专利名称：一种从野生过山蕨里提取总黄酮的新型工艺方法
技术领域：
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种从大兴安岭野生过山蕨里提取黄酮的方法，特别是涉及一种利用酶法提取，高速逆流色谱分离纯化过山蕨总黄酮的新方法。
背景技术：
过山蕨，植株高达20厘米。根状茎短小，直立，先端密被小鳞片；鳞片披针形，黑褐色膜质，全缘。叶簇生；基生叶不育，较小，柄长1-3厘米，叶片长1-2厘米，宽5-8毫米，椭圆形，钝头，基部阔楔形，略下延于叶柄；能育叶较大，柄长1-5厘米叶片长10-15厘米，宽5-10毫米，披针形，全缘或略呈波状，基部楔形或圆楔形以狭翅下延于叶柄，先端渐尖，且延伸成鞭状(长3-8厘米)，末端稍卷曲，能着地生根行无性繁殖。叶脉网状，仅上面隐约可见，有网眼1-3行，靠近主脉的I行网眼狭长，与主脉平行，其外的1-2行网眼斜上，网眼外的小脉分离，不达叶边。叶草质干后暗绿色，无毛。孢子囊群线形或椭圆形，在主脉两侧各形成不整齐的1-3行，通常靠近主脉的I行较长，生于网眼向轴的一侧，囊群盖向主脉开口，其外的1-2行如成对地生于网眼内时则囊群盖相对开，如单独地生于网眼内时则囊群盖开向主脉或叶边；囊群盖狭，同形，膜质，灰绿色或浅棕色。国内一般用溶剂法提取总黄酮，存在着操作温度高，得率偏低等缺点，本发明的不同之处在于主要采用酶法提 取，后期采用高速逆流色谱法分离纯化总黄酮，产品不仅得率高，而且纯度高。
发明内容
本发明优点本发明主要采用生物酶解技术，采用乙醇做提取剂，后期采用高速逆流色谱法(HSCCC)分离纯化总黄酮。本发明方法提取快捷、产品纯度高，得率高，选用食品允许使用的乙醇为提取溶剂回流提取，无化学残留。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是—种采用酶法提取并与高速逆流色谱藕联，最终得到高纯度过山蕨总黄酮的方法，其步骤如下(I)酶解过山蕨干燥全草粉碎至20-40目，酶浓度O. 2-03g/l,酶解温度45-50°C，酶解时间 2-3h ；(2)回流提取加入60-70%乙醇，采用加热回流提取法，料液比1: 12_15，提取温度80-90°C，提取两次，每次提取时间1-1. 5h ；(3)收集回收乙醇，薄层层析检测分析，收集总黄酮部分；(4)过滤过滤，合并两次滤液，得总黄酮粗提物；(5)分相称取一定克数总黄酮粗提物，选择HSCCC溶剂系统，按比例将各种溶剂加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相；(6)将总黄酮粗提物溶于一定量的下相溶液中，震荡使完全溶解，备用；
(7)HSCCC分离以一定流速将溶剂的上相(固定相)和下相(流动相)以一定比例泵入HSCCC螺旋管，调整转速为800r/min，以2_3ml/min的流速泵入流动相，紫外检测器检测流出物；(8)收集各色谱组分，将HSCCC分离的到的流分挥干，得含量为90%以上的总黄酮。
具体实施例方式实施例1 :一种采用酶法提取并与高速逆流色谱藕联，最终得到高纯度过山蕨总黄酮的方法，其步骤如下(I)酶解将500g过山蕨干燥全草粉碎至20目，酶浓度O. 2g/l,酶解温度45°C,酶解时间2h ；(2)回流提取加入60%乙醇，采用加热回流提取法，料液比1: 12，提取温度80°C，提取两次，每次提取时间1. 5h ;(3)收集回收乙醇，薄层层析检测分析，收集总黄酮部分；(4)过滤过滤，合并两次滤液，得总黄酮粗提物；(5)分相称取Ig总黄酮粗提物，选择HSCCC正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水溶剂系统按30 70比例加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相；
(6)取O. 5g总黄酮粗提物溶于50ml的下相溶液中，震荡使完全溶解，备用；(7) HSCCC分离以10ml/min流速将溶剂的上相(固定相)和下相(流动相)以一定比例泵入HSCCC螺旋管，调整转速为800r/min，以2ml/min的流速泵入流动相，紫外检测器检测流出物；(8)收集各色谱组分，将HSCCC分离的到的流分挥干，HPLC分析，得含量为93. 6%的总黄酮。实施案例2 :—种采用酶法提取并与高速逆流色谱藕联，最终得到高纯度过山蕨总黄酮的方法，其步骤如下(I)酶解将500g过山蕨干燥全草粉碎至40目，酶浓度O. 3g/l,酶解温度50°C,酶解时间2. 5h ；(2)回流提取加入70%乙醇，采用加热回流提取法，料液比1: 14，提取温度90 °C，提取两次，每次提取时间Ih ；(3)收集回收乙醇，薄层层析检测分析,收集总黄酮部分；(4)过滤过滤，合并两次滤液，得总黄酮粗提物；(5)分相称取Ig总黄酮粗提物，选择HSCCC氯仿-甲醇-水-醋酸溶剂系统按40 : 60比例加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合,放置过夜,分相平衡后分出上相和下相；(6)取O. 5克总黄酮粗提物溶于50ml的下相溶液中，震荡使完全溶解，备用；(7) HSCCC分离以15ml/min流速将溶剂的上相(固定相)和下相(流动相)以一定比例泵入HSCCC螺旋管，调整转速为800r/min，以3ml/min的流速泵入流动相，紫外检测器检测流出物；
(8)收集各色谱组分，将HSCCC分离的到的流分挥干，HPLC分析，得含量为95.1 %的总黄酮。实施案例3 :—种采用酶法提取并与高速逆流色谱藕联，最终得到高纯度过山蕨总黄酮的方法，其步骤如下(I)酶解将500g过山蕨干燥全草粉碎至40目，酶浓度O. 2mg/ml,酶解温度45°C,酶解时间3h ；(2)回流提取加入70%乙醇，采用加热回流提取法，料液比1: 15，提取温度90°C，提取两次，每次提取时间1. 5h ;(3)收集回收乙醇，薄层层析检测分析,收集总黄酮部分；(4)过滤过滤，合并两次滤液，得总黄酮粗提物；(5)分相称取Ig总黄酮粗提物，选择HSCCC正己烷-醋酸乙酯-正丁醇-甲醇溶剂系统按20 80比例加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相；(6)取O. 5克总黄酮粗提物溶于50ml的下相溶液中，震荡使完全溶解，备用；(7) HSCCC分离以20ml/min流速将溶剂的上相(固定相)和下相(流动相)以一定比例泵入HSCCC螺旋管，调整转速 为800r/min，以2ml/min的流速泵入流动相，紫外检测器检测流出物；(8)收集各色谱组分，将HSCCC分离的到的流分挥干，HPLC分析，得含量为95. 3%的总黄酮。
权利要求
1.一种采用酶法提取并与高速逆流色谱藕联，最终得到高纯度过山蕨总黄酮的方法，其步骤如下 (1)酶解过山蕨干燥全草粉碎至20-40目，酶浓度O.2-0. 3mg/ml，酶解温度45-50°C，酶解时间2-3h ； (2)回流提取加入60-70%乙醇，采用加热回流提取法，料液比1: 12-15，提取温度8090°C，提取两次，每次提取时间1-1. 5h ； (3)收集回收乙醇,薄层层析检测分析,收集总黄酮部分； (4)过滤过滤，合并两次滤液，得总黄酮粗提物； (5)分相称取一定克数总黄酮粗提物，选择HSCCC溶剂系统按其比例分别将各种溶剂加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相； (6)取适量总黄酮粗提物溶于一定量的下相溶液中，震荡使完全溶解，备用； (7)HSCCC分离以一定流速将溶剂的上相(固定相)和下相(流动相)以一定比例泵入HSCCC螺旋管，调整转速为800r/min，以2_3ml/min的流速泵入流动相，紫外检测器检测流出物； (8)收集各色谱组分，将HSCCC分离的到的流分挥干，得含量为90%以上的总黄酮。
2.根据权利要求1所述的利用酶法提取并与高速逆流色谱藕联，最终得到高纯度过山蕨总黄酮的方法，其特征是在所述的步骤(I)中，采用的酶为纤维素酶。
3.根据权利要求2所述的利用酶法提取并与高速逆流色谱藕联，最终得到高纯度过山蕨总黄酮的方法，其特征是在所述的步骤(5)中，HSCCC溶剂系统为正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水或氯仿-甲醇-水-醋酸或正己烷-醋酸乙酯-正丁醇-甲醇的一种。
4.根据权利要求3所述的利用酶法提取并与高速逆流色谱藕联，最终得到高纯度过山蕨总黄酮的方法，其特征是在所述的步骤￠)中，总黄酮粗提物与下相溶液比为1: 10。
5.根据权利要求4所述的利用酶法提取并与高速逆流色谱藕联，最终得到高纯度过山蕨总黄酮的方法，其特征是在所述的步骤(7)中，采用10-20ml/min的流速将溶剂的上相和下相泵入HSCCC螺旋管。
全文摘要
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种从大兴安岭野生过山蕨里提取总黄酮的方法，特别是涉及一种利用酶法提取，高速逆流色谱分离纯化总黄酮的新方法。本发明优点本发明提取快捷、迅速，所得产品纯度高，环境污染小。1、应用生物酶解技术，使细胞内有效成分充分溶出。2、采用高速逆流色谱技术分离过程简单、溶剂消耗量少，在短时间内实现有效成分的快速分离，且纯度高。本发明利用生物酶法，促使有效成分充分溶出，乙醇回流提取，再采用高速逆流色谱分离纯化，所得总黄酮纯度提高到95.3％。
文档编号C07G99/00GK103059069SQ201210595538
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者张亚红, 姚德坤, 姚德利, 万莉 申请人:大兴安岭林格贝有机食品有限责任公司