在哺乳动物细胞中产生具有延长的循环半衰期的重组糖蛋白的方法

专利名称：在哺乳动物细胞中产生具有延长的循环半衰期的重组糖蛋白的方法
在晡乳动物细胞中产生具有延长的循环半衰期的重组糖蛋白的方法
发明背景发明领域
本发明总体上涉及重组表达系统并且更具体地说涉及用于生物合成具有增加的α 2-6唾液酸含量的糖蛋白的方法。
背景信息
有机磷(OP)试剂抑制神经细胞中的乙酰胆碱酯酶(AChE)的能力使得其能够用作杀虫剂、除草剂以及强有力的神经毒剂，包括Sarin、Tabun, Soman以及VX。它们对胆碱能神经系统的神经毒性效应如果没有得到适当地治疗则可能导致气哽感、视力丧失、唾液分泌过多、胃痉挛、呕吐、腹泻、肌肉痉挛、失去意识以及死亡。反应的原因是分解乙酰胆碱的能力的丧失，从而导致神经细胞的过度刺激。
因为暴露于OP代表未来的潜在的化学危险，所以可用于预防这些化学品的试剂代表保护作战人员和平民免于化学中毒的一个重大机遇。保护士兵以对抗OP试剂的一种手段是通过注射生物清除剂，所述生物清除剂结合至这些OP试剂并且防止它们到达作用部位。
OP神经毒剂如sarin、soman以及VX代表我们的作战人员和平民人群所面临的最危险的化学武器威胁中的一些，因为这些致死剂可以由境外实体或恐怖组织生产。作为结果，这些试剂可以为与美国利益相悖的组织所拥有。此外，如果这些试剂进行大面积地传播，那么所述试剂有可能使数以千计的作战人员或平民致残、伤害或甚至杀死他们。因此，预防它们的毒性的医疗措施将非常有助于预防或减轻由这些OP神经毒剂所表现的毒性效应。OP-清除剂当用作保护性预防剂时，在目前代表了用于预防由于在化学危险区中暴露于这些神经毒素而对作战人员和平民所造成的伤害或使这种伤害减至最小的最佳替代品中的一种。OP-清除剂的最可能的终端用户是在战争区的美国和盟军作战人员，在所述战争区中存在暴露于此类化学神经毒剂的重大机会或危险。第二种终端用户将是在美国保护下的平民，这些平民处在恐怖分子或流氓政权的化学攻击的重大风险之中。
最有名的生物清除剂候选物之一是丁酰胆碱酯酶(BChE)，包括人血浆丁酰胆碱酯酶(huBChE)。BChE是在人和其它动物中发现的胆碱酯酶家族的天然血浆酶。BChE是具有约340kDa的分子量和在体内的持续半衰期的四聚体丝氨酸酯酶。尽管huBChE的确切生理机能尚未知晓，但这种酶可以预防暴露于OP化合物的动物中毒。在作为生物清除剂的作用中，huBChE直接结合至神经毒剂，从而将其螯合以避免作用于神经毒剂的乙酰胆碱酯酶主要目标。关于OP化合物的其它酶清除剂，huBChE具有广谱活性和(如果有的话)有限的生理副作用。此外，源自血浆的人BChE(huBChE)在体内具有处于数十小时范围内的持续且较长的平均驻留时间。因此，施用外源huBChE代表一种用于预防OP试剂对于所暴露个体的毒性的潜在宝贵策略。然而， 这种生物清除剂不能降解神经毒剂且作为结果，所述蛋白质清除剂要有效则需要近似mg/kg体重的剂量。
huBChE可以从人血浆获得，然而，这种手段不是最佳的，因为很难获得在可能的军事紧急状态下所需的较大量，特别是从血浆对于其它未得到满足的医疗需求的重要性来看。因为huBChE在蛋白质与OP试剂的1:1化学计量下对保护是有效的，所以要求足以适用于军事的量的这种酶的替代来源。因此，生产大量有效的huBChE呈现为军事上进行成功预防以抵抗作战人员对于OP神经毒素的暴露的一个主要障碍。已经对用于大规模生产rhuBChE的重组表达系统进行了探究，且作为结果，所述蛋白质已经在包括大肠杆菌、哺乳动物以及转基因动物的表达系统中表达。考虑到CHO源性产物在生物技术产业中的成功，推断来自CHO且或许是其它哺乳动物细胞的rhuBChE也将有效作为人血浆源性BChE的替代品。不幸的是在所有情况下，重组人BChE (rhuBChE)尚未同血浆源性huBChE —样有效，主要是因为循环半衰期可能缩短了许多倍，从而产生了不能在战地长期发挥作用的试剂。当前的rhuBChE无效的原因归咎于用于产生这种蛋白质的表达系统，所述表达系统不具有产生特性与天然huBChE类似的产物所必需的合成能力。由于作战人员可能有长期的潜在暴露，所以希望开发一种在体内具有延长的循环半衰期的BChE生物清除剂。近来，研究人员试图通过附着聚乙二醇(PEG)分子以增加蛋白质的大小且或许降低其免疫原性来解决重组人形式的BChE (rhuBChE)的有限半衰期的问题。然而，这一修饰同样具有限制。在一项研究中，重组人BChE展现比小鼠中的天然血清源性HuBChE的平均驻留时间短2.5倍的平均驻留时间。为了提高半衰期，研究人员通过添加PEG分子来对重组HuBChE(rHuBChE)进行化学修饰。添加PEG确实将平均驻留时间延长至36.2小时；然而，这仍然小于血浆源性形式的值。在另一项研究中，用天然和重组猕猴BChE (MaBChE)来进行聚乙二醇化作用并且由曲线下面积(AUC)所表示的药物代谢动力学概况也得到改良但仍然小于天然MaBChE。此外，重复注射PEG-rhuBChE在小鼠中产生比未结合的酶高若干倍的抗-rhuBChE抗体。尽管在一些情况下，降低的免疫原性已经在酶、细胞因子以及激素的聚乙二醇化作用之后观察到，但是聚乙二醇化的干扰素-β-1a在猴子中的施用事实上产生提高的免疫原性。当前技术水平将BChE的可获得性专属地限制于人血浆天然来源。这大幅度地减少了可以被给予可获得的保护和剂量的作战人员和平民的潜在数量，因为当前仅存在有限的血浆供应。在化学试剂可能被用作遍布人口众多地区的武器时，这尤其成问题。此外，当前的rhuBChE供应就循环驻留时间来说是不令人满意的，因为所用表达系统不能生成与天然的血浆源性产物具有相同的特性和生物有效性的产物。发明概述本发明是基于以下开创性发现:糖蛋白的体内循环半衰期是通过唾液酸含量和糖类键联的性质来调节的。糖蛋白如丁酰胆碱酯酶(BChE)上的唾液酸附着对于延长的循环半衰期来说很关键。α 2-3唾液酸键联可能比α 2-6唾液酸键联更容易受到酶促降解。影响糖蛋白的四级结构的翻译后加工事件也促成药物代谢动力学概况并且糖蛋白装配成为多聚体增加它们的体内驻留时间。本发明提供一种分离的哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，所述细胞包括异源的(heterologous) α 2_6唾液酸基转移酶(ST6GAL1)核酸序列。一方面,所述细胞含有编码人丁酰胆碱酯酶(huBChE) 的核酸序列。另一方面，所述细胞包括减少α 2-3唾液酸基转移酶基因(St3gall)的表达或使这种基因沉默的核酸序列。例如，使St3gall基因沉默的核酸序列可以是RNA干扰(RNAi)途径中涉及到的小干扰RNA(SiRNA)、短干扰RNA、或沉默RNA。使St3galI基因沉默的核酸序列还可以是微小RNA(miRNA)分子。或者，St3gall基因可以例如由锌指核酸酶进行敲除。在一个实施方案中，编码ST6GAL1和huBChE的核酸序列、以及减少St3gall的表达或使其沉默的核酸序列全部同时共表达。另一方面，所述细胞进一步包括编码减少或抑制α 2-6唾液酸降解的酶的核酸序列。分离的哺乳动物细胞可以进一步包括编码ColQ基因的富含脯氨酸的附着结构域(PRAD)的核酸序列，所述核酸序列可以与编码ST6GAL1和huBChE的核酸序列、以及使St3gall沉默的核酸序列共表达。
本发明还提供一种重组糖蛋白，例如重组huBChE (rhuBChE)，所述糖蛋白含有α 2-6唾液酸键联。所述糖蛋白可以是单体或呈多聚体装配状态，如二聚体或四聚体。本文中所提供的重组糖蛋白则可以具有延长的循环半衰期或平均驻留时间(MRT)。
本发明提供一种用于生物合成富含α 2-6的糖蛋白的方法。所述方法包括在用于共表达编码一种肽的核酸序列的条件下培养含有异源ct 2-6唾液酸基转移酶(ST6GAL1)核酸序列的分离的哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。一方面，所述方法进一步包括抑制α 2-3唾液酸基转移酶的表达。例如，所述肽包括但不限于生物保护剂，如有机磷(OP)清除剂。在一个实施方案中，OP清除剂肽是rhuBChE。另一方面,所述方法进一步包括修饰细胞以共表达四聚体装配伴侣蛋白如PRAD，由此生成糖蛋白四聚体。
根据本文所提供的方法，糖蛋白中的α 2-6含量可以例如通过减少或抑制α 2_6唾液酸的降解、通过增加N-聚糖分支的数量和长度、通过提高N-聚糖分支化的速率、或通过增加CMP-唾液酸含量或池来增加，由此提供富含α 2-6唾液酸键联的糖蛋白。
一方面，α 2-6唾液酸降解通过提高防止α 2_6唾液酸降解的酶如岩藻糖基转移酶的活性而得以减少或抑制。岩藻糖基转移酶的实例包括但不限于α3岩藻糖基转移酶(a 3FucT)、α 3，4岩藻糖基转移酶(FucTLe)或α 2岩藻糖基转移酶(FucTLe)。在某些方面，酶活性在防止、抑制或减少α 2-6唾液酸降解的酶中可以通过表达编码这种酶的基因而得到提高。例如，岩藻糖基转移酶的活性可以通过增加FUT1、FUT2、FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT8或FUT9的表达来提高。
另一方面，α 2_6唾液酸降解通过降低促进α 2_6唾液酸降解的酶(包括但不限于唾液酸酶或神经氨酸酶)的活性而得以减少或抑制。
一方面，通过根据本公开的方法增加N-聚糖分支的数量或长度，糖蛋白中的α 2-6含量可以增加。在某些方面，N-聚糖分支的数量可以通过提高半乳糖转移酶或GIcNAc-转移酶如i3 6-GIcNAc-转移酶(IGnT)的活性来增加。N-聚糖分支的长度可以通过例如增加聚乳糖胺的数量而增加。在一个实施方案中，聚乳糖胺的数量通过增加33-GlcNAC转移酶(iGnT)的表达来增加。
本发明提供一种用于产生rhuBChE的方法。所述方法包括在细胞培养基中培养共表达huBChE、α 2-6唾液酸基转移酶以及PRAD的哺乳动物细胞，由此产生rhuBChE。一方面，rhuBChE从培养基中分 离。合适培养基的一个实例是无血清培养基。
附图简述


图1是展示丁酰胆碱酯酶(BChE)的四级机构的示意图。1A.描绘BChE单体；1B_D.描绘呈四聚体装配状态的BChE。
图2是展示唾液酸的化学结构的图。1A.描绘α 2_3唾液酸键联且1Β.展示α 2-6唾液酸键联。
图3是指示糖核苷酸CMP_Neu5Ac (CMP-唾液酸)的合成和BChE的唾液酸化作用的哺乳动物唾液酸化作用途径的简化示意图。
图4是野生型(4A)和重组BChE (4B)的循环时间以及在天然huBCHE (4C-D)中去除唾液酸之后的循环时间的图形表示。
图5是平均驻留时间(MRT)在分子量/百分比酸性组分网格上的三维图。
图6是FBS AChE和Eq BChE在小鼠循环中的时程的图形表示。展示了 FBS AChE⑷和Eq(B)在静脉内注射50-80单位(如果是ChE的话)/动物之后在小鼠循环中的稳定性。曲线描绘了 ChE在单个小鼠中的时程并且是根据单指数或双指数衰变方程来生成。每个数据点是两次测量的平均值。符号:方形表示天然ChE，而其它表示去糖基化和去唾液酸化的ChE。
图7是ChE在小鼠循环中的时程的图形表示。展示了在ChE静脉内注射至Balb/c小鼠的尾静脉中之后它们的单个时程，(A)其中tFBSAChE实心圆符号表示100个单位/动物(三个实验)而mFBS AChE空心三角形表示100个单位/动物(六个实验)。HuSBChE(B)，其中倒空心三角形符号表示39个单位/动物(两个实验)以及rHuBChE，其中实心菱形符号表示60个单位/动物(四个实验)。曲线拟合是根据方程来进行的。ChE活性百分比通过将在时间=t的血浆活性除以t=0的活性(通过将曲线外推至t=0获得)而计算出。
图8是单体⑷形式和四聚体⑶形式的BChE的示意图。
图9是为高传代和低传代哺乳动物细胞系所特有的修饰的N-糖基化途径的示意图。详尽说明对应于两个LNCaP细胞系的聚糖结构的步骤根据转录表达数据以及质谱结构数据在简化的N-糖基化途径中表示。当指示时，所述途径中的基因在括号中指示且位于它们对应的酶之下。途径中的“Xs”指示不存在对应酶或低水平的对应酶。聚糖形成的初始步骤以及唾液酸化作用被省略。
图10是使用HPLC和LC_MS/MSn技术的聚糖制备和分析的流程图表示。
发明详述
除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常所了解的含义。而且，除非文中另外要求，否则单数术语应包括复数性且复数术语应包括单数性。本发明的方法和技术一般根据本领域中熟知的常规方法来进行。一般来说，结合生物化学、酶学、分子与细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质与核酸化学以及本文所述的杂交使用的命名法、以及其技术是那些在本领域中熟知且常用的。
除非另外指出，否则本发明的方法和技术一般根据本领域中熟知的常规方法且如本说明书通篇中引用和论述的各种通用和更特定的参考文献中所描述地来进行。参见，例如 Sambrook 等 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y.(1989) ；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates(1992,以及 2002 的增刊)；Harlow and Lane Antibodies:A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Labora tory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1990) ；Introductionto Glycobiologyj Maureen E.Taylor, Kurt Drickamerj Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp.Freehold,N.J.；Handbook of Biochemistry:Section A Proteins Vol I1976CRC Press ；Handbookof Biochemistry:Section A Proteins Vol II1976CRC Press ；Essentials ofGlycobiologyj Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)。结合分子与细胞生物学、蛋白质生物化学、酶学以及医学与药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是那些在本领域中熟知且常用的。本文所提及的所有公开案、专利以及其它参考文献均以引用的方式并入本文中。除非另外指出，否则以下术语应被理解为具有以下含义:如本文中所用，术语“N-聚糖”是指N联寡糖，例如，由天冬酰胺N-乙酰基葡糖胺键联而附着到多肽的天冬酰胺残基上的N联寡糖。N-聚糖具有Man3GlcNAc2的常见五糖核心(“Man”是指甘露糖；“Glc”是指葡萄糖；且“嫩(:”是指N-乙酰基；GlcNAc是指N-乙酰基葡糖胺)。术语“三甘露糖核心”当关于N-聚糖使用时还指结构Man3GlcNAc2 (“Man3”)。N-聚糖在分支(触角)的数量方面存在差异，所述分支包含添加到Man3核心结构中的外围糖(peripheral sugar)(例如,岩藻糖和唾液酸)。N-聚糖根据它们的分支成分来分类(例如，高甘露糖型、复杂型或杂合型)。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复杂”型N-聚糖通常具有至少一个附着至三甘露糖核心的1，3甘露糖臂的GlcNAc和至少一个附着至三甘露糖核心的1，6甘露糖臂的GIcNAc。复杂N-聚糖还可以具有半乳糖(“Gal”)残基，所述残基任选地以唾液酸或衍生物(“他1^(3”，其中“他11”是指神经氨酸且“4(3”是指乙酰基)来修饰。复杂N-聚糖通常具有至少一个分支，这至少一个分支以例如像以下各物的寡糖封端=NeuNAc-；NeuAca2~6GaINAcal- ；NeuAca2~3Galb1-3GaINAcal- ;NeuAca2-3/6Galbl_4GlcNAcbl-；GlcNAcal_4Galbl_(仅粘蛋白);Fucal_2Galbl-(血型H)。硫酸酯可以出现在半乳糖、GaINAc以及GlcNAc残基上,且磷酸酯可以出现在甘露糖残基上。NeuAc (Neu:神经氨酸'Ac:乙酰基)可以被O-乙酰化或由NeuGl (N-羟乙酰神经氨酸)置换。复杂N-聚糖还可以具有链内取代，这些链内取代包含“等分”GIcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)。“杂合”N-聚糖在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂的末端上具有至少一个GIcNAc并且在三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上具有O个或更多个甘露糖。本文中所用的缩写具有本领域中的常见用法，参见，例如上述糖的缩写。其它常见缩写包括“PNGase”，它是指肽N-糖苷酶F(EC3.2.2.18) ；"GIcNAc Tr”或“GnT”，它是指
N-乙酰基葡糖胺基转移酶；“NANN”是指N-乙酰神经氨酸。术语“酶”当在本文中联合变更的宿主细胞糖基化作用使用时是指具有至少一种酶促活性的分子，并且包括全长酶、催化活性片段、嵌合体、复合体等。酶的“催化活性片段”是指具有可检测水平的功能(酶促)活性的多肽。术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指具有至少10个碱基长度的聚合形式的核苷酸。术语包括DNA分子(例如，cDNA或基因组或合成DNA)和RNA分子(例如，mRNA或合成RNA)，以及含有非天然核苷 酸类似物、非天然核苷间键或两者的DNA或RNA的类似物。核酸可以呈任何拓扑构象。例如，核酸可以是单链、双链、三链、四链、部分双链、分支、发夹式、环形、或呈挂锁构象。本术语包括单链和双链形式的DNA。本发明的核酸分子可以包括有义链和反义链RNA、cDNA、基因组DNA、以及上述的合成形式和混合聚合物。它们可以被化学或生物化学修饰或可以含有非天然或衍生化的核苷酸碱基，如本领域的技术人员所容易了解的。此类修饰包括例如标记、甲基化作用、以类似物取代一个或多个天然产生的核苷酸、核苷酸间修饰如不带电键联(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧基部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂以及修饰的键联(例如，α端基异构核酸等)。还包括在经由氢键和其它化学相互作用结合至指定序列的能力方面模拟多核苷酸的合成分子。此类分子在本领域中是已知的并且包括例如其中肽键联取代分子主干中的磷酸酯键联的那些分子。本发明的核酸(也称作多核苷酸)可以包括有义链和反义链的RNA、cDNA、基因组DNA、以及上述的合成形式和混合聚合物。它们可以被化学或生物化学修饰或可以含有非天然或衍生化的核苷酸碱基，如本领域的技术人员所容易了解的。此类修饰包括例如标记、甲基化作用、以类似物取代一个或多个天然产生的核苷酸、核苷酸间修饰如不带电键联(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧基部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂以及修饰的键联(例如，α端基异构核酸等)。还包括在经由氢键和其它化学相互作用结合至指定序列的能力方面模拟多核苷酸的合成分子。此类分子在本领域中是已知的并且包括例如其中肽键联取代分子主干中的磷酸酯键联的那些分子。
如本文中所用，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意图指的是经过遗传改造的细胞。重组宿主细胞包括其中已经被引入重组载体的细胞。应理解，此类术语意图指的不仅是特定受试者细胞，而且是这种细胞的后代。因为某些修饰可以由于突变或环境影响而在下一代中出现，所以此类后代可能实际上与亲代细胞不相同，但仍然包括在如本文中所用的术语“宿主细胞”的范畴内。重组宿主细胞可以是在培养基中生长的分离的细胞或细胞系或者可以是驻留在活组织或有机体中的细胞。术语“宿主”指的是包含一种或多种“宿主细胞”的任何有机体、动物或植物，或指的是“宿主细胞”的来源。
如本文中所用，术语“肽”指的是短多肽，例如通常小于约50个氨基酸长度且更通常小于约30个氨基酸长度的肽。如本文中所用的术语涵盖模拟结构功能且由此模拟生物功能的类似物和模拟物。
如本文中所用，术语“多肽”涵盖天然产生和非天然产生的蛋白质、以及其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体或聚合体。另外，多肽可以包含许多不同的结构域，这些结构域各自具有一种或多种相异活性。
“操作性连接的”表达控制序列指的是其中表达控制序列与相关基因邻接以控制相关基因的键联、以及呈反式作用或在一定距离处发挥作用以控制相关基因的表达控制序列。
如本文中所用，术语“分子”意指任何化合物，包括但不限于小分子、肽、蛋白质、糖、核苷酸、核酸、脂质等，且此类化合物可以是天然或合成的。
如本文中所用，“CMP-Sia池”指的是可检测水平的细胞CMP_Sia。CMP-Sia池可以是由宿主细胞产生CMP-Sia的、或是从培养基中摄取CMP-Sia的结果。
底物UDP-GlcNAc 是UDPN-乙酰葡糖胺的缩写。中间体ManNAc是N-乙酰甘露糖胺的缩写。中间体ManNAc-6-P是N-乙酰甘露糖胺_6_磷酸的缩写。中间体Sia_9_P是唾液酸-9-磷酸的缩写。中间体单磷酸胞苷-唾液酸被缩写为“CMP-Sia”。唾液酸在本文中被缩写为 “ Sia ”、“ Neu5Ac ”、“ NeuAc ” 或 “ NANA ”。
如本文中所用，术语“唾液酸”指的是一组分子，其中常见分子包括N-乙酰基-5-神经氨酸(Neu5Ac)，它在5-碳位置处具有以所附着的乙酰基修饰的碱性9-碳神经氨酸核心。Neu5Ac在5-碳位置处的常见衍生物包括:2_酮基-3-脱氧-d_甘油基-d_半乳-nononic酸(KDN)，它具有羟基来代替乙酰基；5_N-乙酰基的脱-N-乙酰化产生神经氨酸(Neu) ;S-N-乙酰基的羟基化产生N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。在这四个分子(Neu5Ac、KDN、Neu以及Neu5Gc)的4-位、7-位、8-位以及9-位处的羟基可以进一步被O-乙酰基、O-甲基、O-硫酸酯基和磷酸酯基取代以扩大这个化合物组。此外，已知存在不饱和形式和脱氢形式的唾液酸。
存在的显著未满足的需要是:开发生物对策以便当作战人员在战地经受如sarin和VX的神经毒剂时对他们进行保护。有前景的预防剂是蛋白质丁酰胆碱酯酶(BChE)，它将以1:1化学计量方式结合以抑制有机磷(OP)神经毒剂的作用。源自血浆的天然人BChE (huBChE)在动物模型中通过维持长的循环半衰期(平均驻留时间)而在抑制OP试剂方面已经十分成功，使得其在战地长期有效。
因为血浆供应可能受限，所以需要人BChE蛋白质的替代来源，诸如来自重组表达系统。来自重组有机体的人BChE (huBChE)代表从人血浆来进行酶的纯化的一个潜在可行的替代物。天然蛋白质证明了四聚体装配和复杂的糖基化修饰，因此在哺乳动物细胞中的表达是用于这种复杂蛋白质治疗的最佳宿主。具体来说，哺乳动物细胞具有执行复杂的翻译后修饰的能力，包括添加和修饰N-聚糖(N联糖基化作用)。如果加工完全进行，那么N-聚糖以唾液酸(二唾液酸化)封端，而其它聚糖可以经一个唾液酸(单唾液酸化)或半乳糖封端，如果糖基化加工未完全的话。此外，现在已知存在两种不同类型的唾液酸(Neu5Ac)键联。一种唾液酸键联涉及唾液酸在α 2-6构型下至半乳糖残基的键联，而另一种唾液酸键联涉及唾液酸α 2-3连接至半乳糖残基(图2)。
然而，重组人BChE (rhuBChE)尚未同血浆源性huBChE —样有效，主要是因为循环半衰期可能缩短了许多倍，从而产生了不能在战地长期发挥作用的试剂。已经对rhuBChE与人血清BChE的循环半衰期进行比较。尽管人ChE据报导展现约2，500-3，000分钟的长平均驻留时间，但rhuBChE的驻留时间是将近10倍短并且仅在50分钟的范围内。在MRT上的这一缺陷已归因于不充足的唾液酸含量以及四聚体装配的缺乏，如下文中所描述。
用于产生与血浆源性产物匹敌的rhuBChE产物的当前重组表达系统的缺点的性质可以由以下观察结果来解释。例如，已发现来自小鼠循环的重组人乙酰胆碱酯酶(AChE)与来自胎牛血清(FBS)的天然AChE相比快得多的清除率是由于在重组蛋白质上所占据的唾液酸位点的缺乏所致。此外，与天然蛋白质的数十小时相比，唾液酸从天然酶中的去除将循环半衰期减少至仅几分钟。唾液酸在寡糖上的存在可以通过阻止它的由肝脏脱唾液酸糖蛋白受体进行的结合和移除来增加蛋白质的体内循环半衰期，所述肝脏脱唾液酸糖蛋白受体除去具有以半乳糖封端的聚糖的蛋白质。动物中的肝受体还可以除去以岩藻糖/N-乙酰葡糖胺或甘露糖封端的聚糖。为了研究唾液酸在多种天然ChE中的作用，在施加用于去除唾液酸残基的神经氨酸酶(唾液酸酶)处理或用于去除整个聚糖的糖苷酶之前和之后，在小鼠中静脉内注射之后检查来自 马来源的天然BChE和Ache的平均驻留时间。用神经氨酸酶或糖苷酶处理天然BChE和天然AChE将平均驻留时间(MRT)缩短10至40倍，如图4中所示。唾液酸的去除将血浆源性马BChE的MRT从1437分钟缩短至150分钟。此外，这种下降对于用神经氨酸酶和糖苷酶两者的情况类似，提示唾液酸在维持循环半衰期中起关键作用。同源BChE的MRT发生急剧下降的发现证实了唾液酸在维持FBS AChE和Eq BChE在血液中的长持续时间方面的重要性。当前rhuBChE无效的原因在于，用来产生这种蛋白质的表达系统不具有用于产生特性与天然huBChE类似的产物所必需的合成能力。当前表达系统的两个主要限制如下:
(1)糖蛋白上的唾液酸附着对于延长的循环寿命来说很关键。然而，当前表达宿主不在rhuBChE糖蛋白上产生足够的唾液酸并且经常添加α 2_3唾液酸键联，所述α 2_3唾液酸键联不同于在血浆源性huBChE中占主导地位的α 2-6唾液酸键联。(2)表达宿主经常不含有将rhuBChE单体装配成也增加循环半衰期的适当四聚体形式的足够伴侣能力。血浆源性huBChE主要含有连接至糖蛋白的α 2-6唾液酸。正常CHO细胞不能产生α 2-6键联，因为它们的α 2，6-唾液酸基转移酶的表达是沉默的。作为结果，重组CHO细胞专属地生成α2-3唾液酸。α-2，3-键联在源自CHO细胞的重组BChE中的主导性可以造成当将BChE注射到体内时唾液酸键联的更快速的去除以及从循环系统中的更快速的去除。因此，希望改造CHO细胞以使得这些细胞将产生主要含有α-2，6-键联的重组蛋白质。优越的重组表达系统可以通过双管齐下的手段实现。首先，CHO细胞将被改造以表达α -2，6-唾液酸基转移酶并且提高总体唾液酸化作用。其次，CHO细胞将被改造以抑制α-2，3_唾液酸基转移酶的表达，以使得这些键联被α 2-6唾液酸键联置换。换言之，α 2-3唾液酸键联将随着α2-6唾液酸含量的增加而同时减少或消除。为了更全面地理解血清BChE糖基化的程度和质量，对附着于血浆源性天然BChE的N-聚糖进行详细评价。已发现，huBChE在九个N-糖基化位点处被高度地糖基化。所有九个N-糖基化作用位点的分析揭露这些位点主要含有单唾液酸化和二唾液酸化的N-聚糖。然而，以下发现具有特别的重要性:唾液酸(Neu5Ac)主要以α 2_6连接至半乳糖，但观察到少许α 2-3唾液酸键联(参见图2)。另外，在仅有一个唾液酸、即单唾液酸化BChE的情况下，所述键联专属地为α 2-6键联。换言之，不存在从仅含有α 2-3唾液酸键联的血浆源性huBChE中获得的聚糖。如上所论述，CHO细胞已经广泛用于产生某些糖蛋白，因为这些宿主能够以高产率产生翻译后修饰的蛋白质。这些细胞将为一些但不一定是所有具有唾液酸的半乳糖残基加帽，这会造成rhuBChE的不完全唾液酸化作用。然而，还已知的是，由CHO细胞添加到重组糖蛋白上的唾液酸专属地是α 2-3唾液酸键联。CHO细胞中的α 2-6唾液酸基转移酶基因是沉默的并且因此在由CHO产生异源蛋白质如rhuBChE中是没有活性的。作为结果，在当前用法中所广泛使用的中国仓鼠卵巢生产宿主不能产生具有在天然血浆源性huBChE中产生的类似α 2-6唾液酸键联的rhuBChE。换言之，为了产生反映内源性血浆源性huBChE的重组huBChE，将不可能使用传统CHO表达宿主。这提出了一个特别的问题，因为CHO细胞是生物技术产业中最广泛使用的生产平台。天然huBChE (大部分是α 2_6唾液酸键联，有少许α 2-3唾液酸)与来自CHO细胞的rhuBChE (专属地是α 2-3键联)之间在唾液酸加工方面的差异是否将会造成所生成产物的生物特性方面(包括循环驻留时间)的差异仍有待探究。虽然没有进行直接比较，但值得做的是检查两种唾液酸键联的相对敏感性。具体地，两种唾液酸键联可以由存在于动物中的唾液酸酶(神经氨酸酶)来消除。此外，已经对这些唾液酸酶之间的活性进行了比较。来自大鼠肝脏和人肝脏的唾液酸酶的底物特异性的先前检查证明了 α 2-3唾液酸键联比α 2-6唾液酸键联的更快速水解。简言之，α 2-3唾液酸键联可能更易于在动物中降解。此外，这将解释，即使一些唾液酸键联存在于rhuBChE中，但是所述蛋白质具有比血浆huBChE短得多的体内循环寿命，原因在于存在不同的唾液酸键联。
减少α 2-3唾液酸含量的一种方式是通过降低一个或多个α 2_3唾液酸基转移酶基因的表达,这些基因包括 ST3gall、St3gal2、St3gal3、st3gal4、st3gal5、st3gal6，它们可以在CHO或哺乳动物或真核细胞系中表达；或通过降低α 2-3唾液酸基转移酶的活性。α 2-3唾液酸可以使用SiRNA或用于降低活性水平、底物特异性或活性蛋白质的表达的其它技术来减少。还可以使用蛋白质的特异性化学抑制剂。另一个替代方案是敲除或以其它方式使这个或这些基因(Stgall、St3gal2、St3gal3、St3gal4、St3gal5、St3gal6)在 DNA 水平上突变，从而使得α 2-3唾液酸基转移酶活性得以降低或消除。
α 2-6唾液酸含量可以通过过度表达α 2-6唾液酸基转移酶(St6gall、st6gal2)来增加。一个替代方案是通过一些操控而相对于α 2-3唾液酸基转移酶活性来提高α2_6唾液酸基转移酶的活性。例如，遗传修饰使得α 2-6唾液酸基转移酶活性得到提高或改变酶在细胞中的位置，以使得此酶在α 2-3唾液酸基转移酶可以到达底物之前具有活性。底物特异性也可以更改以使得在α 2-3唾液酸基转移酶可具活性之前ci2-6唾液酸基转移酶能笼住CMP-唾液酸底物。唾液酸化作用可用的底物可以通过经由在这个唾液酸化作用底物的作用位点的产生的增加或向所述作用位点的输送的增加而在适当的区室中增加CMP-唾液酸的池来增加。
细胞的内源性唾液酸酶/神经氨酸酶活性可以降低或消除，以使得细胞在唾液酸一旦被添加之后不能将其分解。这可以通过例如抑制或敲除细胞的特异性神经氨酸酶活性来实现，诸如通过使用上述用于降低α 2-3唾液酸基转移酶活性的技术来抑制Neul、Neu2及或Neu3的基因。
唾液酸含量可以通过经由过度表达半乳糖转移酶来提高可用的分支化或另外提高其活性以允许更多分支来增加，这些分支可用于以唾液酸如α 2-6来进行加帽。另一手段将是增加甘露糖苷酶和GnT表达或活性水平以便分支化可以更快速地进行。
增加其它分子的存在，所述其它分子可以降低唾液酸酶在体内除去或分解α 2-6或甚至α 2-3唾液酸任一者的能力。一个潜在手段将是增加岩藻糖基转移酶的表达或活性，所述岩藻糖基转移酶将在体内结合至糖基并抑制神经氨酸酶活性。此类岩藻糖基转移酶将是由？爪4、？^'5、？^'6、？^7、？^'8、？^'9编码的α 3岩藻糖基转移酶或(a 3FucT)、或由FUTUFUT2编码的α 3，4岩藻糖基转移酶(FucTLe) FUT3或α 2岩藻糖基转移酶(FucTLe)。图9展示高传代和低传代LNCaP细胞的修饰的N-糖基化途径。这个途径的一个主要特点是不存在I型聚糖(参看图9)，暗示这些细胞特有的聚糖是II型聚糖。与II型聚糖、b4GalT相关的酶呈现除了其它基因之外B4GALT1和B4GALT3基因的表达增加。低传代与高传代LNCaP细胞系之间的主要差异在于，在高传代LNCaP细胞中的FucTH的表达在微阵列数据和质谱模型所预测的酶水平下的增加。
循环寿命还可以通 过增加N-聚糖上的分支的长度来延长，分支长度的增加是通过表达由B3GNT1、B3GNT2、B3GNT3、B3GNT4所编码的β 3_GlcNAC转移酶(iGnT)来增加聚乳糖胺的数量。更多分支可以通过表达由(GCNT2)所编码的分支酶i3 6-GIcNAc-转移酶(IGnT)来添加。这些分支然后可以被唾液酸化以获得更高的唾液酸含量。糖蛋白上的唾液酸附着对于延长的循环半衰期来说很关键，因此，增加总体唾液酸含量可足以延长循环半衰期。造成血液中的低驻留时间的第二个限制是BChE蛋白质的四聚体装配的缺乏。尽管增加α 2-6唾液酸含量代表用于获得天然BChE的较佳生物镜像的一个关键组成部分，但是对于维持延长的平均驻留时间来说也很重要的另一个因素是BChE的适当装配。血浆源性BChE在形式上主要是四聚体并且为了获得适当的生物模拟物，将希望表达也主要呈四聚体形式的重组形式(图8)。事实上，单体形式的胆碱酯酶展现出比四聚体胆碱酯酶的驻留时间短大约40倍的驻留时间。在使用huAChE蛋白质的先前研究中，发现四聚体具有比单体形式的驻留时间长大于7倍的MRT。同样，发现二聚体具有是单体的两倍的驻留时间。然而，有趣的是，从所有形式中去除唾液酸将所有形式的驻留时间减少到仅五分钟，不管蛋白质的装配状态如何。这些观察结果暗示多种去除系统有助于AChE从循环中的消除。在四聚体装配的情况下，当存在单体和二聚体而不是四聚体时，基于尺寸的清除机制可以发挥重要的作用。不幸的是，由未修饰的CHO或其它哺乳动物表达系统产生的rhuBChE展现对于四聚体装配的限制。事实上，当rhuBChE在CHO或HEK细胞中表达时，产物以短驻留单体和二聚体的混合物形式生成，其中存在小于10%四聚体。因此，有效的四聚体装配在CHO或其它细胞中的缺乏代表有效产生具有长循环半衰期的重组BChE的另一个瓶颈。CHO细胞主要表达单体形式的BChE蛋白质，并且先前研究已显示单体更加快速地从体内清除。因此，还希望改造具有增加四聚体装配的能力的CHO细胞。幸运的是，四聚体装配通过存在PRAD附着结构域来促进。通过共表达这个PRAD基因连同α 2-6唾液酸基转移酶的基因，将实现增加水平的含有更高水平2-6唾液酸化糖蛋白的四聚体蛋白质。重组BChE从体内快速清除的原因包括当前表达系统的缺陷，所述系统缺乏产生展现对于长循环半衰期来说关键的特性的重组产物的能力。从当前表达系统中获得低活性的rhuBChE的原因有两点:(1)唾液酸含量对于将要维持在循环中的糖蛋白如BChE来说很重要。然而，在rhuBChE上不存在足够的唾液酸并且唾液酸键联的类型(α2-3)对于长循环半衰期来说并不理想。相对而言，血浆源性BChE在糖蛋白上大部分含有α 2-6唾液酸键联。(2)BChE是四聚体蛋白质，但这种蛋白质在重组表达系统中主要以单体和二聚体形式被表达。四聚体比单体和二聚体维持在循环中的时间更长。应用合成生物工程、通过加入上述能力来修饰重组表达系统将使得合成出持久的且具活性的rhuBChE产物。本文所述的方法是通过用具有增加的α 2-6唾液酸含量和提高的四聚体装配能力的表达系统来替代当前不充分的生产方法而在推进当前技术水平方面的转型。对于当前CHO生产宿主的这些修饰将提供一种新颖的表达系统，此系统将能够合成在化学、物理以及生物活性方面与血浆源性BChE几乎相同的重组huBChE产物。此外，rhuBChE将比源自血浆和人的BChE更加安全，因为它将不会有受到人供体中存在的外来因子的污染的危险。另外， 这种表达技术将同样适用于未来的OP-清除剂，所述清除剂是像huBChE的糖蛋白并且必须以长久地存在于循环系统中的形式产生。
本发明描述了一种修饰哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞以合成rhuBChE蛋白质的方法，所述蛋白质含有增加的2-6唾液酸含量和更高水平的四聚体装配。这种新颖的CHO系统将在GMP生产工艺中实施并且修饰的rhuBChE将随后在动物模型中进行测试以便论证类似于天然huBChE的药物代谢动力学和功效。预期这将使得开发一种用于制造GMP-等级的rhuBChE的具有商业利益的方法，所述GMP-等级的rhuBChE与血浆源性huBChE具有等效的物理、化学和生物特性。此外，这种改造的CHO表达系统将随着它们在未来几年内的发展而可适用于生产许多其它OP-生物清除剂。以下实施例意图说明但不限制本发明。实施例1在CHO中表达重组人BChE (huBChE)人丁酰胆碱酯酶(huBChE)的基因将由商用DNA人肝脏文库或来自先前研究的其他研究人员处获得。根据需要，可以从总肝脏mRNA克隆BChE cDNA。对于在CHO细胞中表达huBChE来说，全长BChEcDNA将插入pcDNA哺乳动物表达载体中，所述载体还含有新霉素抗性基因(phuBChE-neo)。CHO-Kl细胞将从ATCC获得并且在标准DMEM培养基中成长。接着将使用脂转染胺以phuBChE-neo质粒来转染CHO-Kl细胞并且将使用增加浓度的G-418来选择huBCHE的高水平表达克隆。最高表达的克隆将在ELISA测定中使用抗-huBChE抗体来鉴定。将由此获得表达单体rhuBChE的多种粘附性稳定CHO-Kl细胞系(CH0_rhuBChE)。实施例2在CHO中改造重组人α 2_6唾液酸基转移酶基因这个实施例说明通过改造用于在CHO中产生α 2_6唾液酸基转移酶的基因来增加糖蛋白中的α2_6唾液酸含量的重组表达系统。第一步将是在CHO-rhuBChE中表达α2_6唾液酸基转移酶的基因(ST6GAL1 ；Pubmed基因ID:6480)。人ST6GAL1的基因将从商用cDNA文库获得。作为替代方案，ST6GALIcDNA可以使用逆转录酶和人ST6GAL1基因特异性PCR引物，从总UNA分离物进行克隆。全长cDNA将插入还含有博来霉素(zeocin)抗性基因(pST6GALl_博来霉素)的pcDNA哺乳动物表达载体中。接着将使用脂转染胺2000 (Invitrogen)和在含有博来霉素抗生素的选择培养基中选出的克隆分离物，以pST6GALl-zeo质粒来转染CHO-rhuBChE细胞。这个方法将提供共表达重组huBCHE和ST6GAL1的CH0-rhuBChE_ST6GALl克隆，将通过针对抗-ST6GAL1抗体的阳性蛋白质印迹而对所述克隆进行分析。实施例3α 2-3唾液酸基转移酶的抑制这个实施例说明通过敲减或敲除α 2-3唾液酸基转移酶基因来减少糖蛋白中的α 2-3唾液酸含量的重组表达系统。以α 2-3附着至重组BChE的唾液酸与α 2-6唾液酸相比疑似更少可能地保留在循环中且在体内更易受到唾液酸酶(神经氨酸酶)的作用。为了检验这个假说，将针对a)表达 α 2-3 唾液酸(CHO-RhuBChE)、b)表达 α 2-3 和 α 2-6 唾液酸(CH0-rhuBChE_ST6GALl)、以及c)那些主要表达α 2-6唾液酸附着(CH0-rhuBChE-ST6GALl-ST3GAL(-))的细胞的循环半衰期和结构进行比较。为了生成这第三变体，将使用SiRNA技术减少内源性中国仓鼠卵巢(CHO) α 2-3唾液酸 基转移酶基因(St3gall)。为了选择siRNA序列以敲减St3gall基因，将这个基因的mRNA序列输入到siRNA设计工具中。所述工具将提议候选的双链siRNA序列且若干St3gal IsiRNA将进行排序并转染至CH0-rhuBChE-ST6GALl细胞中以分析St3gal I基因敲减效率。提供最有效的St3gall基因敲减的siRNA序列将得以合成并被连接至pSilencer 4.1-CMV-puro siRNA 表达载体中。所生成的 pSilencer 4.l_CMV_ST3Gall (-)shRNA-puro质粒将使用脂转染胺和以嘌呤霉素抗生素选出的克隆分离物来转染至CH0-rhuBChE-ST6GALl中。作为一个替代方案，将采用将锌指用作用于完全敲除St3gall的方法。将设计一对锌指核酸酶以生成在St3gall目标位点内的双链DNA断裂，这将导致永久性突变。锌指核酸酶将被转染至CH0-rhuBChE-ST6GALl细胞中。在转染之后，将执行稀释克隆法(每孔一个细胞)以从转染的CH0-rhuBChE-ST6GALl-St3Gall(_)细胞池中分离单克隆。接着将使用PCR分析就St3gall基因破坏对单细胞源性集落进行分析。这个方法将提供表达重组huBCHE和STGALl的多种CH0-rhuBChE-ST6GALl_ST3Gall (-)克隆，其中有减少或敲除的ST3Gall表达。使用α 2-3神经氨酸酶处理和对2-3唾液酸键联特异的凝集素将观察到CH0-rhuBChE-STGALl-St3gall(_)的降低的α 2-3唾液酸水平。实施例4重组人BChE在CHO中的四聚体装配这个实施例说明糖蛋白四聚体可以通过共表达ColQ基因的PRAD而获自重组表达系统。重组huBChE的长循环半衰期的缺乏至少部分是由于(以及唾液酸缺乏)重组表达宿主不能产生四聚体。已显示，BChE单体的羧基结构域与Colq基因的富含脯氨酸的附着结构域(PRAD)(即，17残基的肽)相互作用。这个结构域对于促进BChE装配成四聚体来说很关键。因此，将获自商用cDNA文库或先前研究人员的Colq基因的PRAD克隆到携带有潮霉素抗性基因(pPRAD-hygro)的pcDNA哺乳动物表达载体中。作为一个替代方案，编码17残基肽的cDNA可以化学地合成。接着将在前面实施例中开发的细胞系(CHO-rhuBChE、CHO-rhuBChE-STGALl 以及 CH0-rhuBChE-ST6GALl_ST3Gall (-))在脂转染胺存在下用pPRAD-hygro转染并且在含有潮霉素的培养基中选择以便并入PRAD伴侣蛋白供四聚体装配之用。可以在并入ST6GAL1或敲减STGall (-)之前并入pPRAD-hygro。本文所述的方法是可互换的并且不需要以任何特定顺序进行，因为所有基因都具有单独的抗生素抗性且所有都将并入CHO中。表达用于四聚体装配的PRAD伴侣蛋白的克隆将在潮霉素中选择且将使用抗-PRAD抗体来鉴定最高表达的克隆。将由此获得多种稳定的表达PRAD的CHO细胞系，包括 CH0-rhuBChE-PRAD、CH0-rhuBChE-STGALl-PRAD 以及 CH0-rhuBChE-ST6GALl_ST3Ga
11(-) -PRAD0 这个方法将产生 CHO-rhuBChE-PRAD 和 CH0-rhuBChE-STGALl_ST3Gal I (-)的克隆，它们可以通过在蛋白质印迹上阳性筛选PRAD表达和由表达PRAD的CHO细胞系产生的四聚体百分比的增加(优选地高于50%)来加以分析。实施例5重组人BChE在CHO中的四聚体装配和唾液酸含量的分析这个实施例说明由上述重组表达系统获得的唾液酸键联和四聚体糖蛋白的定性和定量，特别是与天然人血浆BChE相比。 将开展四聚体测定且将对血浆源性BChE与来自未修饰的和修饰的CHO的rhuBChE中的四聚体进行比较。 天然人形式的huBChE的延长的循环半衰期至少部分是归因于主要是四聚体在血浆源性产物中的存在。为了监测和比较天然BChE与重组BChE的特征，将涵盖多重分析以监测BChE的装配状态。确定异源PRAD的表达是否增加由重组CHO细胞产生的四聚体的百分比也是很重要的。可以使用蔗糖梯度超速离心、PAGE或尺寸排阻层析来对四聚体的与单体的水平进行比较。对于蔗糖梯度离心，将huBChE施加于5-20%线性蔗糖梯度中并且在离心机中在30，OOOg下离心18小时。将梯度分级分离并且测定BChE活性。四聚体将沉淀到比在单体和二聚体中所观察到的低得多的蔗糖密度。用于测量四聚体的量的一种替代定量方法是通过使用尺寸排阻层析(SEC) (PNAS)。将BChE蛋白质在含有来自Shodex的SEC KW-803管柱的HPLC系统上运行，所述管柱包括1.7 X IO5的排阻限和21，000个理论板。使用UV检测器检测样本且按等份收集多个部分，之后使用标准的Ellman测定来分析BChE活性。接着将数据以BChE活性对收集间隔进行绘图，其中四聚体将首先从管柱中出现，接着是二聚体且最后是单体。通过使用面积计数，可以测定四聚体、二聚体以及单体的百分比。因此，提供了评估来自人血浆以及未修饰的和改造的CHO细胞的BChE的四聚体、二聚体以及单体的百分比的定量方法。这个测定可以用于论证天然人源性血浆含有大于70%四聚体且重组四聚体水平在PRAD表达之后增加。
实施例6
2-6和2-3唾液酸含量以及血浆源性和重组人BChE的聚糖组成的分析
这个实施例描述一种定量测量α 2-3和α 2_6唾液酸含量的百分比以及血浆源性和重组huBChE的完整聚糖结构的方法。
天然血浆形式的huBChE的延长的循环半衰期的另一个原因是在BChE上存在广泛的α 2-6唾液酸，这防止由肝脏和其它器官中的受体对含有非唾液酸化结构的蛋白质的去除。因此，希望增加rhuBChE上的α 2-6键联并且减少α 2_3键联。将检查天然血浆BChE上的2-6和2-3唾液酸含量且将所测定的水平与获自野生型和改造的CHO细胞系的rhuBChE的唾液酸含量进行比较。首先，将测量总唾液酸含量并使用对唾液酸特异的凝集素微阵列来定量。如果唾液酸含量不同，那么将对重组和血浆源性形式观察到差别结合样式。然后将蛋白质用α 2-3特异性神经氨酸酶(唾液酸酶)进行处理以便去除这些特异性唾液酸且随后再次使用凝集素微阵列对唾液酸含量进行定量。作为一个替代方案，HPLC分析可以用于定量在α 2-3神经氨酸酶处理之后的唾液酸聚糖的量。最终，为了得到完整聚糖结构详情，将如图11中所示对从分离的糖蛋白释放的聚糖使用MALD1-AXIMA共振质谱仪来进行互补的质谱(MS)分析。用于表征聚糖结构的这种当前技术水平的方法使用MS谱分析，这种谱分析通常与液相层析(LC)相结合以分离复杂的聚糖混合物。组合的HPLC-MALDI分析方法的使用已被证明成功地用于检测N联糖肽和聚糖。MALD1-AXIMA共振质谱仪的光谱获取将使得可能鉴定不能由其它MS单元所检测的详细的聚糖结构。聚糖的这个LC-MS/MSn分析将以多量纲产生分子量的集合，这些量纲代表来自人血浆、正常CHO以及用不同唾液酸基转移酶改造的CHO的huBChE的N-聚糖概况。将论证天然人源性血浆含有显著的唾液酸含量且rhuBChE的α 2-6唾液酸含量在CHO细胞改造之后有所增加。
实施例7
rhuBChE产生方法的优化
这个实施例说明一种用于在无血清培养基中获得CHO-rhuBChE、CH0-rhuBCHE-ST6GAL、 CH0-rhuBCHE-ST6GAL-ST3GAL (-)、以及 CH0-rhuBCHE-ST6GAL_ST3GAL(-)-PRAD的悬浮克隆细胞系的方案。为了产生大量重组huBChE用于动物试验和未来的临床试验,必须开发一种适合于GMP制造的方法。因此，鉴定CHO克隆将很重要，所述CHO克隆可以稳健地生长并且当发展新的细胞系时可依从于规模扩大。为了使细胞培养过程的规模可缩放，细胞必须被适配成悬浮培养，同时仍然产生所要产率的rhuBChE。其次且同样重要的是，当血清的存在使纯化由CHO细胞培养物所分泌的rhuBChE的能力变得复杂时，将血清从培养基中除去。所述程序将对于CHO-rhuBChE来描述，但类似方法将应用于CH0-rhuBCHE_ST6GAL、CH0-rhuBCHE-ST6GAL-ST3GAL (-)、以及 CH0-rhuBCHE-ST6GAL_ST3GAL (-) -PRAD。首先，表达rhuBChE的多重附着依赖性克隆将以逐渐降低浓度的血清联合渐增百分比的CHO商用的无血清培养基通过重复传代渐进地从血清中脱离。细胞稳健性将在悬浮培养中使用振荡烧瓶或旋转烧瓶并且通过为来自每个成功转染的大约5至10个克隆测量随时间的生长率和最大活细胞密度来监测。每个克隆的BChE的生产率还将使用活性测量来监测以便确定哪个克隆提供最高产率。对于所阐述的最稳健的克隆，还将对四聚体装配和唾液酸含量的水平进行评估以便确保生成有利的产物概况。在所有情况下，细胞将仅暴露于已配准的组分，以使得细胞系能最终转化为GMP设施以用于生产供动物试验和未来临床试验之用的BChE。将从这些研究中获得悬浮细胞系，这些细胞系可以在无血清培养基中生长到高细胞密度并且以足够用于动物试验的量产生重组huBChE。对于在1个单位/mL或更高水平的rhuBChE生产下具有大于1 X 106个细胞/mL的悬浮细胞密度的每个克隆而言可能实现小于24小时的倍增时间。实施例8用于重组和天然血浆源性BChE的纯化方案这个实施例描述一种用于纯化rhuBChE的四聚体和单体的方案。为了获得足够的rhuBChE和天然BChE用于动物试验和化学/物理分析，必需从细胞培养上清液纯化重组蛋白质且从血浆纯化天然蛋白质。对于重组蛋白质而言，细胞培养上清液首先将通过离心与细胞分离。接着，将重组蛋白质上清液或稀释的血浆装载于普鲁卡因胺-琼脂糖凝胶层析管柱上。在装载之后，将管柱用25mM磷酸钠缓冲液洗涤且接着对于单体和四聚体BChE形式用线性梯度0.05-1.0M NaCl来洗脱。部分洗脱通过测量在280nm下的吸光度来测定且接着收集单独的部分并且监测BChE活性。含有BChE的那些部分将被汇集、浓缩且通过超滤来脱盐。这个手段可以将天然BChE纯化到40至50%且将重组BChE纯化到接近70%。为了提高含有BChE的部分的纯度，可以将离子交换管柱加入该工艺中。这个方案可以按50%的纯度提供天然人源性血浆BChE且按超过70%的纯度提供重组 huBChE。实施例9扩大CHO细胞培养方案用于GLP工艺这个实施例说明用于获自上文所述的重组表达系统的不同CHO克隆的方法。用于GLP工艺的扩大的CHO细胞培养方案如下。将开发采用小规模振荡器和旋转培养的技术，并且将这些技术规模扩大成提供足够rhuBChE用于小鼠的动物试验和分析测量的工艺。动物试验所需的样本量是大约100个单位/小鼠。如果我们假定rhuBChE生产率是I个单位/mL，那么对6只小鼠的重组huBChE测试将要求大约600个单位。假定50%纯化率，那么小鼠试验将要求1200mL。为了制备足够的额外蛋白质用于聚糖和四聚体分析，对于GLP工艺中的每个细胞系和试验将产生大约2.5升的培养物。对于细胞培养工艺来说，将采用可以轻易地并入大多数GMP设施中的波式生物反应器。作为一个替代培养平台，电脑控制的生物反应器也将涵盖在内。可以在GLP和GMP水平下使用的多重主细胞库和工作细胞库将从优化的生产克隆中生成。最初，来自工作库的CHO-rhuBChE克隆将在振荡烧瓶中生长到200mL。培养基和细胞接种参数将在波式生物反应器或细胞培养生物反应器中变化以便优化培养基中的CHO细胞的最终细胞密度和BChE的最终浓度。接下来将是多个生物反应器参数，包括葡萄糖、氧、PH和谷酰胺酸、以及营养素的补料分批添加；将对这些参数进行评估以便最大化细胞密度用于所述扩大的工艺。将为以下CHO细胞克隆各自建立2.5升的扩大工艺:I) CHO-rhuBChE ;2) CH0-rhuBCHE_ST6GAL，3) CH0-rhuBCHE-ST6GAL_ST3GAL (-)，以及4)CH0-rhuBCHE-ST6GAL-ST3GAL(-)-PRAD。这个工艺将在每个2.5升工艺中产生至少I个单位/ml的rhuBChE，其中细胞密度在悬浮培养中处于或高于I X IO6个细胞/mL。
实施例10
rhuBChE在GMP条件下的CHO细胞培养制造
这个实施例说明可依从于获自上述重组表达系统的rhuBChE的GMP制造的方法。
用于可依从于GMP制造和动物试验的rhuBChE的CHO细胞培养制造的程序如下。将实施可依从于GMP制造的2.5升工艺以便从以下4种细胞系培养和纯化各自至少 600 个单位纯化的 rhuBChE: I) CHO-rhuBChE ；2) CH0-rhuBCHE-ST6GAL, 3)CH0-rhuBCHE-ST6GAL-ST3GAL (-)，以及 4) CH0-rhuBCHE-ST6GAL-ST3GAL (-) -PRAD。蛋白质的这个量值表示各自大约0.9mg纯化的rhuBChE蛋白质。rhuBChE蛋白质的额外毫克数将从每个样本中纯化以用于四聚体装配分析和唾液酸含量分析。这些生产研究将在JohnsHopkins Kimmel 癌症中心的细胞加工和基因疗法(Cell Processing and Gene Therapy,CPGT)核心进行。这一设施采用适用于动物、I期和II期研究的良好操作规范(cGMP)。由FDA投入建造并且在2000年被验证的所述设施包括一个1800ft2的cGMP制造设施，它包括4个独立的、HEPA滤过的、等级10，000的制造套件，以及400ft2的工艺优化实验室(POL)。POL负责将基于研究实验室技术的制造工艺转变为cGMP顺应式生产。因此，用于这个提议的GMP可行性研究将在POL中进行。POL包括限制进入实验室并且配备有三个生物安全柜，2个控制速率的冷冻机(Planer Kryo和Forma Cryomed)、两个Stericult培养箱、C0BE2991细胞清洗机、两个低速离心机、_80°C冷冻机、显微镜、2-8°C冰箱、天平以及水浴。波式生物反应器和细胞培养生物反应器将被合并以便促进在2.5升规模的当前研究中的GMP-可依从性制造。所有设备均以预防性维持计划和安排进行质量控制，以使得由POL优化的基于细胞的工艺可以在GMP套件中精确地实施。由POL管理者所准备的发展研究报告可以被研究人员用于支持在监管提交和IND/IDE CMC中所描述的产品说明书。计划在POL设施中实施上述工艺以便快速实现GMP-可依从性制造工艺。简单来说，将从工作规模库中获取克隆、在振荡烧瓶中生长、且接着转移到2.5升波式生物反应器或优化生长的替代性生物反应器构型中。将使用离心、接着在FPLC管柱上分离来进行纯化。这个工艺将在每个2.5升工艺中产生至少I个单位 /ml的rhuBChE，其中细胞密度在悬浮培养中处于或高于1X106个细胞/mL。
实施例11
重组人BChE的药物代谢动力学和药效动力学研究
这个实施例说明血浆源性huBChE与获自未修饰和改造的CHO细胞的rhuBChE在小鼠中的药物代谢动力学和药效动力学比较。
在小鼠中的药物代谢动力学和药效动力学研究将如下来进行。在考虑中的所有动物研究在实施之前将由Johns Hopkins大学的动物保健和使用核心机构进行评审和批准。为了论证在GMP可依从性环境中培养和加工的改造的CHO细胞产生紧密反映血浆源性BChE的循环稳定性的rhuBChE，将首先测定其在Balb/c小鼠中的药物代谢动力学和药效动力学性质。四组6-8周龄的BALB/c小鼠(n=6只/组)将肌肉内注射100U以下各物:⑴天然血浆源性huBChE，(2)来自未修饰的CHO (CHO-rhuBChE)细胞的rhuBChE，(3)来自CH0_rhuBCHE-ST6GAL-ST3GAL(_)-PRAD的rhuBChE，或⑷盐水(阴性对照)。还将分析来自(5)CH0-rhuBCHE-ST6GAL 和 ￠) CH0-rhuBCHE-ST6GAL_ST3GAL (-)的 rhuBChE 的药物代谢动力学，以便确定三个因素(四聚体装配[PRAD]、2-6唾液酸添加[ST6GAL]、或以2_3唾液酸键联替换2-6唾液酸[ST6GAL(+)-ST3GAL(-)])中的哪一个对于降低清除率来说最为关键。在注射之前且在注射之后1、2、4、6、8、24、48以及96小时，将从尾静脉中采集5 μ I血液、在95 μ I水中稀释并且在22 °C下、使用在50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中的ImM 丁酰硫代胆碱(BTC)和0.5mM5, 5’ - 二硫代双2-硝基苯甲酸(DTNB)来测定BChE活性。产物形成之后将在412nm下、使用13，600M^的摩尔消光系数测量5-硫代-2-硝基苯甲酸的吸光度的增加。活性将以U/ml来报告，其中IU表示I μ mole所水解的BTC/min(Ellman测定)。基于BChE清除在血液中的时程的4个药物代谢动力学参数将使用用于非象限化分析的计算程序来计算:平均驻留时间(MRT)、峰值血浆BChE活性(Cmax)、终末半衰期(T1/2)以及曲线下面积(AUC)。这个测定测量了 BChE的活性(药效动力学)而不是药物的绝对水平。为了将对于rhuBChE和血浆源性huBChE的催化活性转换为绝对蛋白质水平(与药物代谢动力学相关)，可以测定每毫克BChE蛋白质的比活性。使用上述Ellman测定测量活性并且使用对于lmg/ml溶液1.88的消光系数由A280获得纯化蛋白质的蛋白质含量。将对血浆源性BChE的药物代谢动力学参数值与由未修饰的CHO-rhuBChE和CH0-rhuBChE-STGALl_ST3GAL(-)-PRAD获得的药物代谢动力学参数值进行比较。如果细胞改造的努力成功的话，来自上述修饰的CHO细胞系的rhuBChE的药物代谢动力学参数将与那些血浆源性的参数值可比并且优于其它CHO细胞系(未修饰的以及错失这些修饰中的一个或多个的那些细胞系)。如果修饰的CHO细胞系源性rhuBChE的AUC和MRT更低，那么聚糖结构和四聚体装配的分析比较将指示制造甚至更加类似于天然huBChE的改造的变体的策略。这个方案将使得能够测定源自改造细胞的产物的AUC和/或MRT，比未修饰的产物高至少50%，并且是血浆源性人BChE的AUC和/或MRT的至少75%。
实施例12
重组人BChE的功效研究
这个实施例说明在来自注射有血浆源性huBChE或以未修饰和改造形式(具有唾液酸和四聚体装配)表达的rhuBChE的小鼠的血液样本中的BChE的体外功效比较。
功效研究将如下进行。为了检查rhuBChE在清除神经毒剂方面是否与血浆源性形式一样有效，将使用神经毒剂类似物进行体外抑制研究。将使用的主要类似物是氟磷酸二异丙酯(DFP) X6H14FO3P以及MEPQ。 血液样本将从注射有rhuBChE或血浆源性huBChE的小鼠中提取，并且与各种量值的OP类似物一起在25°C下培养2小时。残余酶活性将通过标准Ellman测定来进行测定。将残余酶浓度针对溶液中的OP试剂的当量数进行绘图。来自正常CHO和改造的CHO的rhuBChE与血浆源性huBChE的体外活性之间的比较将指示改造的CHO细胞是否生成与血浆源性形式一样有效的huBChE形式。也可以使用如soman或VX的OP试剂来执行类似体外研究。这个方案将使得能够检测来自改造的CHO细胞的rhuBChE的阳性功效值，这些值是来自血浆源性huBChE的值的至少75%。实施例13 重组人BChE的免疫原性研究这个实施例说明huBChE与获自未修饰的和改造的(具有唾液酸和四聚体装配)CHO细胞的rhuBChE的免疫原性的比较。免疫原性研究将如下进行。为了检查rhuBChE和血浆源性huBChE的免疫原性，从注射有这些酶的小鼠中提取的血液样本将通过ELISA测定、使用抗-huBChE抗体来就抗体反应进行分析，小鼠各组(n=6只/组)将经受来自三种来源的每一种的huBChE的一次或两次注射(间隔4周):1)血浆，2)未修饰的CHO以及3)改造的CH0。循环抗-huBChE抗体在小鼠血液中的存在将通过(ELISA)来测定。简言之，将96-孔板以在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的50 μ I huBChE溶液(0.2U/孔)进行涂布。在洗涤之后，将添加50 μ I小鼠血液的5倍连续稀释液(范围从1:200到1:125，000)且孵育过夜。ELISA活性将接着通过使用(HRP)-结合山羊抗-小鼠IgG的检测来测定。吸光度将在405nm下测量，且抗体浓度将由标准曲线来计算。样本将针对所有三种BChE调配物进行检测，以便考察针对唾液酸的特异性抗体反应或各种形式的装配BChE。活性水平的比较将指示(如果有的话)哪种形式的BChE在小鼠中引发最大的免疫反应。将提供与由血浆源性人BChE所引出的抗-huBChE抗体滴度类似的来自改造的CHO细胞的rhuBChE的抗-huBChE抗体滴度。如果表达展现了与血浆源性huBChE类似的药物代谢动力学功效性质的rhuBChE的话，那么这个酶在非人灵长类模型中的药物代谢动力学将随后加以表征。虽然本发明已经参考上述实施例来描述，但是应了解，修改和变化将涵盖在本发明的精神和范畴内。因此， 本发明不仅仅限于以下权利要求书。
权利要求
1.一种分离的哺乳动物细胞，其包含异源α 2-6唾液酸基转移酶(ST6GAL1)核酸序列。
2.如权利要求1所述的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
3.如权利要求1所述的细胞，其进一步包含编码人丁酰胆碱酯酶(huBChE)的核酸序列。
4.如权利要求1所述的细胞，其进一步包含减少α2-3唾液酸基转移酶基因(St3gall)的表达或使所述基因沉默的核酸序列。
5.如权利要求4所述的细胞，其中使St3gall沉默的所述核酸序列选自由SiRNA和miRNA组成的组。
6.如权利要求1所述的细胞，其进一步包含用于敲除St3gall基因的装置。
7.如权利要求1所述的细胞，其中所述细胞进一步包含编码ColQ基因的富含脯氨酸的附着结构域(PRAD)的核酸序列。
8.—种重组糖蛋白，其包含α 2-6唾液酸键联。
9.如权利要求8所述的糖蛋白，其中所述糖蛋白呈四聚体装配状态。
10.如权利要求8所述的糖蛋白，其中所述糖蛋白是重组huBChE(rhuBChE)。
11.如权利要求8所述的糖蛋白，其中所述糖蛋白具有延长的循环半衰期或平均驻留时间(MRT)。
12.如权利要求1所述的细胞，其进一步包含编码减少或抑制α2-6唾液酸降解的酶的核酸序列。
13.一种用于生物合成富含α 2-6的糖蛋白的方法，所述方法包括在共表达编码肽的核酸序列的条件下培养如权利要求1所述的细胞。
14.如权利要求13所述的方法，其进一步包括抑制α2-3唾液酸基转移酶的表达。
15.如权利要求13所述的方法，其进一步包括减少或抑制α2-6唾液酸的降解。
16.如权利要求15所述的方法，其中通过提高防止α2-6唾液酸降解的酶的活性来减少或抑制α 2-6唾液酸降解。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述酶是岩藻糖基转移酶。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶是α3岩藻糖基转移酶(a 3FucT)。
19.如权利要求18所述的方法，其中a3FucT由选自以下的核酸序列来编码:FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT8 以及 FUT9。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶是a3，4岩藻糖基转移酶(FucTLe)或a 2岩藻糖基转移酶(FucTLe)。
21.如权利要求15所述的方法，其中通过降低促进a2-6唾液酸降解的酶的活性来减少或抑制a 2-6唾液酸降解。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述酶是唾液酸酶或神经氨酸酶。
23.如权利要求13所述的方法，其进一步包括增加N-聚糖分支的数量或长度。
24.如权利要求23所述的方法，其中通过提高半乳糖转移酶或GIcNAc-转移酶的活性来增加N-聚糖分支的数量。
25.如权利要求23所述的方法，其中通过增加聚乳糖胺的数量来增加分支的长度。
26.如权利要求25所述的方法，其中通过增加03-GlcNAC转移酶(iGnT)的表达来增加聚乳糖胺的数量。
27.如权利要求13所述的方法，其进一步包括增加CMP-唾液酸含量。
28.如权利要求13所述的方法，其中所述肽是生物保护剂。
29.如权利要求13所述的方法，其中所述肽是OP清除剂。
30.如权利要求13所述的方法，其中所述肽是rhuBChE。
31.如权利要求13所述的方法，其进一步包括修饰所述细胞以共表达四聚体装配伴侣蛋白，由此生成糖蛋白四聚体。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述伴侣蛋白是PRAD。
33.一种用于预防或治疗受试者的神经毒素中毒的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求8所述的糖蛋白。
34.一种用于产生rhuBChE的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养共表达huBChE、α 2-6唾液酸基转移酶以及PRAD的哺乳动物细胞，由此产生rhuBChE。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述rhuBChE从所述培养基中分离。
36.如权利要求34 所述的方法，其中所述培养基是无血清培养基。
全文摘要
本发明提供了用于产生重组糖蛋白的方法和重组表达系统，所述重组糖蛋白具有增加的唾液酸含量且主要含有α2-6唾液酸键联。本发明还提供了具有延长的体内循环半衰期的重组糖蛋白。本文所述的糖蛋白的一种潜在应用是用于治疗和预防由神经毒素引起的中毒。
文档编号C07K9/00GK103221537SQ201280003817
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者M·J·比特邦 申请人:约翰·霍普金斯大学