG-3’ (SEQ ID NO. 6),
以实施例1中获得的扩增产物为模板，以P3和P4为引物，经PCR扩增后，将OsMybl 的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，利用引入的限制性内切酶位点Kpn I进一步将OsMybl克隆到双元表达载体PCAMBIA1300S上，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确，再将其转入农杆菌，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”(太湖流域粳稻地方品种)，转基因植株经PCR, Southern杂交以及RT-PCR验证为阳性。
将生长至3-4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，按照Mackill and Bonman (1992Mackill D and Bonman J(1992)Inheritance of blast resistance in near-1sogenic lines of rice. Phytopathology 82:746-749)的方法进行病害级别鉴定， 7天后调查植株的平均病级数为2. 8级，发病叶片平均病斑数目为6. 2个，而对照植株的平均病级数为7级以及发病叶片平均病斑数目为21. 4个，结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。
综上所述，本发明人提供的OsMybl基因是在水稻中分离的新基因，其功能与水稻抗病性相关，可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。可利用本发明OsMybl基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植 物。
权利要求
1.水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl，其特征在于该基因的cDNA序列如SEQID NO.1所示。
2.权利要求1所述的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl编码的水稻MYB转录因子蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.含有权利要求1所述的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是将所述的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl插入双元表达载体pCAMBIA1300S的Kpn I酶切位点所得。
5.水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl的基因工程应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于包括如下步骤 1)总RNA的提取 选用水稻抗稻瘟病品种“黑壳子粳”，待水稻幼苗长至3-4叶期，用稻瘟病菌孢子5X IO4Hir1接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于-80°C冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1. 5mL EP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量； 2)水稻MYB转录因子蛋白基因OsMybl的克隆 以拟南芥基因OsMybl序列为探针，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到858bp水稻Myb转录因子蛋白基因OsMybl的全长序列，并设计两端引物P1:SEQ ID NO. 3，P2:SEQ ID NO. 4，将步骤I)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶进行PCR扩增，PCR程序如下94°C预变性5分钟，94°C变性45s，56°C复性lmin，72°C延伸1.5min，35个循环后，72°C延伸5min，最后Tag酶72°C保温IOmin末端加A后克隆至pGEM-Τ载体，测序获得水稻Myb转录因子蛋白基因OsMybl的cDNA序列SEQ ID NO.1 ； 3)植物表达载体的构建 根据水稻Myb转录因子蛋白基因OsMybl的cDNA序列SEQ ID NO. 1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上都引入限制性内切酶位点Kpn I，P3和P4引物序列分别为SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6 ； 以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsMybl的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，利用引入的限制性内切酶位点Kpn I进一步将OsMybl克隆到双元表达载体PCAMBIA1300S，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确； 4)转基因植株的获得 将步骤3)获得的表达载体pCAMBIA1300S转入农杆菌，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，转基因植株经PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证为阳性。将生长至3_4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。
全文摘要
本发明公开了一种水稻MYB转录因子蛋白基因OsMyb1及其应用，属于生物技术领域。该基因的cDNA序列及其编码氨基酸序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本发明基因OsMyb1为水稻中抗稻瘟病相关的Myb类转录因子蛋白基因，基因芯片结果和mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种诱导。转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病的抗病性。因此，OsMyb1可作为目的基因导入植物，提高植物的抗病性。
文档编号C07K14/415GK102994517SQ201210562428
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者鲍永美, 张红生, 黄骥, 储瑞珍, 王建飞, 王州飞 申请人:南京农业大学