专利名称：防治仔猪大肠杆菌性腹泻的卵黄免疫球蛋白制备方法
技术领域：
本发明涉及卵黄免疫球蛋白的制备方法，具体地说是一种防治仔猪大肠杆菌性腹泻的卵黄免疫球蛋白制备方法。
背景技术：
仔猪腹泻是规模化养殖场新生仔猪和断奶仔猪的常见病，其发病急、传播快、死亡率高，给养猪业造成巨大的经济损失。据统计，40%的临床腹泻病例是由产肠毒素大肠杆菌感染引起。目前生产上多采用产肠毒素大肠杆菌多价苗免疫母猪，通过提高初乳的抗体水平达到预防仔猪腹泻的目的。然而母源抗体持续时间短，断奶后短期内将消失，无法保护仔猪的整个生长阶段。通过口服大肠杆菌高免血清也能够预防仔猪腹泻，但因其成本较高很难在实际生产中大规模推广应用。兽医临床上，卵黄免疫球蛋白已广泛用于鸡(传染性法氏囊、新城疫、鸡白痢等)、鸭(肝炎)、鹅(小鹅瘟)、犊牛(腹泻)、羔羊(轮状病毒腹泻)等疫病的紧急治疗和预防。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治仔猪大肠杆菌性腹泻的卵黄免疫球蛋白制备方法，由该方法获得的卵黄免疫球蛋白对 防治仔猪大肠杆菌性腹泻具有较好的疗效。为实现上述目的，本实用发明采用以下方案防治仔猪大肠杆菌性腹泻的卵黄免疫球蛋白制备方法，其特征在于包括以下步骤
I)、采集未经药物治疗的腹泻仔猪所携带的大肠杆菌；
2)、将获得的纯大肠杆菌接种于试管麦康凯琼脂斜面培养基上，菌种在3-5°C下保
存；
3)、将菌种接种于基础培养基，37°C下振荡培养24h后，制成菌悬液，加入O. 5%浓度的甲醛灭活；
4)、按体积比将7号白油与Span-80以93-95:5_7混合，然后加入占二者总体积1. 5-2. 5%的硬脂酸铝溶解混匀后，110-1201高温灭菌25-35 min获得油相，按体积比将灭活的菌悬液和Tween-80以94_98:3_5混合获得水相，将水相与油相按体积比以1:1混合，充分乳化后即为大肠杆菌油苗，分装，3-5°C下保存；
5)、用制备好的大肠杆菌油苗接种10只3周龄健康小鼠，每只肌肉注射O.5mL，观察10天均健康成活；
6)、选择健康成年产蛋鸡50只，分别在第1、7、15天胸肌注射大肠杆菌油苗，注射量分别为第一天O. 5mL/只、第7天1. Oml/只、第15天1. Oml/只；
7)、收集注射过大肠杆菌油苗的鸡所产蛋中的卵黄，用浓度为O.8-1. 0%的生理盐水稀释4. 5-5. 5倍，然后按重量比加入3-4%的PEG 6000混匀后过滤取上清，可得卵黄免疫球蛋白粗提物。
上述方案的步骤4)中，Span-80以94:6混合，硬脂酸铝占二者总体积的2%，菌悬液和Tween-80以96:4混合。上述方案的步骤7)中，卵黄用浓度为O. 9%的生理盐水稀释5倍，然后按重量比加入3. 5%的PEG 6000混匀后过滤取上清。卵黄免疫球蛋白能像初乳中的抗体一样通过小肠上皮进入机体，同时卵黄免疫球蛋白和抗原的亲和力远比哺乳动物抗体和同种抗原的亲和力强，因此，卵黄免疫球蛋白可以通过多种途径在仔猪被动免疫时发挥抗腹泻的作用。首先，它可与特异性菌毛抗原结合减少或阻断特异性菌毛与宿主肠上皮的结合，使产肠毒素性大肠杆菌不能在小肠定植，从而防止腹泻的发生。其次，抗特定病原菌的卵黄免疫球蛋白还可直接粘附于病原菌的细胞壁上，改变病原菌细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；第三，一部分抗特异病原的卵黄免疫球蛋白在肠道内被消化酶降解为结合片段，这些片段含有抗体的末端高度可变的小肽。这些小肽很容易被肠道吸收发挥防治腹泻的作用。本发明提供的卵黄免疫球蛋白制备方法工艺简单，生产成本低；所获得的卵黄免疫球蛋白性质均一、易提取，可有效避免非特异性免疫反应发生，且使用后无药物残留和耐药性。
具体实施例方式以下结合一实施例进一步说明本发明。本实施例提供的防治仔猪大肠杆菌性腹泻的卵黄免疫球蛋白制备方法具有以下步骤1.病料收集用消毒棉签采集未经药物治疗的腹泻仔猪粪便、小肠内容物、黏膜刮取物和病死猪肝脏、心脏、血液等病料`。2.大肠杆菌分离培养和鉴定确诊为纯大肠杆菌后，再接种于试管麦康凯琼脂斜面培养基上，菌种4°C保存备用。3.增菌培养将大肠杆菌接种于基础培养基，37°C振荡培养24h后，制成菌悬液，加入O. 5%浓度的甲醒灭活。基础培养基为常规的用于大肠杆菌的培养基。4.油苗的制备按体积比例将7号白油与Span-80按94:6比例混合，再加入总量2%的硬脂酸铝溶解混匀后，116°C高温灭菌30 min即为油相。按体积比将灭活的菌悬液和Tween-80以96:4的比例混合作为水相，将水相与油相按体积比以1:1混合，充分乳化后即为油乳剂灭活苗，分装，4°C保存备用。5.疫苗的安全性检验用制备好的灭活苗接种10只3周龄健康小鼠，每只肌肉注射O. 5mL,观察10天均健康成活。6.免疫程序选择健康成年产蛋鸡50只，分别在第1、7、15天胸肌注射大肠杆菌油苗，注射量分别为第一天O. 5mL/只、第7天1. Oml/只、第15天1. Oml/只。7.免疫球蛋白提取收集卵黄用O. 9%生理盐水稀释5倍，加入3. 5%的PEG 6000混匀后过滤取上清，可得卵黄免疫球蛋白粗提物。本发明提供的卵黄免疫球蛋的使用方法为1、防治仔猪腹泻，预防量口服，5 -1Oml/头/次，I次/日，连服3天。2、治疗仔猪腹泻，口服15 20mL/头/次，I次/日，连服3天。
以下结合疗效证据进一步说明本发明的使用效果。临床治疗试验在2010年3月至2012年8月期间，选择规模化猪场自然感染大肠杆菌典型病猪，随机分成2组，一组肌注治疗剂量氟苯尼考(20mg/kg BW)，1次/日，连续3天，另一组口服卵黄免疫球蛋白溶液，口服15 20mL/头/次，I次/日，连服3天。以上两组治疗效果如下表
腹泻仔猪治疗试验结果
权利要求
1.防治仔猪大肠杆菌性腹泻的卵黄免疫球蛋白制备方法，其特征在于包括以下步骤I)、采集未经药物治疗的腹泻仔猪所携带的大肠杆菌；2)、将获得的纯大肠杆菌接种于试管麦康凯琼脂斜面培养基上，菌种在3-5°C下保存；3)、将菌种接种于基础培养基，37°C下振荡培养24h后，制成菌悬液，加入O. 5%浓度的甲醛灭活；4 )、按体积比将7号白油与Span-80以93-95:5_7混合，然后加入占二者总体积1.5-2. 5%的硬脂酸铝溶解混匀后，110-120°C高温灭菌25-35 min获得油相，按体积比将灭活的菌悬液和Tween-80以94_98:3_5混合获得水相，将水相与油相按体积比以1:1混合，充分乳化后即为大肠杆菌油苗，分装，3-5°C下保存；5)、用制备好的大肠杆菌油苗接种10只3周龄健康小鼠，每只肌肉注射O.5mL，观察10天均健康成活；6)、选择健康成年产蛋鸡50只，分别在第1、7、15天胸肌注射大肠杆菌油苗，注射量分别为第一天O. 5mL/只、第7天1. Oml/只、第15天1. Oml/只；7)、收集注射过大肠杆菌油苗的鸡所产蛋中的卵黄，用浓度为O.8-1. 0%的生理盐水稀释4. 5-5. 5倍，然后按重量比加入3-4%的PEG 6000混匀后过滤取上清，可得卵黄免疫球蛋白粗提物。
2.根据权利要求1所述的防治仔猪大肠杆菌性腹泻的卵黄免疫球蛋白制备方法，其特征在于步骤4)中，Span-80以94:6混合，硬脂酸铝占二者总体积的2%，菌悬液和Tween-80 以 96:4 混合。
3.根据权利要求1所述的防治仔猪大肠杆菌性腹泻的卵黄免疫球蛋白制备方法，其特征在于步骤7)中，卵黄用浓度为O. 9%的生理盐水稀释5倍，然后按重量比加入3. 5%的PEG 6000混匀后过滤取上清。
全文摘要
防治仔猪大肠杆菌性腹泻的卵黄免疫球蛋白制备方法，包括以下步骤采集腹泻仔猪所携带的大肠杆菌；将纯大肠杆菌接种于试管麦康凯琼脂斜面培养基上；将菌种接种于基础培养基，制成菌悬液，加入甲醛灭活；将7号白油与Span-8O混合，然后加入硬脂酸铝溶解混匀后，高温灭菌获得油相，将菌悬液和Tween-80混合获得水相，将水相与油相混合，充分乳化后即为大肠杆菌油苗；用大肠杆菌油苗接种健康小鼠，观察10天均健康成活；选择健康成年产蛋鸡，在第1、7、15天注射大肠杆菌油苗；收集注射过大肠杆菌油苗的鸡所产蛋中的卵黄，用生理盐水稀释，加入PEG6000混匀后过滤取上清，可得卵黄免疫球蛋白粗提物。用本卵黄免疫球蛋白治疗仔猪腹泻与现有的治疗药物相比，治愈率较高、费用降低。
文档编号C07K16/12GK103030694SQ20121059063
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者周玉刚, 唐红, 许百年, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:蚌埠市畜牧兽医技术推广站