用于检测肠和血脑屏障通透性的方法及其测试材料的制作方法

用于检测肠和血脑屏障通透性的方法及其测试材料的制作方法
【专利摘要】本发明公开的是用于测试与肠和/或血脑屏障通透性相关的抗原的方法、试验和装置。例如，血液、唾液或其他体液可针对以下进行测试：(1)结合至细菌毒素(优选脂多糖)，和(2)结合至选自(a)肠相关抗原和(b)血脑屏障相关抗原中的至少一种的组织抗原。测试结果的分析可用于协助检测和诊断与肠渗漏综合征相关的疾病(由于细胞旁途径或跨细胞途径，和由于细菌毒素或一些其他原因)和/或用于与过度血脑屏障通透性相关的疾病，其在本文中考虑为包括神经性炎症和/或神经性自身免疫性疾病两者，和特别是肌萎缩性侧索硬化、帕金森病、多发性硬化症、阿尔茨海默氏病或周围神经病和重性抑郁症。
【专利说明】用于检测肠和血脑屏障通透性的方法及其测试材料
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2011年I月28日提交的美国临时申请号61/437，244的权益，其在此通过引用全文并入。
【技术领域】
[0003]本发明涉及帮助检测和诊断肠和血脑屏障通透性的方法、试验和试剂盒。
【背景技术】
[0004]与人体中的其他细胞器相比，肠上皮细胞被暴露于巨大数量的源于摄入食物、酵母、细菌和病毒的抗原。这些细菌抗原中的一些对粘膜免疫系统不产生威胁，而其他可对宿主有害。肠免疫系统通过允许少量分子渗透上皮——在那里，它们与粘膜和全身免疫系统相互作用，以便产生对这些抗原的调节的T-细胞功能或耐受一而监测肠腔中的这些细菌抗原。然而，肠免疫系统对这些细菌抗原的不恰当或过度暴露可引起该调节机制损坏并导致胃肠疾病(I)。因此，抗原摄取的生理学的理解是了解包括炎性和自身免疫反应的疾病的发病机理的中心(2)。
[0005]本文讨论的这些和所有其他外部材料在此通过引用全文并入。在并入的参考文献中的术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反的情况下，应用本文提供的该术语的定义，并不应用在参考文献中的该术语的定义。
[0006]增加的肠通透性被认为是先于数种自身免疫性疾病开始前的早期阶段(3-6)。因为该原因，最近已经对肠屏障机能障碍在以GI道以及包括神经系统的肠外器官为目标的很多病理学条件的发病机理中的作用兴趣增加(7)。作为对炎症、自身免疫和癌症的生物学门口(biological doorway)的肠屏障功能的该失调在Fasano的评论文章(7)中进行讨论。在该评论文章以及早期Fasano文章(4)中，Fasano强调胃肠道的主要功能在传统上已经被理解为限于营养物的消化和吸收，以及限于电解质类和水稳态。然而，胃肠道的解剖和功能性布置的更吸引人的分析提示该器官的另一个极其重要的功能为它通过屏障机制调节环境和宿主之间大分子运输的能力。肠上皮屏障和它的细胞间紧密连接，与肠相关淋巴组织和神经内分泌网络一起，控制对非自身抗原的耐受和免疫之间的平衡。
[0007]连蛋白/闭合蛋白为细胞旁紧密连接(paracellular tight junction)的生理调节器，其涉及大分子运输并因此涉及免疫应答和耐受之间的平衡(7)。当精确调整的肠屏障蛋白在那些在遗传上对环境因素敏感的个体中失调时，出现肠疾病诸如腹部疾病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，和肠外自身免疫性疾病诸如关节炎、狼疮、甲状腺炎、糖尿病和甚至多发性硬化症(MS)、恶性肿瘤和重性抑郁症(8-14)两者的可能性。可有助于肠和脑屏障机能障碍的病理生理学并因此涉及肠和肠外自身免疫的主要的环境因素之一为细菌脂多糖(LPS)。由于肠小生物群生态失调和细菌异位，LPS明显是造成上皮细胞上toll样受体活化和首先导致肠屏障并随后血脑屏障机能障碍的炎性级联反应活化的原因(14)。LPS在诱导“肠渗漏(leaky gut)”和“脑渗漏(leaky brain) ”综合征中的作用显示在图1中。[0008]图1强调GI道异常可损害肠屏障的完整性并增加未消化的抗原进入循环，因此攻击免疫系统。对这些抗原的反应激活免疫和炎性级联反应，导致产生促炎性细胞因子、抗体阵列和增加的肠屏障通透性(或“肠渗漏”综合征)。如果肠屏障机能障碍保持未处理，则结果可为神经性炎症、神经侵染(neuroinvasion)和神经变性。
[0009]因此，需要对可攻击免疫系统，诱导可首先导致打开血脑屏障，然后是之后的神经性炎症和神经变性的炎症(15-25)的大抗原分子的肠通透性进行测量的非侵入的方法、装置和试验。这些需要和其他需要由本发明满足。

【发明内容】

[0010]本发明的发明主题提供了装置、系统、试验和方法，其中可测试来自人类的样品，以协助检测和诊断肠和/或血脑屏障通透性。
[0011]在本发明的一些方面中，样品的一个或多个部分针对以下进行测试:(1)结合至细菌毒素，和(2)结合至选自(a)肠相关抗原和(b)血脑屏障相关抗原中的至少一种的天然抗原。在一些方面中，细菌毒素可有利地包括脂多糖。
[0012]当测试肠通透性时，天然肠相关抗原优选地选自:(1)肠结构蛋白；(2)紧密连接蛋白；(3)对紧密连接蛋白的结合受体；和(4)细胞连接蛋白。在本发明的一些方面的实例中，对肌动蛋白/肌动球蛋白、闭合蛋白和/或连蛋白、肠ZOT受体和基质金属蛋白酶-3(MMP-3)中的一个或多个的抗体，进行测试。
[0013]当测试血脑屏障通透性时，血脑屏障相关抗原优选地选自:(1)血脑屏障蛋白；
(2)胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP) ；(3)基质金属蛋白酶(MMP)，(4)脑ZOT结合蛋白；(5)脑ZOT受体；(6)钙卫蛋白；和(7)髓鞘碱性蛋白。在本发明的一些方面的实施例中，对
(I)血脑屏障蛋白；(2)胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP);和(3)基质金属蛋白酶(MMP)中的一个或多个的抗体，进行测试。
[0014]根据诊断观点，来自先前描述的方法中的一个或多个的测试结果的分析可用于协助与肠渗漏综合征和/或过度血脑屏障通透性相关的疾病的检测和/或诊断。
[0015]在本发明的一些方面中，可利用免疫测定，包括但不限于ELISA测定、RIA测定、乳胶凝集反应、珠测定、蛋白质组测定和其他本领域技术人员已知的免疫测定实施结合至各自成分的样品的检测。
[0016]在本发明的一些方面中，也可提供用于进行免疫测定的测试平板和试剂盒，其包括例如改进的测试平板，其具有作为结合肽的下述:(I)细菌毒素；和(2)包括(a)肠相关抗原和(b)血液天然脑屏障相关抗原中的至少一种的天然抗原。
[0017]在用于协助检测和诊断或以其他方式鉴定与肠渗漏综合征有关的疾病的特别优选的测试平板中，肠相关抗原可有利地选自:(1)肠结构蛋白；(2)紧密连接蛋白；(3)对紧密连接蛋白的结合受体；和(4)细胞连接蛋白。
[0018]在用于诊断或以其他方式鉴定与过度血脑屏障通透性相关的疾病的特别优选的测试平板中，血脑屏障相关抗原可有利地选自:(1)血脑屏障蛋白；(2)胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP) ； (3)基质金属蛋白酶(MMP)；⑷脑ZOT结合蛋白；(5)脑ZOT受体；(6)钙卫蛋白；和(7)髓鞘碱性蛋白。
[0019]考虑到测试试剂盒可包括共同测试第一组与肠渗漏综合征相关的抗原和第二组与过度血脑屏障通透性相关的抗原两者的一个或多个平板。
[0020]根据更普遍的观点，本文考虑的用于协助检测和诊断与解剖学屏障的过度通透性相关的疾病的方法和装置，包括:从抗体测试样板获得和分析测试结果，所述样板从结合来自患者的样品至细菌毒素和选自(a)肠相关抗原和(b)血液天然脑屏障相关抗原中的至少一种的天然抗原而产生信号。
[0021]在所有这些考虑的方法和装置中，样品可包括任何合适的身体样品，包括例如全血样品、血清/多血清样品、唾液样品或来自其他体液的样品。
[0022]还要进一步考虑的是本文考虑的方法和装置可用于协助鉴别诊断涉及(I)肠道菌群生态失调，和(2)肠屏障损坏的疾病。例如，如目前考虑的，当测试结果包括IgA、IgM和IgG中的任一个对脂多糖的细菌毒素的阳性结果，和全部IgA、IgM和IgG对闭合蛋白和连蛋白的阴性结果，和IgG对肌动球蛋白的阴性结果时，将趋向于指示涉及肠道菌群生态失调的诊断。
[0023]也考虑通过区分由于细胞旁途径(paracellular pathway)和跨细胞途径的肠屏障损坏而协助鉴别诊断。
[0024]关于通过细胞旁途径的损坏，当测试结果包括IgA、IgM和IgG中的任一个对脂多糖的细菌毒素的阳性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对闭合蛋白或连蛋白的阳性结果，和IgG对肌动球蛋白的阴性结果时，将趋向于指示涉及通过细菌抗原造成肠屏障损坏的诊断。相比之下，当测试结果包括全部IgA、IgM和IgG对脂多糖的细菌毒素的阴性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对闭合蛋白或连蛋白的阳性结果，和IgG对肌动球蛋白的阴性结果时，将趋向于指示涉及非通过细菌抗原造成肠屏障损坏的诊断。
[0025]关于通过跨细胞途径的损坏，当测试结果包括IgA、IgM和IgG中的任一个对脂多糖的细菌毒素的阳性结果，和全部IgA、IgM和IgG对闭合蛋白和连蛋白的阴性结果,和IgG对肌动球蛋白的阳性结果时，将趋向于指示涉及通过细菌抗原造成肠屏障损坏的诊断。
[0026]也根据本文讨论的发现，在测试结果包括IgA、IgM和IgG中的任一个对脂多糖的细菌毒素的阳性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对闭合蛋白和连蛋白的阳性结果，IgA、IgM和IgG中的任一个对血脑屏障蛋白的阳性结果,和IgA、IgM和IgG中的任一个对神经元抗原的阳性结果的情况下，将趋向于指示涉及由细菌毒素诱导的肠和血脑屏障完整性两者损坏的诊断。
[0027]相比之下，在测试结果包括IgA、IgM和IgG中的每一个对脂多糖的细菌毒素的阴性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对闭合蛋白和连蛋白的阳性结果，IgA、IgM和IgG中的任一个对血脑屏障蛋白的阳性结果，和igA、1拂和igG中的任一个对神经元抗原的阳性结果的情况下，涉及由非细菌毒素的因素诱导的肠和血脑屏障完整性两者损坏的诊断是可能的。
[0028]还要进一步考虑的是可发生肠道菌群生态失调而不损坏肠屏障完整性，但损坏血脑屏障完整性。例如，在测试结果包括IgA、IgM和IgG中的任一个对脂多糖的细菌毒素的阳性结果，和IgA、IgM和IgG中的每一个对闭合蛋白和连蛋白的阴性结果，IgA、IgM和IgG中的任一个对血脑屏障蛋白的阳性结果,和IgA、IgM和IgG中的任一个对神经元抗原的阳性结果的情况下，可趋向于指示涉及在那种情况下肠道菌群生态失调的诊断。
[0029]类似地，在测试结果包括IgA、IgM和IgG中的每一个对脂多糖的细菌毒素的阴性结果，和IgA、IgM和IgG中的每一个对闭合蛋白和连蛋白的阴性结果，IgA、IgM和IgG中的任一个对血脑屏障蛋白的阳性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对神经元抗原的阳性结果的情况下，涉及损坏血脑屏障完整性、神经性炎症和神经性自身免疫，而不与肠屏障或肠道菌群生态失调相关的诊断是可能的。
[0030]关于具体的疾病，本文考虑的测试结果的分析可用于协助检测和诊断肌萎缩性侧索硬化、帕金森病、多发性硬化症、阿尔茨海默氏病、或周围神经病和重性抑郁症。在测试结果包括IgA、IgM和IgG中的任一个对血脑屏障蛋白的阳性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对神经元抗原的阳性结果的情况下，这样的病症被认为是可能的。
[0031]本发明的发明主题的多种对象、特征、方面和优点将根据以下优选实施方式的详细描述，连同附图和表变得更加显而易见。
【专利附图】

【附图说明】
[0032]图1为现有技术图，其显示了 LPS在肠渗漏和脑渗漏综合征诱导中的目前理解的作用。
[0033]图2为现有技术图，其显示了在炎性和神经免疫性疾病的发病机理中LPS诱导炎症和Thl7淋巴细胞活化的目前理解的作用=LPSi诱导炎性应答、产生细胞因子和增加循环中Thl7阳性细胞的数量。
[0034]图3为现有技术图，其显示了肠对脑机能障碍的目前理解的病因学——如果未处理，粘膜耐受的损失可怎样引发诱导肠屏障机能障碍、全身炎症、神经性炎症、神经侵染和神经变性的级联反应。
[0035]图4为显示本发明提出的方案的图，其中涉及异常肠通透性和血脑通透性的引发物和机制可用于肠通透性鉴定(IPI)和/或血脑通透性鉴定(BBPI)的下一代测试。
[0036]图5为显示根据本发明的一些方面的异常肠通透性在自身免疫性疾病的发病机理中提出的作用的图。
[0037]图6为显示根据本发明的一些方面的用于进行免疫测定的样品微量滴定板布局的图，该微量滴定板具有含12种不同抗原和肽的12个不同排。
[0038]图7为显示根据本发明的一些方面的样品微量滴定板布局的图，其中针对来自肠和BBB蛋白以及相关组织抗原的12种不同的抗原或肽(结合的抗原和肽是透明的)测量IgG/IgM/IgA。
[0039]图8为显示根据本发明的一些方面的样品微量滴定板布局的图，其中为了质量控制目的，每周利用阴性和阳性对照测量IgG/IgM/IgA(结合的抗原和肽是透明的)。
[0040]图9为显示IgG、IgM和IgA抵抗健康捐献者和具有胃部自身免疫的患者的细菌脂多糖和闭合蛋白/连蛋白的比较的图。抵抗健康捐献者的细菌脂多糖的IgG、IgM、IgA和IgG+IgM+IgG的升高百分比以左边图中的浅色条块中显示，和具有高于平均值两个标准差的胃部自身免疫的患者以左边图中的深色条块显示。抵抗健康捐献者中的闭合蛋白/连蛋白的IgG、IgM、IgA和IgG+IgM+IgG的升高百分比以右边图中的浅色条块显示，和具有高于平均值两个标准差的胃部自身免疫的患者以右边图中的深色条块显示。
[0041]表I根据本发明的一些方面显示了针对代表第一组的三个健康对象(样品1-3)的环境因素(LPS)、肠和BBB蛋白以及相关抗原的12种不同抗原而测试的IgG、IgM和IgA抗体水平。
[0042]表2根据本发明的一些方面显示了针对代表第二组的三个健康对象(样品4-6)的环境因素(LPS)、肠和BBB蛋白以及相关抗原的12种不同抗原而测试的IgG、IgM和IgA抗体水平。
[0043]表3根据本发明的一些方面显示了针对代表第三组的三个健康对象(样品7-9)的环境因素(LPS)、肠和BBB蛋白以及相关抗原的12种不同抗原而测试的IgG、IgM和IgA抗体水平。
[0044]表4根据本发明的一些方面显示了针对代表具有腹部疾病和肠通透性的三位患者(样品10-12)的环境因素(LPS)、肠和BBB蛋白以及相关抗原的12种不同抗原而测试的IgG、IgM和IgA抗体水平。
[0045]表5根据本发明的一些方面显示了针对代表具有谷蛋白共济失调(glutenataxia)的三位患者(样品13-15)的环境因素(LPS)、肠和BBB蛋白以及相关抗原的12种不同抗原而测试的IgG、IgM和IgA抗体水平。
[0046]表6根据本发明的一些方面显示了针对代表具有多发性硬化症(MS)的三位患者(样品16-18)的环境因素(LPS)、肠和BBB蛋白以及相关抗原的12种不同抗原而测试的IgG、IgM和IgA抗体水平。
[0047]表7根据本发明的一些方面显示了抵抗血液中LPS、闭合蛋白/连蛋白和肌动球蛋白网络的一些抗体的临床说明。
[0048]表8根据本发明的一些方面显示了抵抗口液中LPS、闭合蛋白/连蛋白和肌动球蛋白的升高水平的一些抗体的临床说明。
[0049]表9根据本发明的一些方面显示了抵抗血液中LPS、闭合蛋白/连蛋白、血脑屏障蛋白和神经元抗原的升高水平的一些抗体的临床说明。
[0050]附图详述
[0051]抗原摄取增加是疾病发展的先决条件。已知很多病症都增加肠的通透性并因此增加抗原摄取。有可能自腔摄取免疫原性分子或抗原可导致免疫介导的活性，在肠内以IgA和IgM的形式，和在肠外产生抗原特异性的IgA、IgM、IgG和免疫复合体(26、27)。
[0052]1.细菌毒素和炎性细胞因子对血脑屏障破裂和神经性炎症的诱导的作用
[0053]血脑屏障(BBB)保持中枢神经系统的内部环境和稳定性。对BBB的结构和功能性的改变可导致自身免疫性疾病，特别是神经自身免疫性疾病诸如多发性硬化症(28)。
[0054]BBB分离血液白细胞，其正常地响应来自脑实质的坏死性伤害，在脑实质中，坏死性细胞死亡可响应环境因素诸如感染、毒素、兴奋性中毒或创伤而发生(23)。BBB由两层组成。第一层由微脉管内皮细胞组成，其具有大量紧密连接，与肠上皮细胞的结构类似(24、28)。第二层为胶质界膜，其由胶质足突形成(29)。内皮细胞和星形胶质细胞之间的血管周围间隙由巨噬细胞填充(populate)，其表现得像未成熟的树突细胞(29)。因此，能够打开上皮TJ屏障的因素能够破坏BBB和神经元组织两者(30-33)。这包括细菌内毒素，促炎性细胞因子，酶和效应细胞Thl、Thl7，其对中枢神经系统炎症是必不可少的(29、34-35)。
[0055]确信由内毒素、细胞因子、趋化因子、粘着分子和其他产生的BBB破裂，和自体反应性T-细胞从全身区室(compartment)进入中枢神经系统的运输,对MS损害的发展起到重要作用(36-38)。然而，当在人Thl对Thl7淋巴细胞之间进行比较时，与Thl淋巴细胞相t匕，人Thl7淋巴细胞更快地迁移穿过BBB。确实，大量表达IL-17-和IL-22的CD4+CD45R0+记忆淋巴细胞在它们迁移穿过BBB后，表达了 IL-17+和IL-22+标记，其证实了 Thl 7淋巴细胞在体外和体内穿过BBB的能力(35)。BBB内皮细胞表达IL-17R和IL-22R，其由Thl7淋巴细胞使用，以浸润BBB内皮细胞(ECS)。当IL-17和IL-22被添加至单层人BBB-ECS时，显著增强了细胞或抗原诸如牛血清白蛋白(BSA)——一种大分子——穿过BBB的扩散。BBB-ECS的该增强的通透性与闭合蛋白和连蛋白——两种重要的紧密连接蛋白——表达的降低有相关性(39)。
[0056]这些结果强烈提示由LPS和引起血脑屏障内皮细胞上IL-17和IL-22受体的Thl7淋巴细胞表达的活化的其他细菌毒素诱导的炎症导致Thl 7结合至BBB紧密连接。这破裂了紧密连接，导致Thl 7和自体反应性T细胞穿过BBB的变移，通过Thl 7的粒酶-B的释放，和通过⑶4细胞的干扰素-Y的释放，这产生神经元细胞破坏，释放神经元细胞抗原和BBB蛋白进入循环(通过IL-17和IL-22的作用共表达IL_17、IL_22和粒酶B的细胞)在BBB的诱导和破坏以及BBB对循环的CD4+淋巴细胞和导致CNS炎症的可溶分子的透化作用中起到重要作用(40-44)。Thl 7淋巴细胞在炎性和神经免疫学疾病的发病机理中的作用显示在图2中。基于该作用机制，肠通透性的细菌毒素诱导和BBB蛋白结构的破裂可导致不仅抵抗LPS而且抵抗紧密连接蛋白和BBB蛋白的抗体产生。因此，根据本发明的一些方面的处理(tackle)神经性炎症的步骤开始于测试LPS、闭合蛋白、密蛋白、BBB蛋白、紧密连接蛋白、酶诸如基质金属蛋白酶和相关受体抗体，基于其，临床医生可计划修复胃肠屏障机能障碍，随后是抑制全身炎症并以恢复血脑屏障结束。
[0057]血脑屏障内皮细胞上IL-17和IL-22受体的表达导致Thl7细胞结合至BBB紧密连接。这破裂了紧密连接，导致自体反应性CD4细胞和神经变性。Thl7细胞随后变移通过BBB,使处于通过释放粒酶B杀死神经元的阶段。该神经细胞抗原的释放导致神经性自身免疫和神经变性的恶性循环。
[0058]基于这里提出的信息，假定肠是很多神经变性疾病的起点。它以释放丰富量的脂多糖(LPS)的不均衡小生物群开始。大量LPS内毒素诱导促炎性细胞因子TNF-α和IL-1 β的上调，导致TJ和它们的蛋白——包括闭合蛋白和连蛋白——的降解或分离。随后是行进至BBB的血流中的炎症。该炎症打开ΒΒΒ，引起神经-浸润、神经性炎症、神经性自身免疫和最终神经变性。图3代表了导致神经变性的病理生理学；如果不解决人的肠屏障机能障碍，则人随时间可患神经性炎症和可能的神经变性。很多自身免疫性疾病具有多个引发物(trigger)、症状和系统机能障碍。在神经性自身免疫的情况下，其中很多个体产生对LPS、TJ和对BBB蛋白的高水平的抗体，包括免疫和神经系统。这两个系统的共同点为GI道，已经论述了其重要性(43)。
[0059]因此，在本发明的一些方面中，抵抗TJ蛋白诸如闭合蛋白、细菌内毒素诸如LPS和BBB蛋白的抗体的检测和测量是最好的方式，其不仅估计GI和肠屏障完整性，而且确定和/或诊断全身炎症、神经性炎症、神经侵染和神经变性的根本原因。同时，必须迅速修复肠上皮的任何损害。否则，这将允许膳食蛋白、共生性和病原菌渗透入循环，驱动将导致复杂的自身免疫和神经免疫性疾病的炎性级联反应。
[0060]I1.小糖对大抗原分子的通透性的测暈
[0061 ]目前用于估计肠通透性的方法使用乳酮糖和甘露醇。在过去的40年中，它已经成为有用的临床工具。乳酮糖吸收提示肠屏障的撕裂，和因此提示肠通透性。与普遍的观念相反，该小分子的吸收实际上指示微小渗漏而不是撕裂。乳酮糖具有相对低的分子大小，和该物质通过肠膜的转移不反映食物或其他蛋白的转移，以及针对它们的免疫应答的情况。此夕卜，乳酮糖/甘露醇测试测量了仅小分子转移通过细胞旁途径而不通过跨细胞途径。
[0062]因此，大分子肠通透性鉴定(LMIPI)应利用大分子诸如细菌内毒素(与食物蛋白的大小相当)进行估计，所述大分子为抗原性的并攻击免疫系统。此外，关于BBB通透性，尽管数个证据系已经显示BBB通透性的变化是MS和实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的主要开始因素(45-50)，但目前没有用于测量BBB通透性的公认的血液测试。然而，在动物模型中，已经通过利用连蛋白/闭合蛋白测量屏障损害损伤，证明BBB中的形态学和功能性变化(7、11、28)。
[0063]如图4所示，本发明的方法的重点是具有抗原性的大分子，并且在它们从屏障释放后，其具有攻击免疫系统的能力，导致产生抵抗它们的特异性的IgG、IgM和/或IgA抗体，所述抗体在血液、血清和/或唾液样品中进行检测。
[0064]对大抗原性分子诸如细菌内毒素和膳食蛋白的肠屏障通透性的估计在理解胃肠和自身免疫性疾病的发病机理中变得重要。科学证据指示很多胃肠和自身免疫性疾病通过增加的来自需氧和厌氧细菌的内毒素和其他细菌毒素通过肠壁的异位来完成(7，51-55)。该增加的异位和与它相关的炎症可诱导紧密连接蛋白的降解和随后针对紧密连接蛋白诸如闭合蛋白/连蛋白和细菌内毒素诸如LPS的免疫应答。的确地，暴露于细菌毒素或麦醇溶蛋白的大鼠和人上皮细胞分泌显著量的连蛋白。该连蛋白释放之后是蛋白ZO-1与紧密连接复合体的脱离，这产生通过细胞旁途径的肠通透性(7、51)。并且，很多慢性病症通过抵抗LPS和病原菌的其他抗原的IgA和IgM的血清水平的增加来完成(24、25)。这些病症引起肠炎症和粘膜屏障通透性，由此在肠壁细胞之间扩大的间隙和紧密连接蛋白的解离可诱导肌动球蛋白网络和保护性屏障的损失。该保护性屏障的损失可增加细菌异位并因此提高血清内毒素、紧密连接蛋白和肌动球蛋白的浓度。
[0065]根据本发明的一些方面，抵抗LPS、紧密连接蛋白(闭合蛋白/连蛋白)和肌动球蛋白的增加的血清IgA和IgM指示存在肠屏障通透性和运输大分子穿过屏障。细菌的内毒素可通过用作对T淋巴细胞的超抗原的细菌毒素，或通过被称为分子拟态的机制引起自身免疫。很多细菌具有非常类似于人组织抗原——包括神经元组织——的抗原性位点。如果肠屏障通透性保持非检查，则随后是抗原的炎性级联反应和抵抗它们而产生的抗体将进入变成多种组织，并首先引发炎症和随后引发自身免疫——包括神经性自身免疫。因此，如果允许抗原性肠屏障通透性任其发展，则继续变性可引发全身炎症，随后是诱导抗原性的和细胞的血脑屏障通透性，带来导致神经性炎症、神经侵染和神经变性的伴随的额外免疫反应。
[0066]因此，根据本发明的一些方面，应通过测量抵抗细菌LPS、紧密连接蛋白和肌动球蛋白的IgA、IgG和/或IgM，针对对大抗原性分子的增加的肠通透性的存在，检查具有慢性炎性和自身免疫性疾病的患者。最终，除了测量抵抗LPS和闭合蛋白/连蛋白的IgA、IgG和/或IgM抗体,这些抗体也应针对具有神经免疫性疾病的患者的BBB蛋白、酶、相关受体和神经元抗原进行测量。在图5中说明了该通过细菌毒素TJ降解和产生抵抗释放的TJ蛋白、LPS和其他细菌抗原的抗体的多步骤方法，其产生导致组织损害和自身免疫。[0067]根据本发明的一些方面，抵抗TJ蛋白和LPS的口液中的IgA和IgM和血液中IgG、IgM和IgA的检测和测量将为用于估计肠屏障功能的最好试验，同时LPS、闭合蛋白/连蛋白和其他紧密连接蛋白，加上血液中的BBB蛋白和神经细胞抗体(IgG、IgM和IgA)的检测和测量将为用于估计肠/BBB通透性和神经性自身免疫的最好方法。
[0068]细菌抗原(LPS)诱导紧密连接降解和连蛋白释放，引起打开紧密连接和闭合蛋白和LPS通过紧密连和随后迁移入粘膜下层，在那里闭合蛋白和LPS呈递至巨噬细胞和树突细胞。巨噬细胞将这些抗原呈递至T和B细胞；这之后为异常免疫应答,两者为体液的(抵抗闭合蛋白和LPS的IgA、IgM和IgG抗体)和细胞-介导的。体液的免疫和细胞-介导的免疫之间的该相互作用是最终造成以肠上皮和其他组织抗原为目标的自身免疫过程的原因，导致以自身免疫性疾病为代表的组织损害。
[0069]以下是对于一些测试患者的试验和它们的使用和分析的示例性描述。尽管类似于或等同于本文描述的这些的其他材料和方法可用于本发明的实践或测试，但现在，在试验的示例性描述中描述优选的方法和材料，以进一步根据一些方面说明本发明。
[0070]ELISA 测丨定
[0071]A.材料和方法——平板和样品制备:
[0072]从Sigma-Aldrich, ST.Louis, MO 购买来自大肠杆菌(E.coli) 055:85、大肠杆菌K-235、绿胺假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) >肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) >肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumonia)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、克氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter koseri)的脂多糖,肌动蛋白，肌动球蛋白，髓鞘碱性蛋白和ct-B晶体蛋白。胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)从BoehringerMannheim, Indianapolis, IN购买。同时使用的是连蛋白肽1、2、3、肠ZOT受体、髓鞘碱性蛋白肽87-106、细胞连接蛋白、基质金属蛋白酶-3、在该研究中被命名的SlOO-B的钙结合区、BBB-1 MSELEKAMVA LIDVFHQYSG REGDKHKLKK、BBB_2 SELKELINNE LSHFLEEIKE QEVVDKVMET、BBB-3 LDND⑶GECD FQEFMAFVAM VTTACHEFFE HE、脑 ZOT 结合蛋白-1、_2、钙卫蛋白(MRP-8)和脑ZOT受体。
[0073]具有大于90%纯度的所有HPLC级肽由EZ Biolab of Carmel，IN合成。在该申请中，除非上下文指定相反，则本文说明的所有范围应被解释为包括它们的端点，和开放端范围应被解释为包括商业上的实践值。类似地，所有的数值列表都应被考虑为包括中间值，除非上下文指示相反。
[0074]将抗原和肽以浓度1.0mg/mL溶解在甲醇中，随后以1:100在0.1M碳酸盐-重碳酸盐缓冲液中稀释，PH9.5，并且将50 μ I添加至聚苯乙烯平底ELISA平板的每个孔，如图6所示。
[0075]平板在4°C下温育过夜，并随后用含0.05%吐温20的200 μ I Tris-缓冲盐水(TBS) (ρΗ7.4)清洗三次。通过在TBS中添加200mL的2%牛血清白蛋白(BSA)防止免疫球蛋白的非特异性结合，并将其在4°C下温育过夜。清洗平板并在质量中心(QC)后保持在4°C直到使用。
[0076]酶交联物包括:亲和纯化抗体磷酸酶标记的山羊抗-人IgG (JacksonImmunoResearch, Cat# 109-055-008);亲和纯化抗体憐酸酶标记的山羊抗-人IgA (JacksonImmunoResearch, Cat#109_055_011);和亲和纯化抗体磷酸酶标记的山羊抗-人IgM(Jackson ImmunoResearch, Cat.#109-055-043)。
[0077]如本文进一步描述的，包括在方法中的其他额外的试剂和材料包括:磷酸盐-缓冲盐水粉末(Sigma, Cat#P3813-10PAK)、牛血清白蛋白(Biocell, Cat#3203_00)、叠氮化钠(Sigma, Cat#S-2002)、吐温 20 (Sigma, Cat#P1379_1000ML)、甘油(Sigma,Cat#G5516-500ML)、氢氧化钠(Sigma，Cat#S_5881)、氯化镁(Sigma，Cat#8266)、二乙醇胺(Sigma, Cat#D-8885)、1.0N 盐酸溶液(Sigma，Cat#H3162_lGA)、5mg 底物片剂:p_NPP (磷酸对硝基苯酯)(Sigma，Cat#S-0942)和蒸馏水(D.H2O)。
[0078]微孔平板被制备并包被有12种不同的肠-脑-相关抗原或肽，如图6所示。校准物(calibrator)和阳性对照以及稀释的患者样品被添加至孔，并且识别不同抗原的自身抗体在第一温育期间结合。在清洗孔以去除所有的未结合蛋白后，纯化的碱性磷酸酶标记的兔抗-人IgG/IgM/IgA的未结合交联物通过进一步的清洗步骤去除。
[0079]结合的交联物利用磷酸对硝基苯酯(PNPP)底物可视化，其给出了黄色反应产物，其强度与样品中的自身抗体浓度成比例。氢氧化钠被添加至每个孔，以停止反应。在405nm下读出颜色强度。
[0080]川红(plain red)顶或虎皮红(red tiger)顶(SST管)用于样本收集,尽管在一些方面中，对于该试验考虑其他样本收集装置。
[0081]血液样品利用无菌静脉穿刺技术收集，并且血清利用标准程序获得。在一些方面中，优选最少100微升的血清用于试验，其因此对应于大约Iml或更多的血液。
[0082]B.测试试骀稈序
[0083]现在讨论用于抵抗LPS、肠和/或BBB蛋白的IgG、IgM和/或IgA抗体的分析程序。在一些方面中，允许所有试剂在测试试验开始前达到室温。测试试验程序包括制备具有期望数量和类型的抗原和/或肽的期望数量的包被孔或平板。一旦制备微量滴定孔，则大约100 μ I的1:100稀释的对照校准物被添加至微量滴定板的A和B排，如图7所示，其可利用多通道移液管进行。大约100 μ I的1:100稀释的患者的测试样品——这里是血清，被添加至第一临床样本C和D排的双孔，第二临床样本E和F排的双孔和第三临床样本G和H排的双孔，如图7所示。
[0084]在单独的平板上，进行类似于一式两份临床样本的周期的(B卩，每周)阴性和阳性对照，如图8所示。
[0085]平板随后在室温下温育大约60分钟。在温育后，孔随后被倒空，并利用ELISA洗涤器，用PBS清洗4次。大约100 μ I最佳稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗-人IgA被添加至IgA平板，或大约100 μ I的酶标记的IgG被添加至IgG平板，和抗-1gM以最佳的稀释被添加至IgM平板。
[0086]各个平板随后在室温下温育大约30至大约60分钟。在交联物-温育结束前大约10分钟，底物溶液通过将大约5mg的磷酸对硝基苯酯片剂与大约5ml的底物缓冲液混合制备，其充分混合，直到片剂完全溶解。重复利用ELISA洗涤器，用PBS清洗4次。随后，大约100 μ I的底物溶液被添加至每个孔。该平板随后在室温下温育大约30分钟，避免对直射阳光的任何暴露。通过添加大约50μ I的3Ν NaOH停止反应。孔颜色强度利用微量滴定板读出器在405nm下针对空白孔读出，记录校准物、对照和未知样品的吸光率值。[0087]C.结果计算
[0088]在平板在405nm下读出以获得光密度值(OD4J后，阴性对照的平均0D、阳性对照的平均OD和每个临床样本的平均OD除以A和B排上的校准物的平均0D，以获得每个指数值(IV)。
[0089]针对12种不同的抗原，通过将每个复制样品的平均OD除以校准物对照值的平均OD (例如，将孔Cl和Dl的平均OD除以孔Al和BI的平均0D，将孔C2和D2的平均OD除以孔A2和B2的平均OD，将孔C3和D3的平均OD除以孔A3和B3的平均OD等)，计算每个抗体的指数值(IV)。
[0090]结果随后与确立的参考范围相比较。
[0091]
【权利要求】
1.测试来自人的样品的方法，其包括: 测量源于结合所述样品的第一部分至细菌毒素的第一信号；和 测量源于结合所述样品的第二部分至天然抗原的第二信号，所述天然抗原选自(a)肠相关抗原和(b)血脑屏障相关抗原中的至少一种。
2.权利要求1所述的方法，其中所述细菌毒素包括脂多糖。
3.权利要求2所述的方法，其中所述天然肠相关抗原选自:(1)肠结构蛋白；(2)紧密连接蛋白；(3)对所述紧密连接蛋白的结合受体；和(4)细胞连接蛋白。
4.权利要求3所述的方法，其中所述血脑屏障相关抗原选自:(1)血脑屏障蛋白；(2)胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP) ；(3)基质金属蛋白酶(MMP) ； (4)脑ZOT结合蛋白；(5)脑ZOT受体；(6)钙卫蛋白；和(7)髓鞘碱性蛋白。
5.权利要求2所述的方法，其中所述肠结构抗原包括肌动蛋白/肌动球蛋白。
6.权利要求2所述的方法，其中所述紧密连接抗原选自闭合蛋白和连蛋白。
7.权利要求2所述的方法， 其中所述结合受体包括肠ZOT受体。
8.权利要求2所述的方法，其中所述结构蛋白包括基质金属蛋白酶-3(MMP-3)。
9.权利要求1所述的方法，其中所述血脑屏障相关抗原选自:(1)血脑屏障蛋白；(2)胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP);和(3)基质金属蛋白酶(MMP)。
10.诊断与肠渗漏综合征相关的疾病的方法，其包括: 从实验室定制利用权利要求1所述方法的测试；和 分析所述测试结果。
11.诊断与血脑屏障通透性相关的疾病的方法，其包括: 从实验室定制利用权利要求1所述方法的测试；和 分析所述测试结果。
12.测试平板，其具有作为结合肽的下述:(I)细菌毒素；和(2)包括(a)肠相关抗原和(b)血脑屏障相关抗原中的至少一种的天然抗原。
13.权利要求12所述的测试平板，其中所述肠相关抗原选自:(1)肠结构蛋白；(2)紧密连接蛋白；和(3)对所述紧密连接蛋白的结合受体；和(4)细胞连接蛋白；
14.权利要求13所述的测试平板，其中所述血脑屏障相关抗原选自:(1)血脑屏障蛋白；(2)胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP) ；(3)基质金属蛋白酶(MMP) ； (4)脑ZOT结合蛋白;(5)脑ZOT受体；(6)钙卫蛋白；和(7)髓鞘碱性蛋白。
15.权利要求12所述的测试平板，其中所述血脑屏障相关抗原选自:(1)血脑屏障蛋白；(2)胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP) ；(3)基质金属蛋白酶(MMP) ； (4)脑ZOT结合蛋白;(5)脑ZOT受体；(6)钙卫蛋白；和(7)髓鞘碱性蛋白。
16.协助诊断与解剖学屏障的过度通透性相关的疾病的方法，其包括: 从抗体测试样板获得测试结果，所述抗体测试样板从结合来自所述患者的样品至细菌毒素和选自(a)肠相关抗原和(b)血脑屏障相关抗原中的至少一个的天然抗原而产生信号；和 分析所述测试结果。
17.权利要求16所述的方法，其中所述样品为血液样品。
18.权利要求16所述的方法，其中所述样品为唾液样品。
19.权利要求16所述的方法，其中所述分析所述测试结果的步骤包括在所述测试结果包括IgA、IgM和IgG中的任一个对脂多糖的细菌毒素的阳性结果，和全部IgA、IgM和IgG对闭合蛋白和连蛋白的阴性结果，和IgG对肌动球蛋白的阴性结果的情况下，认为涉及肠道菌群生态失调的诊断是可能的。
20.权利要求16所述的方法，其中所述分析所述测试结果的步骤包括在所述测试结果包括IgA、IgM和IgG中的任一个对脂多糖的细菌毒素的阳性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对闭合蛋白或连蛋白的阳性结果，和IgG对肌动球蛋白的阴性结果的情况下，认为涉及由细菌抗原通过细胞旁途径造成的肠屏障损坏的诊断是可能的。
21.权利要求16所述的方法，其中所述分析所述测试结果的步骤包括在所述测试结果包括全部IgA、IgM和IgG对脂多糖的细菌毒素的阴性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对闭合蛋白或连蛋白的阳性结果，和IgA对肌动球蛋白的阴性结果的情况下，认为涉及由非细菌抗原通过细胞旁途径造成的肠屏障损坏的诊断是可能的。
22.权利要求16所述的方法，其中所述分析所述测试结果的步骤包括在所述测试结果包括IgA、IgM和IgG中的任一个对脂多糖的细菌毒素的阳性结果，和全部IgA、IgM和IgG对闭合蛋白和连蛋白的阴性结果，和IgA对肌动球蛋白的阳性结果的情况下，认为涉及由细菌抗原通过跨细胞途径造成的肠屏障损坏的诊断是可能的。
23.权利要求16所述的方法，其中所述分析所述测试结果的步骤包括在所述测试结果包括IgA、IgM和IgG中的任一个对脂多糖的细菌毒素的阳性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对闭合蛋白和连蛋白的阳性结果，IgA、IgM和IgG中的任一个对血脑屏障蛋白的阳性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对神经元抗原的阳性结果的情况下，认为涉及由所述细菌毒素诱导的肠和血脑屏障完整性损坏的诊断是可能的。
24.权利要求16所述的方法，其中所述分析所述测试结果的步骤包括在所述测试结果包括IgA、IgM和IgG中的每一个对脂多糖的细菌毒素的阴性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对闭合蛋白和连蛋白的阳性结果，IgA、IgM和IgG中的任一个对血脑屏障蛋白的阳性结果，和IgA、IgM和Ig G中的任一个对神经元抗原的阳性结果的情况下，认为涉及由非所述细菌毒素的因素造成的肠和血脑屏障完整性损坏的诊断是可能的。
25.权利要求16所述的方法，其中所述分析所述测试结果的步骤包括在所述测试结果包括IgA、IgM和IgG中的任一个对脂多糖的细菌毒素的阳性结果，和IgA、IgM和IgG中的每一个对闭合蛋白和连蛋白的阴性结果，IgA、IgM和IgG中的任一个对血脑屏障蛋白的阳性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对神经元抗原的阳性结果的情况下，认为涉及肠道菌群生态失调而不损坏肠屏障完整性且损坏血脑屏障完整性的诊断是可能的。
26.权利要求16所述的方法，其中所述分析所述测试结果的步骤包括在所述测试结果包括IgA、IgM和IgG中的每一个对脂多糖的细菌毒素的阴性结果，和IgA、IgM和IgG中的每一个对闭合蛋白和连蛋白的阴性结果，IgA、IgM和IgG中的任一个对血脑屏障蛋白的阳性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对神经元抗原的阳性结果的情况下，认为涉及损坏血脑屏障完整性、神经性炎症和神经性自身免疫而不与肠屏障或肠道菌群生态失调相关的诊断是可能的。
27.权利要求16所述的方法，其中所述分析所述测试结果的步骤包括在所述测试结果包括IgA、IgM和IgG中的任一个对血脑屏障蛋白的阳性结果，和IgA、IgM和IgG中的任一个对神经元抗原的阳性结果的情况下，认为肌萎缩性侧索硬化、帕金森病、多发性硬化症、阿尔茨海默氏病 或周围神经病和重性抑郁症之一的诊断是可能的。
【文档编号】C07K16/12GK103460044SQ201280015809
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年1月26日 优先权日:2011年1月28日
【发明者】A·沃佳达尼 申请人:免疫科学实验室公司