具有降低的效应子功能的Fc变体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生产包含Fc区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质C1q和与至少一种受体FcgγR的结合。
【专利说明】具有降低的效应子功能的Fe变体
发明领域
[0001] 本发明涉及制备展示降低的效应子活性的Fe变体的方法。
_2] 相关领域的描述
[0003]衍生自抗体的疗法在多种病理学病况，例如癌症、自身免疫疾病、移植排斥和传染病的治疗中使用得越来越多。在2010年，超过37种抗体和衍生的蛋白质被批准用于临床使用和超过1137种处于临床开发中，其中71%是完全的IgG。它们中的大多数(91% )含有来自IgG的Fe区并对应于全长单克隆抗体(mAb)或又称免疫粘附素的融合蛋白(ThompsonPharma2010 年 8 月)。
[0004]多个研究显示，抗体的效应子功能对免疫疗法，特别是癌症的治疗的效力至关重要，所述癌症的治疗中寻求破坏细胞靶。能够消灭细胞靶的效应子功能主要涵盖抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。⑶C主要通过Fe结构域与第一补体成分Clq的直接结合触发，而ADCP和ADCC则通过Fe结构域与Fe Y受体(FcyR)的结合触发。抗体的Fe结构域也通过与新生Fe受体(FcRn)的相互作用涉及血清持久性。因此在过去十年中已有大量研究集中在通过提高对FcRn的亲和力增强抗体诱导ADCC和CDC应答的能力和增加其血清半寿期上。
[0005]然而，在一些特定病况的治疗中，ADCCADC和/或ADCP的诱导不是实现治疗效果所必需的。在有些情况下必须避免这些诱导以降低副作用和避免IgG细胞毒性，例如在用抗CD3单克隆抗体orthoclone 0KT3治疗进行的移植排斥的情况下。据显示，orthoclone0KT3的施用诱导促炎性细胞因子的大量全身性释放，这是orthoclone 0KT3与Fe Y受体结合的结构。还显示Fe Y R的活化可能对例如EGFR祀向抗体,西妥昔单抗(cetuximab)的治疗具有负面影响，其被提示活化促肿瘤的M2巨噬细胞和降低患者的无恶化存活(progression-free survival) (Pander J.等人，2011)。
[0006]一般认为，当抗体或免疫粘附素仅当作针对内源或传染性靶的阻断剂或中和剂或作为细胞受体的激动剂或拮抗剂使用时，通过所述抗体或免疫粘附素的Fe区与Fe YR和Clq的结合的免疫系统的募集对免疫疗法的治疗效力不是关键的，甚至因而应避免。
[0007]在这方面,据显示4种人IgG亚类表现出不同的效应子功能。一方面，IgGl和IgG3触发ADCC和⑶C 二者的活性。另一方面，IgG2引起⑶C活性但不引起ADCC，而由于对Clq和Fe Y受体的低亲和力，IgG4展示了极差的诱导补体和细胞活化的能力。因此，IgG4已成为不希望募集宿主效应子功能的免疫疗法的优选亚类。中和性IgG4抗体已被批准用于特定病况的治疗。例如，那他珠单抗(natalizumab)是用于治疗多发性硬化的抗α 4整合素mAb。尽管如此，有关IgG4在免疫疗法中的使用仍然存在一些阻碍，因为其体内不稳定性和动力学。
[0008]作为备选方案，设想了包含氨基酸修饰S228P的IgG4Fc变体。据显示，所述修饰稳定重链二聚体形成 ,伴随低比例(〈8,3%)的仍然可能的Fab臂交换(Labri jn等人,NatureBiotech，2009，27，767-771)。也改造了 IgG杂种以产生具有低效应子功能和改进的药理学谱的新的治疗 mAb (Reddy 等人，The journal of Immunology, 2000,164,1925-1933)。Alexion Pharmaceuticals公司已开发了针对补体组分C5的人源化IgG2 / 4 κ抗体,名为依库丽单抗(Eculizumab)。依库丽单抗的重链在恒定区I (CHl)、铰链区和恒定区2 (CH2)的相邻部分中包含人IgG2序列，在CH2的其余部分和恒定区3(CH3)中包含人IgG4序列。依库丽单抗已被欧洲药品管理局批准用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿和溶血性尿毒综合症。
[0009]基于IgG2和IgG4之间的结构差异，An等人通过在IgG2骨架的对应位置中引入来自IgG4的4个氨基酸(即268Q / 309L1330S / 331S)设想了具有改变的效应子功能的IgG2变体。得到的IgG没有展示出与Clq，Fc YRI和Fe YRIIIa的可检测到的结合并展示出对FcYRIIb / c的弱亲和力，但仍然具有和野生型IgG2相似的血清半寿期(An等人，mAbs,2009, I:6,572-579)。
[0010]此外，对IgGl的Fe区的多个位点特异性和随机诱变研究已导致鉴定了参与IgGl与Clq和多种促ADCC受体的结合的关键氨基酸(综述见Strohl, Current opinion inBiotechnol，2009，20，685-691)。据显示，在下游铰链结构域中的氨基酸，并且特别是第234和235位的亮氨酸残基对于IgGlFc区对Clq, FcyRLFcy RII和Fe y RIII的亲和力至关重要。在CH2结构域中也发现了决定簇位置，例如氨基酸位置327，330和331，其突变可大大降低诱导ADCC和CDC应答的能力。
[0011]因此，Xu等人指出，在基于人IgGl的0KT3抗体中引入突变234A / 235A显著降低了与Fe Y RI，FcyRII和Clq的结合，这避免了使用未修饰的0KT3抗体观察到的细胞因子释放综合症，而同时保留了逆转进行的移植排斥的能力(Xu等人,Cell Immunol, 2000,1:16-26)。
[0012]Hezareh等人在包含突变234A / 235A的抗HIV-1IgGl变体中进行了有关对效应分子的亲和力的 相同的观察(Hezareh 等人，Journal of virology, 2001,12161-12168)。
[0013]同样地，Oganesyan等人描述了在抗CD19IgGl中引入三突变234F / 235E /331S导致与若干效应分子，即FcyRI，Fe Y RIIa和FcyRIII和Clq的结合的完全丧失(Oganesyan 等人 Acta cryst.，2008, D64, 700-704)。
[0014]相似地，InvivoGen公司出售编码包含突变233P / 234V / 235A / 236Del /327G / 330S / 331S的人的改造的IgGlFc变体的质粒。这些突变大大降低了 IgGl Fe变体诱导ADCC和⑶C的能力。
[0015]上述所有这些发明暗示将人氨基酸替换为不预期出现在这些位置上的残基，当在对患者施用的mAb中使用这些残基时将可能引起免疫反应。
[0016]也显示在Fe区第297位的天冬酰胺处的糖基化对单克隆抗体结合Fe Y R和触发ADCC的能力具有直接影响(综述见AbSs等人，Pharmaceuticals, 2010, 3,146-157)。
[0017]尽管在现有技术中描述了展示低ADCC和CDC活性的Fe变体，仍然需要制备展示对Clq和Fe Y受体的降低的亲和力的新的Fe变体的方法。
[0018]发明概沭
[0019]本发明涉及生产包含Fe区的亲本多肽的变体的方法，相比所述亲本多肽，所述变体展示与蛋白质Clq和与至少一种受体Fe YR的降低的结合，其中在亲本多肽的Fe区中引入选自294Del，293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰，Fe区的编号指根据EU索引(如在Kabat中)，或其在Kabat (Kabat编号)中的等同物的编号。
[0020]本发明的另一个目的是包含Fe区的亲本多肽的变体，相比所述亲本多肽，所述变体展示与蛋白质Clq和与至少一种受体Fe Y R的降低的结合，并在其Fe区中包含选自294Del,293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰，Fe区中的氨基酸编号指根据EU索引，或其在Kabat中的等同物的编号。本发明也涉及包含所述变体的药物组合物和所述变体用于预防或治疗病理病况的用途，所述病理病况中不希望诱导ADCC和/或⑶C应答。
[0021]附图简沭
[0022]图1显示了天然的人IgGl序列的第216-447位(根据EU索引)与人IgG2(SEQID NO:7)，人 IgG3(SEQ ID NO:8)和人 IgG4(SEQ ID NO:9)的相应序列的比对。IgGl 序列是Glml，17同种异型(SEQ ID NO:5)和Glm3同种异型(SEQ ID NO:6)。IgGl的“下游铰链-CH2-CH3”结构域从第226位开始(见箭头)。
[0023]图2显示了质粒载体PMGM05-R603，其中将编码源自人IgGl重链的氨基酸残基226-447 (根据EU索引)的人Fe基因(Fc226, SEQ NO:1)克隆进2个限制性位点BamHI和NotI之间。
[0024]发明详沭
[0025]a.定义
[0026]为了能更完全地理解本申请，下面示出若干定义。这些定义旨在涵盖语法等同物。
[0027]在本说明书和权利要求书通篇，在Fe区中的残基的编号是根据在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中描述的 EU 索引的免疫球蛋白重链编号，将上述文献明确引入本文作为参考。本文中的“EU索引”或“如Kabat中的EU索引”指人IgGlEU抗体的残基编号。在Kabat中的等同物指在Kabat编号中的数字。
[0028]本文中使用的“多肽”或“蛋白质”表示至少2个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。
[0029]本文中使用的“氨基酸”表示20个天然存在的氨基酸或可能在特定的定义的位置上存在的任意非天然类似物之一。
[0030]本文中的“氨基酸修饰”表示多肽的氨基酸序列中的改变。也可将“氨基酸修饰”称为“氨基酸改变”，本文中包括在多肽序列中的氨基酸突变，例如替换、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸替换”或“替换”表示将亲本多肽序列中的特别的位置上的氨基酸替代为另一种氨基酸。例如，替换N434S指变体多肽，在此情况下指Fe变体，其中第434位的天冬酰胺被替代为丝氨酸。本文中使用的“氨基酸插入”或“插入”表示在亲本多肽序列中的特别位置上的氨基酸的添加。例如插入G>235-236指在第235和236位之间的甘氨酸的插入。本文中使用的“氨基酸缺失”或“缺失”表示在亲本多肽序列中的特别位置上的氨基酸的去除。E294Del或294Del指删除了在第294位上的氨基酸(此处为谷氨酸)。氨基酸修饰可指点突变或突变的组合。
[0031]在氨基酸突变的组合的情况下，优选的形式如下:294Del / 2591 / 315D / 434Y或E294Del / V259I / N315D / N434Y。这表示与其亲本多肽相比，在变体的Fe区中有4个氨基酸突变:一个在第294位，一个在第259位，一个在第315位，一个在第434位，第294位的氨基酸，即谷氨酸被删除，亲本多肽的第259位氨基酸，即缬氨酸被替代为异亮氨酸，亲本多肽的第315位氨基酸，即天冬酰胺被替代为天冬氨酸，亲本多肽的第434位氨基酸，即缬氨酸被替代为酪氨酸。同样地，氨基酸修饰293Del / 294Del表示相比多肽亲本，在第293和294位上的氨基酸被删除。
[0032]术语“抗体”在本文中在最广泛的意义上使用。“抗体”指至少包含(i)Fc区和(ii)源自免疫球蛋白可变区的结合多肽结构域的任意多肽。因此抗体包括但不限于，全长免疫球蛋白，多特异性抗体，包含至少一个可变区的Fe融合蛋白，合成抗体(本文中有时称为“抗体模拟物”)，包含多于一个Fe区的改造的抗体，嵌合抗体，人源化的抗体，全人抗体，抗体融合蛋白，抗体缀合物和分别地各自的片段。
[0033]本文中使用的“全长抗体”或“免疫球蛋白”表示构成抗体的天然生物学形式的结构，包括可变区和恒定区。“全长抗体”包括单克隆全长抗体、野生型全长抗体、嵌合全长抗体、人源化的全长抗体、全人全长抗体，此列表不是限制性的。
[0034]在包括人和小鼠的大多数哺乳动物中，全长抗体的结构一般是四聚体。所述四聚体由相同的2对多肽链组成，每一对具有一条“轻”链(一般具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(一般具有约50-70kDa的分子量)。在有些哺乳动物中，例如在骆驼和美洲驼中,全长抗体可仅由2条重链组成，每条重链包含与Fe区连接的可变结构域。
[0035]每条链的氨基端部分包括约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别并包含所谓的互补决定区(⑶R)。
[0036]每条链的羧基端部分定义恒定区，其主要负责效应子功能。
[0037]在人免疫球蛋白的情况下,轻链分类为K和λ轻链。重链分类为μ、δ、GAMMA 、α或ε，并分别定义抗体同种型IgM, IgD, IgG, IgA,和IgE0
[0038]本文中使用的“IgG”表示属于基本由公认的免疫球蛋白Y基因编码的抗体类别的多肽。在人中，IgG包含IgGl, IgG2，IgG3,和IgG4亚类或同种型。在小鼠中，IgG包含IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3。全长IgG由相同的2对两条免疫球蛋白链组成，每一对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包含免疫球蛋白结构域VL和CL，每条重链包含免疫球蛋白结构域VH，C Y I (又称CHI)，C Y 2 (又称CH2)和C Y 3 (又称CH3)。在人IgGl的情况下，“CH1 ”指根据EU索引的第118-215位，CH2结构域指第231-340位而CH3结构域指第341-447位，或分别在Kabat编号中的第114-223,244-360和361-478位。IgGl也包含铰链结构域，其在IgGl的情况下指根据EU索引的第216-230位，或Kabat中的226-243。
[0039]本文中使用的“Fe”或“Fe”区表示排除第一恒定区免疫球蛋白结构域的全长免疫球蛋白的恒定区。因此Fe指IgA，IgD,和IgG的后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域，和这些结构域N-端的灵活铰链。对于IgA和IgM，Fe可包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域CH2，CH3和在CHl和CH2之间的下游铰链区。换句话说，IgGl的Fe区由“下游铰链-CH2-CH3”结构域组成，即从氨基酸C226至羧基末端的结构域，其中的编号根据EU索引或是在Kabat中的等同物的编号。通过所述IgG亚类和人IgGl的重链或重链片段的氨基酸序列比对可测定其他IgG亚类的类似结构域。
[0040]本文中使用的“Fe多肽”表示包含所有或部分Fe区的多肽。Fe多肽包括但不限于，抗体、Fe融合物、分离的Fe、Fe缀合物和Fe片段。
[0041]本文中使用的“亲本多肽”或“多肽亲本”表示未修饰的多肽，其随后被修饰以生产变体。所述多肽可包含一个单条多肽链或未共价连接在一起的若干条多肽链。所述亲本多肽可为天然存在的多肽(野生型多肽)，天然存在多肽的变体或改造的形式，或合成的多肽。天然存在多肽的改造的或变体形式是不由天然存在的基因编码的多肽。例如，改造的多肽可为嵌合抗体或人源化的抗体。
[0042]亲本多肽可指多肽自身，或编码其的氨基酸序列。在本发明的上下文中，亲本多肽包含选自野生型Fe区、其片段及其突变体的Fe区。因此，亲本多肽可任选地包含与野生型Fe区相比在其Fe区中先已存在的氨基酸修饰(即Fe突变体)。有利地，亲本多肽为抗体、免疫球蛋白、Fe融合多肽、Fe缀合物，此列表不是限制性的。
[0043]本文中使用的“变体多肽”、“多肽变体”或“变体”表示由于在Fe区中的至少一个氨基酸修饰与亲本多肽序列的多肽序列不同的多肽序列。
[0044]本文中的“野生型或WT”表示在自然界发现的氨基酸序列或核苷酸序列，即其是天然存在的，包括等位变异。WT蛋白质、多肽、抗体、免疫球蛋白、IgG等具有未经分子生物学技术例如诱变有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。例如，“野生型Fe区”包括但不限于，具有序列SEQ ID NO:1的IgGl的Fe区，具有序列SEQ ID NO:2的IgG2的Fe区，具有序列SEQ ID NO:3的IgG3的Fe区，和具有序列SEQ ID NO:4的IgG4的Fe区。
[0045]使用术语“Fe受体”或“FcR”描述结合Fe区(例如，抗体的Fe区)的受体。
[0046]术语“Fcy受体”或“FcyR”指结合IgG抗体的Fe区的人受体。本文中使用的FcyR 包括 Fe Y RI (CD64)，Fe y RII (CD32)，Fe y RIII (CD16)亚类，包括其等位变体和这些受体的可变剪切形式。
[0047]这些Fe Y R也被定义为激活受体(FcyRLFcyRIIa / c,FcyRIIIa / b)或抑制性受体(Fe Y RIIb)，因为其引起或抑制免疫功能。
[0048]Fe y RI家族由3种基因(FCGRIA，FCGRIB和FCGRIC)组成，但只有FCGRIA的产物已被鉴定为全长表面受体。所述产`物，即Fe Y RI，由树突状细胞(DC)、巨噬细胞以及活化的嗜中性粒细胞表达。
[0049]Fe Y RII家族由3种基因(FCGR2A，FCGR2B和FCGR2C)组成，所述基因编码FcyRIIa, Fe Y RIIb和Fe Y RIIc蛋白。Fe Y RIIa在单核细胞、某些树突状细胞和嗜中性粒细胞上表达。Fe Y RIIc在自然杀伤(NK)细胞上表达。Fe Y RIIb是广泛表达的Fcy R。Fe Y RIIb几乎存在于除了 NK细胞和T细胞以外的所有白细胞上。
[0050]Fe y RIII由2个基因FCGR3A和FCGR3B组成，所述基因编码Fe Y RIIIa和Fe Y Rlllb。Fe Y RIIIa蛋白在单核细胞、组织特异性巨噬细胞、树突状细胞、δ / Y T细胞和自然杀伤细胞上作为跨膜蛋白表达。Fe Y RIIIb是在嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞表面上表达的GPI锚定的受体。
[0051]编码Fe Y RIIa的基因的2个等位基因产生在第131位不同的2种变体(低效应器FcyRIIaR131和高效应器Fe Y RIIaH131)。类似地，编码Fe Y RIIIa基因的2个等位基因产生在第158位不同的2种变体(低效应器？(^1?111&?158和高效应器？(^1?111&￥158)。
[0052]引人注意地是，被认为是抗体依赖性细胞毒性的关键介体的NK细胞仅表达Fe Y RIIIa和Fe Y RIIc而不表达其他Fe y R，特别是抑制性的Fe Y RIIb。
[0053]每种Fe Y R蛋白具有对IgG亚类的差异的配体结合偏好和对IgG亚类的不同的亲和力。
[0054]激活的Fe Y R触发多种免疫反应，例如吞噬作用，呼吸爆发和抗原呈递细胞(APC)的细胞因子产生(TNF-α，IL-6)，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和嗜中性粒细胞和NK细胞的脱粒。激活的Fe Y R也在免疫复合物的清除中起重要作用。另一方面，抑制性受体Fe Y RIIb是B细胞内稳态中的关键调节元素。其控制细胞激活的阈值和程度。
[0055]本文中使用的“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC指细胞介导的免疫机制，藉此免疫系统的效应细胞主动地裂解已被特异性抗体结合的靶细胞。ADCC主要由NK细胞介导，但也可由其他免疫细胞，例如嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞介导。一般ADCC由NK细胞的激活引起。NK细胞的激活涉及其Fe受体与IgG的Fe区的结合，所述IgG与靶细胞表面上呈现的抗原结合。这样的相互作用包括NK细胞释放细胞因子和细胞毒性颗粒。为了评估抗体诱导ADCC的能力，可进行在de Romeuf等人Br J Haematol.2008Mar ；140 (6):635-43中描述的测定。
[0056]本文中使用的Clq是具有约460，OOOkDa分子量和被比作郁金香束的结构的六价分子，其中6个胶原“杆”连接6个球状头部区域。Clq与2个丝氨酸蛋白酶Clr和Cls形成复合物Cl，其是补体级联途径的第一组分。
[0057]“补体依赖性细胞毒性”或CDC指在补体存在下裂解靶细胞。经典补体途径的激活通过Clq与抗体的结合起始，所述抗体与其关联抗原结合。为了激活补体级联，Clq必须结合至少2分子的IgGl、IgG2或IgG3，但仅结合I分子IgM。为了评估抗体诱导⑶C的能力，可进行在 Romeuf 等人，Br J Haematol.2008Mar ；140 (6):635-43 中描述的测定。
[0058]在Nimmer jahn 和 Ravetch, Nature reviews Immunology, 2OO8,8, !B4-47 中综述了Fcy受体及其功能。
[0059]在例如Kishore 等人，Immunopharmacology, 2000，49:159-170 和等人Trends Immunol.200930(2):83-90 中综述了 Clq 及其功能。
[0060]本文中使用的“FcRn”或“新生Fe受体”表示结合IgG抗体Fe区且至少部分由FCRN基因编码的蛋白质。如本领域公知的，功能性FcRn蛋白包含2条多肽，通常被称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，重链由FCRN基因编码。FcRn或FcRn蛋白指α -链与β -2-微球蛋白的复合物。 在人中，编码FcRn的基因被称为FCGRT。FcRn涉及母亲至其胎儿的被动体液免疫的转移以及对IgG清除的控制。
[0061]在例如Roopenian, Nature Reviews Immunology, 2007, 7, 715-725 中综述了 FcRn及其功能。
[0062]b.降低Fe结合Clg和Fe Y R的方法
[0063]本发明涉及制备Fe变体的方法，所述Fe变体展示出相比其亲本多肽降低的对Clq和/或对至少一种Fe Y受体的亲和力。
[0064]本 申请人:显示，在野生型和改造的IgG 二者的Fe区中引入单个氨基酸突变能够显著降低所述IgG与蛋白质Clq和Fe Y受体的结合。所述单个突变对应于第294位氨基酸的缺失(下文中称294Del)，氨基酸编号指根据EU索引或在Kabat中的等同物的编号。
[0065]更准确地说，本 申请人:显示，通过在包含野生型Fe区(即具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fe区)的IgGl的氨基酸序列中引入294Del得到的IgGl变体在ELISA测定中不能结合 Clq 蛋白，Fe Y RIIb (又称 CD32b)，Fe Y RIIa(又称 CD32a)，Fe Y RIIIa(又称⑶16a)和Fe Y RI (又称⑶64)，或相比对应的野生型IgGl变体展示降低的结合(见实施例中的II1.2.1和II1.2.2)。引人注目地是，在IgGl多肽中引入294Del突变也能够消除或限制与Clq和Fe Y受体的结合亲和力，所述IgGl多肽初始被改造相比野生型IgGl展示对FcRn提高的亲和力。[0066]例如，相比野生型IgGl，具有突变 294Del/256N / 378V / 383N / 434Y 的 IgGl 变体不能结合Clq和Fe Y R受体。
[0067]相反地，因此具有突变256N / 378V / 383N / 434Y的其IgGl亲本相比野生型IgGl具有提高的结合Clq和Fe YRIIIa的能力。
[0068]相比其包含氨基酸修饰2591 / 315D / 434Y的亲本多肽，变体294Del / 2591 /315D / 434Y得到类似的结果。所述亲本多肽相比IgGl野生型具有类似的结合Clq和FcyRIIIa的能力。
[0069]类似地，294Del，293Del，293Del/ 294Del, 294Del / 256N / 378V / 383N /434Y，294Del / 2591 / 315D / 434Y，294Del / 397M，294Del / 302A,294Del / 434S,294Del / 315D，294Del / 230S，294Del / 307A,294Del/228R, 230S / 315D / 428L / 434Y,294Del / 378V和294Del / 434Y变体相比其对应的亲本多肽展示了降低的与选自Clq和Fe Y受体的至少一种蛋白质的结合。相反地，所述亲本多肽相比野生型IgGl具有提高的结合选自Clq和Fe Y受体的至少一种蛋白质的能力。 申请人:还显示，通过在包含野生型Fe区的IgGl的氨基酸序列中引入294Del得到的IgGl变体展示出相比其对应的亲本IgGl类似的与FcRn的结合。类似的结合旨在指，引入294Del氨基酸修饰，所述突变，仅导致相比其亲本IgGl，变体与FcRn结合的小于35%的改变。小于35%旨在指，小于30%，小于25%，小于20%,小于15%,小于10%和小于5% ο
[0070]期望通过结合Clq和Fe Y R的能力降低，突变294Del的引入可分别影响IgGl变体相比亲本IgGl的⑶C和ADCC活性。
[0071]第293位的氨基酸也是谷氨酸。其缺失导致与第294位的谷氨酸缺失相同的核苷酸和氨基酸序列。因此，变体293Del和294Del是相同的多肽。因此，本发明的第一目的是提供制备包含Fe区的亲本多`肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自Clq和Fe Y受体的至少一种蛋白质的结合，其中在亲本多肽的Fe区中引入选自294Del或293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰，在Fe区中的氨基酸的编号指根据EU索引，或在Kabat中的等同物的编号。
[0072]在优选的实施方案中，变体展示出相比所述亲本多肽降低的与Clq和与至少一种Fcy受体的结合。
[0073]如在标题为“定义”的上文部分中所解释的，亲本多肽指包含Fe区的多肽。所述亲本多肽可为天然存在的多肽(野生型多肽)，天然存在多肽的变体或改造的形式，或合成的多肽。亲本多肽包括但不限于，抗体、Fe融合蛋白、Fe缀合物、Fe衍生的多肽、分离的Fe及其片段。例如，改造的多肽可为嵌合抗体或人源化的抗体。
[0074]亲本多肽的Fe区优选地选自人IgG亚类的野生型Fe区，其片段和其突变体。在本文中，人IgG的Fe区对应“下游铰链”-CH2-CH3结构域。野生型人IgGl的“下游铰链”-CH2-CH3结构域指根据EU索引或在Kabat中的等同物的编号第226位至第447位的氨基酸。通过所述IgG亚类与人IgGl的重链的氨基酸序列比对可测定其他人IgG亚类的类似结构域，如图1中显示。
[0075]人IgG 亚类包含 IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，包括其多种同种异型。IgGl, IgG2, IgG3和 IgG4 的 Fe 区的序列分别对应 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4的序列。[0076]将Fe区片段定义为包含一个或多个源自野生型Fe区的多肽的多肽。所述Fe区的片段优选地包含来自野生型Fe区的至少100个连续的残基。来自野生型Fe区的至少100个连续的残基涵盖所述野生型Fe区的至少140，至少160，至少200，至少210个连续的残基。[0077]如上所述，亲本多肽可包含野生型Fe突变体，即相比野生型Fe区已包含已有的氨基酸突变(例如添加、插入和/或替换)的Fe区。
[0078]如前所述，本文中使用的“变体多肽”或“变体”表示与亲本多肽的多肽序列相差至少一个氨基酸修饰的多肽序列。在目前的情况下，所述至少一个氨基酸修饰必然涵盖选自突变294Del，突变293Del和突变293Del / 294Del的组合的氨基酸修饰。
[0079]根据本发明的变体多肽可展示出相比其亲本多肽降低的与第一补体组分Clq的结合。换句话说，变体对Clq的亲和力比亲本多肽对Clq的亲和力低。
[0080]根据本发明的变体多肽也可展示对至少一种Fe Y受体的亲和力，所述亲和力比其亲本多肽对至少一种Fe Y受体的亲和力低。本文中使用的Fe Y受体包括Fe Y RI，Fe Y RIII 和 Fe Y RH 受体。优选地，至少一种 Fe Y R 选自 Fe y RIIIa, Fe y RIIa, Fe y RI 和Fe Y RIIb0
[0081]在一些实施方案中，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与Clq和Fe YRIIIa的结合。
[0082]在某些实施方案中，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与Clq，Fe YRIIa和FcyRIIIa的结合。
[0083]在其他实施方案中，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与Clq，FcyRIIIa,Fe Y RIIa 和 Fe Y RI 的结合。
[0084]在其他实施方案中，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与Clq，FcyRIIIa,Fe Y RIIa, Fe y RI 和 Fe y RIIb 的结合。
[0085]可通过现有技术熟知的方法例如ELISA测定、流式细胞术和表面等离子共振(SPR)评估与Clq或与任一 Fe Y受体的结合。
[0086]例如，如在实施例的章节III中描述的，通过计算由ELISA测定得到的其特异性信号的比例，可比较本发明的变体与目的蛋白质(例如Clq或FcyR)的结合强度与其亲本多肽与目的蛋白质的结合强度。如本文使用的，如果通过变体的特异性信号除以亲本多肽的特异性信号得到的比例小于0.50，则变体展示出相比其亲本多肽降低的与目的蛋白质例如Clq或Fe Y R的结合，所述特异性信号由ELISA测定法测定。换句话说，变体的特异性信号比其亲本多肽的特异性信号低0.50倍。低于0.50的比例包括低于0.45，低于0.40，低于0.35，低于0.30，低于0.25，低于0.20，低于0.15，低于0.10，低于0.05，低于0.01的比例。
[0087]在优选的实施方案中，所述比例低于0.20。
[0088]ELISA测定的优选形式包括包被目的蛋白质。
[0089]作为替代方案，可通过合适的ELISA测定经测定EC50比较变体及其多肽亲本与目的蛋白质的结合。EC50指提供信号的变体浓度，所述信号代表关于结合的目的蛋白质百分比对变体浓度的log值的曲线的50%饱和。一般认为，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与目的蛋白质的结合如果其EC50比其多肽亲本的EC50高至少1.5倍，。
[0090]也可通过SPR测定解离常数(Kd)评估变体与目的蛋白质的结合亲和力。一般认为，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与目的蛋白质的降低如果其Kd比其多肽亲本的Kd高至少1.5倍。
[0091]变体对Clq或对Fe Y R的亲和力可能太弱以致于无法通过ELISA测定的特异性信号，甚至SPR的Kd或ELISA测定的EC50准确测定，因为结合信号处于背景噪音中或在检测阈值以下。在这样的情况下，认为变体不结合目的蛋白质。
[0092]例如，根据本发明的方法得到的变体可能不结合至少一种Fe YR并展示出降低的与Clq的结合。在本申请的实施例中清楚地说明了这样的变体。
[0093]在一些实施方案中，本发明的变体不结合选自Clq和Fe Y受体的至少一种蛋白质。
[0094] 申请人:显示，引入294Del足以显著削弱变体与Clq和与Fe Y受体的结合。换句话说，为了得到具有适当降低的与Clq和/或Fe Y受体的结合的变体，不需要引入除了294Del以外的突变。
[0095]这样的结果特别惊人，因为据 申请人:所知，现有技术主要描述的展示出降低的与Clq和Fe Y受体的结合的Fe变体相比其多肽亲本在其Fe区中具有至少2个氨基酸修饰。
[0096]在一些实施方案中，突变294Del因此是为了得到所述变体引入亲本多肽的Fe区中的唯一氨基酸修饰。
[0097]在一些其他实施方案中，突变293Del是为了得到所述变体引入亲本多肽的Fe区中的唯一氨基酸修饰。
[0098]在一些另外的实施方案中，氨基酸修饰del293 / del294是为了得到所述变体引入亲本多肽的Fe区中的唯一氨基酸修饰。
[0099]因此，本发明的某些实施方案涵盖生产包含Fe区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质Clq和/或与至少一种受体Fe Y R的结合，其中在亲本多肽的Fe区中引入选自下述的氨基酸修饰:
[0100](i)294del，其中所述氨基酸修饰294del是引入亲本多肽的Fe区中的唯一氨基酸修饰，
[0101](ii)293del，和
[0102](iii)293del/294del,
[0103]Fe区中的氨基酸的编号指根据EU索引，或在Kabat中的等同物的编号。
[0104]本发明的其他实施方案涵盖生产包含Fe区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质Clq和/或与至少一种受体Fe Y R的结合，其中在亲本多肽的Fe区中引入选自下述的氨基酸修饰:
[0105](i)294del，其中所述氨基酸修饰294del是引入亲本多肽的Fe区中的唯一氨基酸修饰，
[0106](ii)293del，其中所述氨基酸修饰293del是引入亲本多肽的Fe区中的唯一氨基酸修饰和
[0107](iii)293del/294del,
[0108]Fe区中的氨 基酸的编号指根据EU索引，或在Kabat中的等同物的编号。
[0109]在特别的实施方案中，本发明的方法提供了与包含E294Del / T307P / N434 Y的变体不同的变体。[0110]不与任何理论结合， 申请人:认为本发明提供的方法不显著导致Fe区中的主要结构重排使得在一些情况下，不由与Clq和Fe Y R结合介导的其他功能相比多肽亲本没有显著改变。引人注目地是， 申请人:显示对多种不同的亲本多肽，在其Fe区中引入突变294Del没有显著削弱其对新生Fe受体(FcRn)的亲和力。例如，IgGl变体256N / 294Del / 378V /383N / 434Y的特异性信号等于其多肽亲本256N / 378V / 383N / 434Y的特异性信号的0.75倍，而IgGl变体307A / 294Del的特异性信号等于其多肽亲本307A的特异性信号的0.97倍。引人注目地是，所述变体展示出相比野生型IgGl提高的与FcRn的结合(见实施例中的表1-4)。换句话说，在一些情况下，Fe多肽亲本和通过本发明的方法得到的变体可显示接近的对FcRn的结合性能。
[0111]如本文使用的，当变体的特异性信号至少等于其亲本多肽的特异性信号的0.6倍时，通过本发明的方法得到的变体具有与其多肽亲本接近的与FcRn的结合，所述特异性信号通过ELISA测定法测定，其中如在实施例的章节III中描述的优选地固定FcRn分子。至少等于0.6倍在本文中旨在指0.6倍，0.65倍，0.70倍，0.75倍，0.80倍，0.85倍，0.90倍和0.95倍。
[0112]如上所述，亲本多肽的Fe区可选自人IgG的野生型Fe区，其片段及其突变体。
[0113]人IgG的野生型Fe区涵盖SEQ ID NO:1的多肽，SEQ ID NO:2的多肽，SEQ ID NO:3的多肽，SEQ ID NO:4的多肽，SEQ ID NO:5的多肽。
[0114]在优选的实施方案中，亲本多肽的Fe区选自来自IgGl和IgG2的野生型Fe区，其片段及其突变体。在更优选的实施方案中，多肽亲本的Fe区是野生型人IgGl的Fe区，其片段及其突变体。
[0115]如上所示，亲本多肽的Fe区可包含已有的选自一个或多个氨基酸的缺失、插入和替换的氨基酸修饰。换句话说，`亲本多肽的Fe区可为野生型Fe区的突变体，优选人IgG，即IgGl, IgG2，IgG3和IgG4的野生型Fe区的突变体。
[0116]在一些实施方案中，多肽亲本的Fe区相比其对应的野生型Fe区包含约I至约20个氨基酸突变，优选地约I至约10个氨基酸突变。
[0117]约I 至约 20 个氨基酸突变涵盖 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，
18，19和20个氨基酸突变。
[0118]多肽亲本的Fe区与其对应的野生型Fe区一般具有至少约90%的氨基酸同一性。至少90 %的氨基酸同一性涵盖至少约90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98%，99%和 99.5%o
[0119]为了测定第一多肽㈧和第二多肽⑶之间的同一性百分比，使用现有技术熟知的方法比对其序列，例如考虑最终缺口(即相比多肽⑶在多肽㈧的序列中存在的最终缺失和插入)的Needleman-Wunsch全局比对算法。可使用EMBL-EBI网站上可获得的比对工具《EMBOSS成对比对算法》，使用以下参数:(i)方法:EMBOSS:Needle (全局)；(ii)缺口延伸:0.5 ； (iii)缺口开放:10.0 ； (iv)分子:蛋白质；(v)矩阵:Blosum62。
[0120]一旦得到全局比对，可通过常规方法测定同一性百分比，优选地用从(A)和(B)的比对中得到的匹配残基数除以在㈧和⑶之间较长的多肽序列中的氨基酸数。
[0121]当亲本多肽包含已有的氨基酸突变时，所述亲本多肽可展示出相比其参考多肽，即包含野生型Fe区的类似多肽一种或多种降低或提高的效应子功能。本文中使用的效应子功能包括但不限于ADCC，ADCP, CDC和与FcRn的结合。
[0122]本领域技术人员可参考以前的研究以根据寻找的效应子功能谱测定可能存在于亲本多肽中的已有的氨基酸突变。例如，亲本多肽可包含在选自Fe区的氨基酸位置227，228，230，231，233，234，239，241，243，246，250，252，256，259，264，265，267，269，270，276，284，285，288，289，301，302，303，305，308，309，311，315，317，320，322，325，327，330，332，334，335，338，340，342，343，345，347，350，352，354，355，356，359，360，361，362，369，370，371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399，400，401，403，404，408，411，412，414，415，416，418，419，420，421，422，424，426，428，433，438，439，440，443，444，445，446和447上的至少一个氨基酸突变，其中在Fe区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。
[0123]亲本多肽也可包含在选自Fe区的氨基酸位置227，228，230，231，233，234，239，241，243，246，250，252，256，259，264，265，267，269，270，276，284，285，288，289，301，302，303，305，307，308，309，311，315，317，320，322，325，327，330，332，334，335，338，340，342，343，345，347，350，352，354，355，356，359，360，361，362，369，370，371，375，378，380，382，383，384，385，386，387，389，390，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401,403,404，408，411，412，414，415，416，418，419，420，421，422，424，426，428，433，434，438，439，440，443，444，445，446和447上的仅一个氨基酸突变，其中在Fe区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。“仅一个氨基酸突变”表示亲本多肽在上述位置上不含有多于一个修饰。例如，亲本多肽在Fe区的第307和434位上不都包含氨基酸修饰。因此，在多肽亲本的Fe区中引入的唯一突变是294Del或293Del的方法的实施方案中，得到的变体在上述氨基酸位置上不能包含多于一个氨基酸突变，特别地变体在Fe区的第307和434位上不都包含氨基酸修饰，在Fe区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。
[0124]因此本发明的某些实施方案涵盖生产包含Fe区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自Clq和Fe Y受体的至少一种蛋白质的结合，其中在亲本多肽的Fe区中引入选 自294Del或293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰，附带条件是得到的变体不包含294Del / T307P / N434Y或293Del / T307P / N434Y突变。
[0125]在其他实施方案中，本发明涵盖生产包含Fe区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自Clq和Fe Y受体的至少一种蛋白质的结合，其中在亲本多肽的Fe区中引入选自294Del或293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰，附带条件是得到的变体不在于294Del / T307P / N434Y或293Del / T307P / N434Y变体。
[0126]本发明的其他实施方案涵盖生产包含Fe区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自Clq和Fe Y受体的至少一种蛋白质的结合，其中在亲本多肽的Fe区中引入选自294Del或293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰，附带条件是亲本多肽的所述变体不包含在于294Del或293Del与在第307和434位上的突变的组合的氨基酸修饰，在Fe区中的氨基酸编号指根据EU索引或在Kabat中的等同物的编号。同样地，多肽亲本可包含或可不包含在从Fe区的第290至292位和从第295至300位上的至少一个氨基酸修饰，其中在Fe区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。
[0127]因此，在一些实施方案中，多肽亲本不包含在从Fe区的第290至292位和从第295至300位的任意氨基酸位置上的氨基酸修饰，其中在Fe区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。
[0128]从第290至292位和从第295至300位的氨基酸位置涵盖第290，291，292，295，296，297，298，299 和 300 位。
[0129]在其他实施方案中，相比野生型Fe区多肽亲本在其Fe区中不包含任何突变。在这样的实施方案中，亲本多肽包含选自人IgG及其片段的野生型Fe区。
[0130]提醒一下，人IgG的野生型Fe区涵盖SEQ ID NO:1的Fe区，SEQ ID NO:2的Fe区，SEQ ID NO:3 的 Fe 区和 SEQ ID NO:4 的 Fe 区。
[0131]在一些其他实施方案中，亲本多肽的Fe区是包含选自434Y，378V，397M，302A，434S, 315D, 230S, 307A, 228R, 230S / 315D / 428L / 434Y, ,2591 / 315D / 434Y 和 256N /378V / 383N / 434Y的至少一个氨基酸修饰的野生型IgG Fe区的变体。
[0132]在某些实施方案中，亲本多肽的Fe区是选自434Y，378V，397M，302A，434S，315D，230S，307A，228R，230S / 315D / 428L / 434Y，259I / 315D / 434Y 和 256N / 378V /383N / 434Y的野生型IgG Fe区的变体。
[0133]在特别的实施方案中，生产包含Fe区的亲本多肽的变体的方法的特征如下，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质Clq和与至少一种受体Fe Y R的结合:
[0134](i)在亲本多肽的Fe区中引入选自294Del，293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰，
[0135](ii)选自294 Del，293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰是为了得到所述变体在亲本多肽的Fe区中引入的唯一氨基酸修饰，和
[0136](iii)亲本多肽的Fe区选自IgG及其片段的野生型Fe区；
[0137]在Fe区中的氨基酸编号指根据EU索引或在Kabat中的等同物的编号。
[0138]在一些实施方案中，在亲本多肽的Fe区中引入选自294Del，293Del和293Del /294Del的氨基酸修饰的步骤包括以下步骤:
[0139](a)提供编码亲本多肽的核酸，
[0140](b)修饰在步骤⑴中提供的核酸以得到编码所述变体的核酸，和
[0141](C)在宿主细胞中表达在步骤(ii)中得到的核酸并回收所述变体。
[0142]在根据本发明的方法的一些实施方案中，在亲本多肽的Fe区中引入的氨基酸修饰是294Del。在其他实施方案中，所述修饰是293Del。
[0143]这样的方法可通过分子生物学常规作法进行。为了实施本发明的方法，本领域技术人员可参考在现有技术中描述的熟知程序，其可见于例如Molecular Cloning-ALaboratory Manual,第三版(Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,2001), The condensed protocols from Molecular cloning:a laboratorymanual(Sambrook, Russell, CSHL Press,2006),和 Current Protocols in MolecularBiology (John ffiley&Sons,2004)?
[0144]亲本多肽的核酸可为市售的或可通过分子生物学或化学合成的经典程序得到。可通过使用现有技术中已知的多种方法修饰亲本多肽的核酸取得如在步骤(b)中提到的编码变体的核酸。这些方法包括但不限于定点诱变、随机诱变、PCR诱变和盒式诱变。
[0145]考虑到其在宿主细胞中的表达，可将编码所述变体的核酸掺入表达载体中。
[0146]表达载体一般包括有效连接的，即置于与控制或调控序列、可选择标签、任意融合伙伴，和/或额外的元件的功能关系中的蛋白质。可通过在合适的条件下，培养用核酸，优选含有编码变体的核酸的表达载体转化的宿主细胞以诱导或导致蛋白质的表达，产生本发明的变体。可使用多种合适的宿主细胞系，包括但不限于哺乳动物细胞、植物细胞、细菌、昆虫细胞和酵母。也可在无细胞翻译系统中实现体外合成，所述无细胞翻译系统包括但不限于来自兔网织红细胞、小麦胚芽和大肠杆菌的提取物。
[0147]例如，在可从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)获得的ATCC细胞系目录中描述了可使用的多种哺乳动物细胞系。宿主细胞可为，但不限于，YB2 / 0(YB2 / 3HL.P2.GI1.1GAg.20细胞，保藏在美国模式培养物保藏所，ATCCnOCRL-1662), SP2 / O, YE2 / 0,1R983F, Namalwa, PERC6, CHO 细胞系，特别是 CH0-K-1，CHO-LeclO, CHO-Lecl, CH0Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, ffil-2, Jurkat, Vero, Molt-4，COS-7, 293-HEK, BHK, KGH6, NSO, SP2 / 0_Agl4，P3X63Ag8.653，C127, JC, LA7, ZR-45-30，hTERT，NM2C5，UACC-812等等。将外源核酸引入宿主细胞的方法是本领域熟知的，并将根据使用的宿主细胞而变化。
[0148]宿主细胞可属于转基因非人动物或转基因植物自身。在这种情况下，因此从转基因生物得到变体。
[0149]可通过将想要的基因直接注射进受精卵得到转基因非人动物(Gordon等人，1980Proc Natl Acad Sci USA.;77:7380-4)。转基因非人动物包括小鼠、兔、大鼠、山羊、母牛、牛或家禽等等。可通过将想要的基因引入胚胎干细胞并通过聚集嵌合体法或注射嵌合体法制备动物得到具有想要的基因的转基因非人动物(Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) ；GeneTargeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993))。胚胎干细胞的例子包括小鼠(Evans和Kaufman，1981 ,Nature ；292:154-156)、大鼠、山羊、兔、猴、家禽、家畜等等的胚胎干细胞。此外，也可使用克隆技术制备转基因非人动物，其中将引入想要的基因的细胞核移植入无核的卵(Ryan等人，1997Science ；278:873-876 ；Cibelli等人，1998Science，280:12`56-1258)。可通过将编码变体分子的DNA引入通过上述方法制备的动物，由此在动物中形成和积累变体分子，然后收集动物中的多肽变体来生产多肽变体。可使多肽变体在动物的乳、卵等中形成和积累。
[0150]在所有上述实施方案中，亲本多肽可为天然存在的多肽(野生型多肽)，天然存在多肽的变体或改造的形式，或合成的多肽。
[0151]在一些实施方案中，亲本多肽选自Fe融合蛋白、Fe缀合物和抗体。
[0152]如本文中所使用的，Fe融合蛋白的Fe缀合物由与伙伴连接的Fe区组成。Fe区与伙伴的连接可具有或不具有间隔子区。
[0153]根据本发明，Fe融合蛋白是由单个基因编码的蛋白质，并包含与Fe区连接的蛋白质、多肽或小肽。Fe融合蛋白任选地包含肽间隔子区。几乎任意蛋白质或小肽可与Fe区连接生成Fe融合物。蛋白质融合伙伴可包括但不限于，受体的靶结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或一些其他蛋白质或蛋白质结构域。
[0154]特别地，Fe融合蛋白可为免疫粘附素，即组合了异源“粘附”蛋白质(即受体、配体或酶)的结合结构域和免疫球蛋白恒定结构域的片段(即Fe区)的抗体样蛋白质(有关免疫粘附素的综述见 Ashkenazi A, Chamow SM.1997, Curr Opin Immunol.；9 (2):195-200)。[0155]小肽可包括但不限于将Fe融合物引导至治疗靶的任意治疗剂。
[0156]根据本发明，Fe缀合物由Fe区与缀合伙伴的化学偶联形成，并任选地包含连接Fe区和缀合伙伴的间隔子区。缀合伙伴可为蛋白质或非蛋白质。偶联反应一般使用Fe区上的和缀合伙伴上的官能团。
[0157]合适的缀合伙伴包括但不限于，治疗多肽、标签(标签的例子见下文)、药物、细胞毒性剂、细胞毒性药物(例如化学治疗剂)、毒素和这些毒素的活性片段。合适的毒素及其相应片段包括但不限于，白喉A链、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链等等。细胞毒性剂可为能够直接与Fe变体缀合或通过与Fe变体共价附着的螯合剂螯合的任意放射性核素，其。在额外的实施方案中，缀合伙伴可选自卡里奇霉素，auristatin，格尔德霉素，美登素，和倍癌霉素和类似物。
[0158]如上所述，本文中在最广泛的意义上使用术语“抗体”。根据本发明，“抗体”指至少包含(i)Fc区和(ii)源自免疫球蛋白的可变结构域的结合多肽结构域的任意多肽。所述结合多肽结构域能够特异性地结合一种给定的靶抗原或一组靶抗原。源自免疫球蛋白的可变结构域的结合多肽结构域包含至少一个或多个⑶R。在本文中，抗体包括但不限于全长抗体、多特异性抗体、包含至少一个可变区的Fe融合蛋白或合成抗体(本文中有时称为“抗体模拟物”)、抗体融合蛋白、抗体缀合物和分别各自的片段。
[0159]包含至少一个可变区的Fe融合蛋白意为包含⑴Fe区和(ii)源自免疫球蛋白的可变结构域的结合多肽结构域的经改造的蛋白质。特别感兴趣的是这样的抗体，所述抗体包含(a)本发明的Fe变体，和(b)以下源自免疫球蛋白可变区的结合多肽结构域中的一种(即其包含至少一个CDR):⑴由VL, VH, CL和CHl结构域组成的Fab片段，(ii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段，(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)分离的⑶R区，(v)F(ab' ) 2片段，包含2个连接的Fab片段的二价片段，(vi)单链Fv分子(seFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许2个结构域缔合形成抗原结合位点，(vii)双特异 性单链Fv和(viii)通过基因融合构建的“双抗体”或“三抗体”，多价或多特异性片段，此列表不是限制性的。
[0160]本文中的“全长抗体”意为具有抗体的天然存在的生物学形式的抗体，包括可变和恒定区。全长抗体可为野生型抗体，野生型抗体的突变体(例如包含已有的修饰)，野生型抗体的经改造的形式(例如嵌合的，人源化的抗体或全人抗体，见下文)，此列表不是限制性的。众所周知，全长抗体的结构一般是四聚体，一些哺乳动物例外，例如美洲驼和骆驼，其中一些免疫球蛋白是二聚体。
[0161]全长抗体的脚手架组分可为来自不同物种的混合物。这样的抗体变体可为嵌合抗体和/或人源化的抗体。一般地，“嵌合抗体”和“人源化的抗体”都指组合了来自多于一种物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包含来自非人动物，一般是小鼠(或有时是大鼠)的可变区和来自人的恒定区。多数情况下，人源化的抗体是含有最少的源自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。通常在人源化的抗体中，除了 CDR以外，整个抗体由人来源的多核苷酸编码，或除了其CDR中以外与人抗体相同。由来源于非人生物的核酸编码的一些或全部CDR被移植进人抗体可变区的β -片层框架中以产生抗体，所述抗体的特异性由植入的CDR决定。制备这样的抗体的方法是周所周知的并在例如W092 /11018 ;Jones，1986，Nature321:522-525 ；Verhoeyen 等人，1988，Science239:1534-1536,Tsurushita&Vasquez，2004， Humanization of Monoclonal Antibodies， MolecularBiology of B Cells，533-545，Elsevier Science (USA))中描述。
[0162]如本文中使用的，“全人抗体”或“完全的人抗体”指完全包含来源于人基因的序列的抗体。有些情况下，这可为人抗体，所述人抗体具有源自人染色体的具有上述修饰的抗体基因序列。可选地，抗体的组分可为人的，但不来源于单个基因。因此，例如，来自一种抗体的人CDR可与来自一种或多种人抗体的序列，例如脚手架序列组合。例如，可组合多个种系序列以形成人抗体或人脚手架。
[0163]在本发明的范围内也包括包含共价修饰的全长抗体。这样的修饰包括但不限于糖基化、标记和缀合。
[0164]标记指可检测的标签和全长抗体的偶联。如本文中使用的，标签包括但不限于:a)同位素标签，其可为放射性的或为重同位素；b)磁性标签(例如磁性颗粒)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料，例如发色团、磷光体和荧光团；酶基团(例如辣根过氧化物酶、β_半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化的基团jPf)由第二报告物识别的预先确定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列，第二抗体的结合位点，金属结合结构域，表位标签
坐坐^
寸寸/ ο
[0165]缀合指全长抗体与多肽或非肽分子，例如受体的靶结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子、药物、细胞毒性剂(例如化学治疗剂)或毒素的偶联。
[0166]在某些实施方案中，多肽亲本选自嵌合免疫球蛋白、人源化的免疫球蛋白、全人免疫球蛋白，免疫球蛋白优选`地选自IgG并且任选地是被缀合或被标记的。
_7] c.发明的变体
[0168]本发明的另一个目的是包含Fe区的亲本多肽的变体，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自蛋白质Clq和受体Fe Y R的至少一种蛋白质的结合，并相比其多肽亲本的Fe区在其Fe区中包含选自294Del，293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰。所述变体可通过本发明的方法得到。
[0169]所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自蛋白质Clq和受体Fe Y R的至少一种蛋白质的结合，并相比其多肽亲本的Fe区在其Fe区中包含选自294Del，293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰。
[0170]在一些实施方案中，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与Clq和至少一种Fcy受体的结合。
[0171]在一些实施方案中，相比亲本多肽的Fe区，突变294Del是变体的Fe区含有的唯
一突变。
[0172]在其他实施方案中，相比亲本多肽的Fe区，突变293Del是变体的Fe区含有的唯
一突变。
[0173]在一些其他实施方案中，相比亲本多肽的Fe区，氨基酸修饰293Del / 294Del是变体的Fe区含有的唯一修饰。
[0174]所述变体的结构和功能性质直接来自用于制备其的方法的特征，所述方法在标题为“降低Fe与Clq和Fe Y R的结合的方法”的部分b.中完整地描述。
[0175]应当强调，一般可从亲本多肽的性质推断出变体的性质，除了关于与Clq和Fe Y受体的结合以外，因为变体与Clq和Fe YR的结合是由第294位和/或第293位上的氨基酸修饰控制的。
[0176]因此，在一些实施方案中，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与Clq和与选自 Fe Y RIIIa, Fe y RIIa, Fe y RI 和 Fe y RIIb 的至少一种 Fe Y 受体的结合。
[0177]如本文使用的，如果通过用变体的特异性信号除以亲本多肽的特异性信号得到的比例小于0.5，则所述变体展示出相比其亲本多肽降低的与目的蛋白质例如Clq或Fe Y R的结合，所述特异性信号通过ELISA测定法测定。换句话说，变体的特异性信号至多等于其亲本多肽的特异性信号的0.5倍。
[0178]相比野生型Fe区，变体的Fe区可包含除了 294Del和293Del以外的一个或多个氨基酸修饰。通常，相比其对应的野生型Fe区，变体的Fe区包含从约I至约21个氨基酸修饰，优选地从约I至约11个氨基酸修饰，所述修饰包括294061，293061或293061 / 294Del。
[0179]与亲本多肽类似，相比野生型Fe区，变体可还包含在选自Fe区的氨基酸位置227，228，230，231，233，234，239，241，243，246，250，252，256，259，264，265，267，269，270，276，284，285，288，289，301，302，303，305，308，309，311，315，317，320，322，325，327，330，332，334，335，338，340，342，343，345，347，350，352，354，355，356，359，360，361，362，369，370，371，375，378，380，382，383，384，385，386，387，389，390，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，403，404，408，411，412，414，415，416，418，419，420，421，422，424，426，428，433，438，439，440，443，444，445，446和447上的至少一个氨基酸修饰，其中在Fe区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。
[0180]相比野生型Fe区，变体可还包含在选自Fe区的氨基酸位置227，228，230，231，233，234，239，241，243，246，250，252，256，259，264，265，267，269，270，276，284，285，288，289，301，302，303，305，307，308，309，311，315，317，320，322，325，327，330，332，334，335，338，340，342，343，345，347，350，352，354，355，356，359，360，361，362，369，370，371，375，378，380，382，383 ，384，385，386，387，389，390，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，403，404，408，411，412，414，415，416，418，419，420，421，422，424，426，428，433，434，438，439，440，443，444，445，446和447上的仅一个氨基酸修饰，其中在Fe区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。“仅一个氨基酸突变”意为变体在上述位置上不含有多于一个修饰。例如，相比野生型Fe区，变体在Fe区的第307和434位上不都含有氨基酸修饰。因此，在本发明的某些实施方案中，变体不含有在于294Del / T307P/N434Y或293Del / T307P / N434Y的氨基酸修饰。在本发明的特别的实施方案中，变体不在于294Del / T307P / N434Y20 或 293Del / T307P / N434Y 变体。
[0181 ] 在本发明的其他实施方案中，变体不包含在于294del或293del和第307和434位的突变的组合的氨基酸修饰。因此本发明的实施方案在于包含Fe区的亲本多肽的变体，其相比所述亲本多肽与蛋白质Clq和与至少一种受体Fe Y R，且相比其多肽亲本的Fe区在其Fe区中包含选自294Del，293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰，附带条件是所述亲本多肽的变体不包含在于294del或293del和第307和434位的突变的组合的氨基酸修饰。
[0182]在一些实施方案中，本发明的变体在Fe区中还至少包含选自378V，434Y，397M，302A, 434S, 315D, 230S, 307A, 228R, 230S / 315D / 428L / 434Y，259I / 315D / 434Y 的氨基酸修饰和氨基酸修饰256N / 378V / 383N / 434Y。
[0183]在一些特别的实施方案中，本发明的变体的Fe区是野生型IgG Fe区的变体，其包含选自 Fe 区的 294Del，293Del，293Del / 294Del, 294Del / 256N / 378V / 383N /434Y，294Del / 2591 / 315D / 434Y，294Del / 397M，294Del / 302A,294Del / 434S,294Del/315D，294Del / 230S，294Del / 307A，294Del / 228R, 230S / 315D / 428L / 434Y,294Del / 378V和294Del / 434Y的至少一个突变，其中在Fe区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。
[0184]同样地，相比野生型Fe区，变体可包含或可不包含在从Fe区的第290至292位和从第295至300位的任一位置上的一个氨基酸修饰，其中在Fe区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。
[0185]在某些实施方案中，相比野生型Fe区，变体在其Fe区中不包含除了 294Del或293Del以外的可降低与Clq和与至少一种Fe Y R的结合的任意突变。
[0186]在其他实施方案中，相比野生型Fe区，变体在其Fe区中不包含除了 294Del或293Del以外的任意突变。
[0187]在一些实施方案中，变体的Fe区源自IgG的野生型Fe区。
[0188]在一些其他实施方案中，变体的Fe区选自IgG野生型Fe区的变体的组，所述组由 293Del，294Del，293Del / 294Del，378V / 294Del，434Y / 294Del,294Del / 397M,294Del/302A，294Del/434S，294Del / 315D，294Del / 230S，294Del / 307A，294Del /228R,230S / 315D / 428L / 434Y，259I / 315D / 434Y / 294Del 和 256N / 378V /383N / 434Y / 294Del组成，其中氨基酸编号指EU索引或在Kabat中的等同物的Fe氨基酸编号。
[0189]在其他实施方案中，变体选自Fe融合蛋白、Fe缀合物和抗体。
`[0190]在一些实施方案中，变体是选自嵌合免疫球蛋白、人源化的免疫球蛋白和全人免疫球蛋白的抗体，免疫球蛋白优选地在IgG中选择。
[0191]本发明的另外的目的是编码如上定义的变体的分离的核酸。本发明也涉及包含编码所述变体的核酸的载体和包含所述载体的宿主细胞。在优选的实施方案中，编码所述载体的核酸已被稳定地整合进宿主细胞的基因组中。本发明也涉及非人转基因动物，其包含稳定整合在其基因组中的所述核酸或所述载体。
[0192]d.根据本发明的方法和变体的用途
[0193]本 申请人:显示，Fe区的突变294Del大大削弱了 Fe变体对Clq和对Fe Y受体例如Fe Y RI，Fe Y RIIa，Fe Y RIIb和Fe Y RIIIa的亲和力。对这些效应分子的亲和力的降低如此重大，以致于在某些情况下，通过常规ELISA测定法在体外无法观察到Fe变体与Clq和/或与某些Fe Y R的结合。Fe区与Clq的结合对体内诱导⑶C是基本的。同样地，Fe区与Fe Y RIIa和Fe Y RIIIa的结合是体内诱导ADCC和ADCP的关键步骤。
[0194]因此，由于其对Clq的低亲和力，预期本发明的变体没有⑶C活性或相比其亲本多肽和一般地相比包含没有突变294Del或突变293Del的Fe区的多肽，所述变体诱导显著较低的体内⑶C应答。同样地，由于其对某些Fe Y R(特别是Fe Y RIIa和Fe Y RIIIa)的低亲和力，预期本发明的变体相比其亲本多肽和一般地相比包含没有突变294Del或突变293Del的Fe区的多肽没有ADCC活性或诱导显著较低的体内ADCC应答。预期在体外⑶C和ADCC测定中也有相同的结果。
[0195] 申请人:确实已经显示，通过在包含野生型Fe区(即具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fe区)的IgGl的氨基酸序列中引入294Del得到的IgGl变体不展示，或展示降低的ADCC和/或CDC活性。
[0196]引人注目地，在最初改造的相比野生型IgGl展示对FcRn提高的亲和力的IgGl多肽中引入突变294Del也使得能够限制或消除ADCC和/或⑶C活性，同时优先地保留对FcRn的亲和力。
[0197]例如，具有突变294Del / 256N / 378V / 383N / 434Y 的 IgGl 变体不展示 ADCC和CDC活性，但展示至少与其IgGl亲本类似的对FcRn的亲和力(见实施例章节III和IV中的ELISA和SPR结果)。
[0198]变体294Del / 2591 / 315D / 434Y 相比其包含氨基酸修饰 2591 / 315D / 434Y的亲本多肽得到类似的结果。
[0199]由于其效应子活性谱，本发明的变体可用于广泛的科学领域。特别地，本发明的变体可用作研究试剂、诊断剂或治疗剂。
[0200]例如可用荧光团或用同位素例如铟-111或锝-99m标记变体并用于体内影像，因为在这样的应用中不需要激活ADCC或CDC。
[0201]当用作治疗剂时，可使用变体运送治疗剂例如放射性核素、毒素、细胞因子或酶至靶细胞，例如癌细胞。在此情况下，变体可为抗体和细胞毒性剂之间的缀合物，并且其治疗活性依赖于细胞毒性剂(例如Gilliland等人，PNAS，1980，77，4539-4543)。
[0202]多肽变体也可作为靶分子的阻断剂或中和剂发挥作用，但不杀死具有靶抗原的细胞。其也可激动、拮抗或抑制靶分子。
[0203]在这些情况下，靶细胞的消耗是不理想的并可被认为是副作用。例如，抗⑶4抗体阻断T细胞上的CD4受体的能力使其成为有效的抗炎剂，但其募集Fe Y R的能力也导致针对靶细胞的免疫攻击，导致T细胞消耗。效应子功能对经放射性标记的抗体(被称为放射性缀合物)和与毒素缀合的抗体(被称为免疫毒素)也可以是问题。这些药物可用于破坏癌细胞，但是通过Fe与Fe Y R的相互作用募集免疫细胞将健康的免疫细胞带到致命的有效负荷(放射物或毒素)附近，导致正常淋巴组织连同被靶向的癌细胞一起消耗。 申请人:显示，根据本发明的变体尽管展示了改变的与Clq和与至少Fe Y受体的结合，其显示了类似的其他功能特征，例如抗原识别或FcRn亲和力。因此不干扰其他重要的抗体性能，例如抗体稳定性、结构完整性或与其他重要的Fe配体例如FcRn和蛋白质A和G相互作用的能力。
[0204]靶分子可为任意类型，并且包括外源和内源分子。靶分子(当多肽变体是抗体时也称抗原)包括但不限于，病毒、细菌和真菌蛋白，朊病毒，毒素，酶，膜受体，药物和可溶性蛋白质。
[0205]膜受体包括但不限于，RhD抗原，CD3，CD4，CD19，CD20，CD22，CD25，CD28，CD32B，CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD71 (转铁蛋白受体)，CD80, CD86, CTLA-4，CD147, CD160,CD224，生长因子受体，如属于 ErbB 家族的受体 ErbBl，ErbB2, ErbB3, ErbB4 (EGFR, HER2 /neu，HER3，HER4)，VEGF-Rl，VEGF-R2，IGF-Rl，PIGF_R，MHCI 型和 MHCII 型分子，例如 HLA-DR，I型干扰素受体，白介素受体如IL-1R，IL-2Ra，IL-2R0和IL_2Ry，IL-6R，激素受体如MUllerian抑制物质II型受体，LDL受体，NKp44L，趋化因子受体如CXCR4，CCR5, TNFR,⑶137，整合素 。粘附分子如⑶2，ICAM，EpCAM,，G蛋白偶联受体。
[0206]膜蛋白也包括肿瘤标记物如0)2，0)3，0六125，1^(:-1，1^(:-16，癌胚抗原(CEA)，Tn，糖蛋白72，PSMA, HMW-MAA其他蛋白质例如DC细胞特异性的BDCA-2，胰高血糖素样肽(例如，GLP-1，等等)，酶(例如，葡糖脑苷脂酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，α-半乳糖苷酶-A，agalsidase α和β , a-L-艾杜糖醒酸酶,丁酰胆碱酯酶,几丁质酶,谷氨酸脱羧酶,伊米苷酶，脂肪酶，尿酸酶，血小板激活因子乙酰基水解酶，中性内肽酶，髓过氧化物酶，等等)，白介素和细胞因子结合蛋白(例如，IL-lSbp, TNF结合蛋白，等等)，巨噬细胞激活因子，巨噬细胞肽，B细胞因子，T细胞因子，蛋白质Α，变态反应抑制剂，细胞坏死糖蛋白，免疫毒素，淋巴毒素，肿瘤坏死因子，肿瘤抑制剂。
[0207]可溶性蛋白质包括但不限于，细胞因子例如IL-1 β，IL-2，IL_6，IL-12，IL-23，TGF β , TNF a , IFN Y ,趋化因子，生长因子如 VEGF, G-CSF, GM-CSF, EGF，PIGF，PDGF，IGF,激素和抑制性抗体例如FVIII抑制性抗体，转移生长因子，α-l抗胰蛋白酶，白蛋白，α-乳白蛋白，载脂蛋白Ε,红细胞生成素，闻度糖基化的红细胞生成素，血管生成素，血红蛋白，凝血酶，抗凝血酶III，凝血酶受体激活肽，血栓调节蛋白，因子VII，因子Vila，因子VIII，因子IX，因子XIII，血纤维蛋白溶酶原激活因子，纤维蛋白结合肽，尿激酶，链激酶，水蛭素，蛋白质C，C反应蛋白，B细胞激活因子受体，受体拮抗剂(例如，ILl-Ra)，补体蛋白，Cl，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，因子H，因子I，因子P，其他蛋白质例如CSAP，⑶137配体，凝集素，唾液酸化的蛋白质。
[0208]根据本发明的变体可用于微生物毒素中和(例如破伤风毒素或炭疽)或预防病毒感染例如肝炎，由乳头瘤病毒或呼吸道合胞体病毒介导的感染。根据本发明的中和变体也可用在中毒的情况下使用。最后，根据本发明的中和变体也可针对自身抗原例如VEGF用于治疗癌症或其他病理学，例如由于年龄的黄斑变性。
[0209]根据本发明的变体也可用于拮抗膜受体例如细胞因子受体、生长因子受体、整合素。例如所述变体可用作移植中的免疫抑制剂，例如可抑制T淋巴细胞增殖的抗IL-2R(⑶25)。所述变体 也可用于限制炎性过程(炎性肠病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎)，例如在类风湿性关节炎的情况下针对IL-6受体α链的抗体。本发明的变体也可用于抑制肿瘤生长，例如抗EGFR抗体或抗HER-2受体抗体。根据本发明的抗整合素变体也可用于限制血栓形成，例如急性冠脉综合症，或用于治疗银屑病。在其他实施方案中，根据本发明的变体也可用于治疗多发性硬化。
[0210]因此本发明的变体可用作靶分子的中和剂、拮抗剂或激动剂，用于治疗或预防癌症、炎性病症、传染病、自身免疫疾病或中毒。
[0211]本文中的“自身免疫疾病”包括同种异体胰岛移植排斥、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合症、自身免疫性阿狄森氏病、抗嗜中性粒细胞胞质自身抗体(ANCA)、肾上腺的自身免疫疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、自身免疫性嗜中性粒细胞减少、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少、自身免疫性荨麻疹、白塞氏病(Behcet’ s disease)、大疱性类天疱疮、心肌症、卡斯尔曼综合症(Castleman’ ssyndrome)、celiac spruce、皮炎、慢性疲劳免疫功能紊乱综合症、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、Churg-strauss综合症、瘢痕性类天疱疮、CREST综合症、冷凝集素病、克罗恩氏病、皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合性冷球蛋白血症、因子VIII缺陷、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病(Grave’ s disease)、Guillain-Barre、古德帕斯丘综合症(Goodpasture’s syndrome)、移植物抗宿主病(GVHD)、桥本氏甲状腺炎、A型血友病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、IgM多发性神经病、免疫介导的血小板减少、青少年关节炎、)11崎病、扁平苔藓、红斑狼疮、美尼尔氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化、I型糖尿病、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合症、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、银屑病、银屑病性关节炎、Reynauld现象、莱特尔氏综合症(Reiter’ s syndrome)、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、Siorgen综合症、实体器官移植排斥、僵人综合症、全身性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓性血小板减少性紫癜、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎例如疱疹样皮炎、血管炎、白癜风、和韦格纳肉芽肿病(Wegner’ sgranulomatosis)。
[0212]本文中的“炎性病症”包括急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性脓毒性关节炎、佐剂性关节炎、变应性脑脊髓炎、变应性鼻炎、变应性血管炎、变态反应、哮喘、动脉粥样硬化、由慢性细菌或病毒感染的慢性炎症、慢性阻塞性肺病(COPD)、冠状动脉疾病、脑炎、炎性肠病、炎性骨质溶解、与急性和延迟的超敏反应相关的炎症、与肿瘤相关的炎症、外周神经损伤或脱髓鞘病、与组织创伤例如烧伤和局部缺血有关的炎症、由脑膜炎引起的炎症、多器官损伤综合症、肺纤维化、败血症和败血性休克、Stevens-Johnson综合症、未分化关节病和未分化脊柱关节病。
[0213]本文中的“传染病”包括由病原体例如病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫引起的疾病。传染病可由包括腺病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、Epstein-Barr病毒、汉坦病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、I型单纯性疱疹病毒、II型单纯性疱疹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、乳多空病毒、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞体病毒、牛瘟病毒、鼻病毒、轮状病毒、风疹病毒、SARS病毒、天花病毒、病毒性脑膜炎病毒等病毒导致。传染病也可由包括炭疽杆菌(Bacillusantracis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、破伤风杆菌(Clostridium `tetani)、白喉、大肠杆菌(E.Coli)、军团杆菌属、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、立克次式体分支杆菌(Mycobacterium rickettsia)、支原体奈瑟氏菌(Mycoplasma nesisseria)、百日咳(Pertussis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、肺炎链球菌(S.Pneumonia)、链球菌属、葡萄球菌属、霍乱弧菌(Vibriacholerae)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)等的细菌导致。传染病还可由例如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、粗球抱子菌(Coccidioides immitis)、新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)、夹膜组织胞衆菌(Histoplasma capsulatum)、马尔尼菲青霉(Penicilliummarneffei)等的真菌导致。传染病还可由原生动物和寄生虫引起,例如衣原体、kokzidioa、利什曼原虫、疟原虫、立克次氏体、锥虫属等等。
[0214]此外，本发明的变体可用于预防或治疗另外的病况，包括但不限于心脏病况例如充血性心力衰竭(CHF)、心肌炎和其它心肌病况；皮肤病况例如蔷薇疹(rosecea)、痤疮和湿疹；骨和牙病况例如骨损失、骨质疏松、佩吉特(Paget)氏病、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、牙周病、废用性骨量减少、骨软化症、单骨纤维性骨发育不良、多发性骨纤维性发育不良、骨转移、骨痛管理、体液恶性高钙血症、牙周重建、脊髓损伤和骨折；代谢病况例如高歇(Gaucher)氏病；内分泌病况例如库欣(Cushing)氏综合症；和神经学病况。
[0215]在本发明的一个实施方案中，根据本发明的抗RhD变体可用于治疗或预防Rh不相容。
[0216]在其他实施方案中，根据本发明的抗CD20变体可用于治疗淋巴性白血病。
[0217]在其他实施方案中，根据本发明的变体可用于治疗和/或预防自身免疫疾病，例如免疫性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、类风湿性多发性关节炎和红斑狼疮。
[0218]在一些实施方案中，亲本多肽可选自商业抗体，例如抗RhD抗体(见在FR0951412中描述的EMAB2?或 ZLB，Zurich 的MoiloRho? )或抗 CD20 (见 W02006064121)。
[0219]亲本多肽也可为Avastin? (抗 vegf) , Rimicade? (抗 TNF- a ), Erbitux?(抗 EGFR)，Veetlbi;!⑩(抗 egfr)，Tysabrl? (抗整合素的 α 4 链)，Hereeptiu? (抗HER2 / neu)，此列表不是限制性的。
[0220]在一些实施方案中，变体是针对选自膜受体、人可溶性蛋白质、毒素、病毒、细菌和真菌蛋白质的靶分子的中和抗体。
[0221]由于其与Clq和一些Fe Y R的低结合，本发明的变体特别适合用于治疗下述病况，所述病况中通过ADCC或CDC的免疫系统的募集对治疗效力不是关键的。
[0222]预期本发明的多肽变体的施用比大多数在其Fe区中不包含294Del或293Del的抗体和免疫粘附素引起较少的副作用和较少的IgG介导的细胞毒性。
[0223]因此本发明的另外 的目的是本发明的变体用于预防或治疗病理学病况的用途，其中不希望诱导ADCC和/或⑶C应答。
[0224]因此本发明的某些实施方案涉及亲本多肽的变体用于预防或治疗病理学病况，其中不希望诱导ADCC和/或⑶C应答，包含Fe区的所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质Clq和与至少一种受体Fe Y R的结合，且相比其多肽亲本的Fe区在其Fe区中包含选自294Del，293Del和293Del/294Del的氨基酸修饰，附带条件是亲本多肽的所述变体不包含在于294Del或293Del与在第307和434位上的突变的组合的氨基酸修饰，在Fe区中的氨基酸编号指根据EU索引或在Kabat中的等同物的编号。
[0225]其他实施方案涉及亲本多肽变体用于预防或治疗病理学病况，其中不希望诱导ADCC和/或CDC应答，包含Fe区的所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质Clq和与至少一种受体Fe Y R的结合，且相比其多肽亲本的Fe区在其Fe区中包含选自294Del，293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰，附带条件是亲本多肽的所述变体不在于294Del / T307P / N434Y 或 293Del / T307P / N434Y 变体。
[0226]当变体的治疗效力不需要效应细胞激活或CDC激活时，不希望诱导ADCC和CDC应答。这样的变体包括例如阻断或中和抗体。
[0227]治疗或预防不需要诱导⑶C和ADCC的病理学病况包括但不限于，移植排斥、自身免疫疾病、炎性病症、传染病或癌症。本发明的另一个目的是本发明的变体在制备药物组合物中的用途。
[0228]在本发明的某些实施方案中，待如上所述使用的变体是这样的变体，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自蛋白质Clq和受体Fe Y R的至少一种蛋白质的结合，且相比其多肽亲本的Fe区在其Fe区中包含选自294Del，293Del和293Del / 294Del的氨
基酸修饰。
[0229]在本发明的特别的实施方案中，变体不在于294Del / T307P / N434Y或293Del /T307P / N434Y 变体。
[0230]在一些实施方案中，本发明的变体在Fe区中还至少包含选自378V，434Y，397M，302A, 434S, 315D, 230S, 307A, 228R, 230S / 315D / 428L / 434Y，259I / 315D / 434Y 的氨基酸修饰和氨基酸修饰256N / 378V / 383N / 434Y。
[0231]在一些特别的实施方案中，本发明的变体的Fe区是包含选自Fe区的294Del，293Del，293Del / 294Del,294Del / 256N / 378V / 383N / 434Y，294Del / 2591 / 315D /434Y，294Del / 397M，294Del / 302A，294Del / 434S，294Del / 315D，294Del / 230S,294Del / 307A,294Del / 228R,230S / 315D / 428L / 434Y，294Del/378V 和 294Del /434Y的至少一个突变的野生型IgG Fe区的变体，其中Fe区中的氨基酸编号是EU索引或在Kabat中的等同物的编号。
[0232]在一些其他实施方案中，变体的Fe区选自IgG野生型Fe区的变体的组，所述组由 294Del，293Del，293Del / 294Del，378V / 294Del，434Y / 294Del,294Del / 397M,294Del / 302A，294Del / 434S，294Del / 315D，294Del / 230S，294Del / 307A，294Del /228R,230S / 315D / 428L / 434Y，259I / 315D / 434Y / 294Del 和 256N / 378V /383N / 434Y / 294Del组成，其中氨基酸编号指EU索引或在Kabat中的等同物的Fe氨基酸编号。
[0233]本发明的另外的目的是提供包含所述变体的药物组合物。当所述变体是抗体时，变体可以单克隆或多克隆抗体的形式存在。通过混合具有期望的纯度的多肽变体和任选的生理上可接受的载体、赋形剂`或稳定剂以冻干的制剂或水溶液的形式制备药物组合物。
[0234]可根据标准方法，例如在Remington:The Science and Practice ofPharmacy (Lippincott ffilliams&ffilkins ;第21版,2005)中描述的方法配制本发明的药物组合物。
[0235]可使用的可药用的赋形剂特别地在Handbook of Pharmaceuticals Excipients,American Pharmaceutical Association (Pharmaceutical Press ;第 6 次修订版，2009)中描述。
[0236]为了治疗有需要的患者，可施用治疗有效剂量的变体。本文中“治疗有效剂量”指所施用的产生效力的剂量。准确的剂量将取决于治疗目的，并可由本领域技术人员使用公知技术来确定。剂量范围可从0.001至IOOmg / kg体重或更大，例如0.l、1.0、10*50mg /kg体重,优选1-1Omg / kg ο本领域公知,可能必须对蛋白质降解、全身对局部递送、和新蛋白酶合成速率，以及年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病况的严重程度进行调整，并可由本领域技术人员通过常规实验方法来确定。
[0237]可以多种方式进行包含变体的药物组合物的施用，包括但不限于口服、皮下、静脉内、胃肠外、鼻内、intraortically、眼内、经直肠、经阴道、经皮、局部(如凝胶剂)、腹膜内、肌内、肺内。
[0238]本文描述的变体可与其他治疗剂相伴施用，即本文描述的治疗剂可与其他疗法或治疗剂，包括例如小分子、其他生物制剂、放射疗法、手术等共同施用。[0239]下面的实施例进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
[0240]实施例:基于Fe变体的IgG变体生产和所述IgG的表征
[0241]I在293-F哺乳动物细胞中生产IgG变体
[0242]1.1载体构建
[0243]使用标准PCR方案，将源自人IgGl重链的编码氨基酸残基226-447 (EU索引，或在Kabat中的等同物)即Fe片段(Fc226，SEQ ID NO:1)的人Fe基因(Poul MA等人，Eur.J.1mmunol.25(7) =2005-20091995)作为 BamHI / NotI 片段克隆进真核表达载体PMGM05-R603 (图 2)中。pMGM05-R603 载体源自 pCEP4 (Invitrogen)并含有 R603 嵌合抗 CD20抗体(LFB-R603)的重链。将此抗体的轻链插入源自PCEP4的类似载体中(pMGM01_R603)。通过重叠PCR将Fe片段中的所有突变插入pMGM05-R603载体。例如，使用2组引物得到变体 294Del。为了进行第一个 PCR，使用 5'引物 MG_6195' -AGTACTGACTCTACCTAGGATCCTGCCCACCGTGC-3' (SEQ ID NO:10)和 3'引物MG_9345' -GCTGTTGTACTGCTCCCGCGGCTT-3'(SEQ ID NO:11)，对于第二个 PCR，使用 5'引物 MG_9335' -AAGCCGCGGGAGCAGTACAACAGC-3'(SEQ ID NO:12)和 3'引物 MG_6215' -ACTGCTCGA TGTCCGTACTATGCGGCCGCGAATTC-3'(SEQ ID NO:13)(其中用下划线标示BamHI和NotI限制位点，斜体字符对应在克隆步骤期间去除的非特异性尾巴)。然后缔合每种PCR片段的一部分，并使用引物MG_619和MG_621使用标准方案通过PCR扩增得到的延长的片段。在1% (w / V)琼脂糖凝胶上纯化PCR产物，用BamHI和NotI限制酶消化并克隆进pMGM05_R603载体中。可选地，可使用相同的引物(MG_933 和 MG_934)使用 Quick change Multi 试剂盒(Stratagene, La Jolla, CA)进行诱变。
[0244]1.2细胞培养物生产
`[0245]用FreeStyle? MAX 试剂(I μ I / ml)使用标准方案(Invitrogen),用等摩尔量(250ng / ml)的 pMGM01_R603 和 pMGM05_R603 载体共转染 FreeStyle?293-F 细胞(Invitrogen)。转染后在无血清培养基中悬浮培养细胞7天,并在以100g离心细胞10分钟后收获含有IgG的上清。然后滴定(1.3)上清(1ml)，并在通过ELISAdI1.1.1)表征结合前冷冻在_20°C。
[0246]1.3生产的IgG变体的滴定
[0247]使用ELISA测定对重组蛋白L(Pierce)定量分泌在之前收获的上清中的IgG变体，使用纯化的R603抗体作为标准物。在Maxisorp免疫板(Nunc)上检测在PBS / 0.05%Tween-20中连续稀释的上清和标准抗体,所述免疫板之前用0.25 / μ g蛋白质L /孔包被并用在PBS中的5%脱脂奶粉封闭。在37°C孵育I小时后，用I3BS / 0.05% Tween-20洗3次孔。用HRP山羊抗人IgGU链特异性)F(ab' )2片段(Sigma)检测结合的IgG变体。使用用纯化的R603抗体得到的标准曲线定量生产的IgG变体(Hyg / ml)。
[0248]II在Y2B / O细胞中生产IgG变体
[0249]I1.1载体构建
[0250]在YB2 / O细胞系中以IgG形式制备具有抗CD20 (R603)或抗RhD+(R593)特异性的 Fe 变体 2591 / 315D / 434Y259I / 315D / 434Y_294Del, 256N / 378V / 383N / 434Y和256N / 378V / 383N / 434Y_Del294。为了最大化在YB2 / O细胞系中的生产力，新合成(neosynthesize)全长重和轻链 cDNA 以及编码 2591 / 315D / 434Y 和 256N / 378V /383N / 434Y变体的Fc片段并针对褐家鼠（Rattus norvegicus)进行密码子优化。去除 不想要的特征，例如隐藏的剪接位点或限制位点。仅在连接可变/恒定区处存在限制位点 (Apal)。
[0251]需要时，通过在PCR1 中使用 DEL1294P1 (5 '引物 5 ' -CAACGCCAAGACCAAG CCCCGGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGG-3 ' ， SEQ ID N014)+HCH20GA_AscI(3 ' 引物 5 ' -AGCGGCGCGCCTCATCA-3 '，SEQ ID NO 15)导致 501bp 的扩增子，在 PCR2 中使用 DEL294P2 (5 '引物 5' ACCAAGGGCCCAAGCGTGT-3 '，SEQ ID N017)+HCH20GA_ApaI (3 '引 物 5' -5CCCTGTAGGTGCTGTTGTACTGCTCCCGGGGCTTGGTCTTGGCGTTG-3'，SEQ ID N016)导致 541bp的扩增子，和最后在PCR3中使用HCH20GA-AscI和HCH20GA_ApaI导致998bp的PCR 产物，通过组装PCR引入294Del突变。用AscI和Apal消化PCR产物并将纯化的979bp片 段插入表达构建体，替换亲本DNA序列。
[0252]II. 2细胞培养物生产
[0253]在YB2 / 0稳定合并物（pool)中实现转染。用每种线性化的表达载体电穿孔 来自YB2 / 0细胞系的细胞，然后以25，000细胞/ mL在EMS培养基+5 % v / v经透析 的FCS(InvitroGen)中稀释，并以lml /孔分配在24孔板中。在细胞恢复3天后,通过在 EMS+5% FCS培养基中加入终浓度2g / 1的G418和终浓度1 %的酚红施加选择压力。孵育 10天后，制备8个P24孔的3份合并物，并在F25中以2. 105cv / ml分散细胞。在滚动细胞 培养瓶中在具有0. 5g / 1 G418的EMS+5% FCS中以在2-8105cv / ml之间的起始浓度进 行抗体的生产，在第5天得到最大的细胞生产，然后收集上清并在FastElysa(RD Biotech) 中滴定。
[0254]在蛋白质A琼脂糖型HiTrap蛋白质A FF(GE Helthcare)上纯化抗体，然后在 25mM, pH3. 0的柠檬酸钠缓冲液中洗脱，级分被中和，在4°C透析进入PBS，pH6. 0过夜。
[0255]通过在非还原和还原条件下的SDS-PAGE表征纯化的IgG,并使用凝胶过滤以估计 聚集物含量。无论是何种突变，IgG被纯化至超过85%并常常超过95%，并展示每种IgG 的特征重和轻链带。还使用LAL内毒素测试（鲎变形细胞溶解物（Limulus Amebocyte Lysate))胶凝法（gel clot method)检测纯化的IgG是否存在内毒素。低内毒素水平以及 低聚集物含量证明生产的抗体因此适用于功能性测试。
[0256]III.通过ELISA的IgG变体的结合表征
[0257]III. 1材料与方法
[0258]III. 1. 1在293-F细胞上清中生产的IgG变体的ELISA测试
[0259]通过ELISA测试IgG变体与若干受体的结合：Clq补体（Calbiochem), Fc y RIIIaV158(R&D system)，FcRn_p3 (FcRn_p3 指包含与噬菌体蛋白 p3 和 CVDE 蛋白融 合的@2微球蛋白链和a链的融合蛋白，并在如Popov等人，Mol. Immunol. , 1996,33 : 521-530 中描述的杆状病毒系统中生产），FcyRIIaR131(R & D system), Fc y RI (R&D system)和Fc y Rllb (R&D system)。在PBS中进行所有受体的ELISA测试，除了 FcRn以 外，所述FcRn的ELISA测试在P6 (磷酸钠100mM,氯化钠50mM pH6. 0)中实现，因为FcRn / IgG结合是pH依赖的，在pH6.0最优。用PBS中的0.5iig Clq补体/孔，PBS中的0. 25 u g Fc y RIIIaV158 / 孔或 PBS 中的 0. 1 y g Fc y RI / 孔或 P6 中的 0. 1 y g FcRn_p3 / 孔包被 Maxisorp 免疫板。用在 0.01M KC1 中的 0. lug Fc y RIIaR131 / 孔或 0. 4 y g Fc y Rllb /孔包被Immobilizer镍螯合板(Nunc)。在4°C包被过夜后，用PBS / 0.05% Tween-20 (或P6 / 0.05% Tween-20，用于 FcRn)洗 2 次板并用 PBS / 4%BSA(*P6 / 4%BSA，用于FcRn)在37°C饱和2小时。平行地，在PBS中将上清稀释为0.5 μ g / ml的最终IgG浓度(或在P6中稀释为0.3yg / ml，用于FcRn结合检测)并与相同浓度的HRP F(ab' )2山羊抗人F(ab' )2在室温混合2小时。然后在温和搅拌下，在饱和的ELISA板上孵育F(ab' )2聚集的 IgGl 小时，对于 Clq7Fc Y RIIaR131 和 FcyRIIb 未稀释(即 0.5 μ g / ml 的 IgG)，对于Fe Y RIIIaV158和Fe Y RI在PBS中稀释为0.25 μ g / ml，或对于FcRn_p3在P6中稀释为0.03751^ / ml。然后用TMB(Pierce)使板显色并读取450nm处的吸光度。[0260]II1.1.2纯化的IgG变体的ELISA测试
[0261]通过ELISA检测了在Y2B / O中生产的IgG变体对若干受体的结合:FcRn_p3 (如I1.1.1 中)，Fe Y RI (R & D system)，Fe y RIIIaV158 (R&D system)，Fe y RIIIaF158 (作为His标记的蛋白质通过PX Therapeutics在HEK293F细胞中瞬时生产)，Fc Y RIIaR131 (R&Dsystem), Fe y RIIaH131 (作为 His 标记的蛋白质通过 PX Therapeutics 在 HEK293F 细胞中瞬时生产)和FcyRIIb(R&D system)。在PBS中进行所有受体的ELISA检测，除了FcRn以外，所述FcRn的ELISA测试在P6 (磷酸钠IOOmM,氯化钠50mM ρΗ6.0)中实现。对T Fe Y RI, Fe Y RIIIaV158, Fe y RIIIaF158 和 Fe Y RIIaH131，用在 PBS 中的 IOOng 重组蛋白质/孔包被Maxisorp免疫板(Nunc),或用P6中的200ng FcRn_p3 /孔包被板。用在0.01M KCl 中的 IOOng Fe y RIIaR131 / 孔或 400ng Fe y RIIb / 孔包被 Immobilizer 镍螯合板(Nunc)。在 4 °C 包被过夜后，用 PBS / 0.05% Tween-20 (或 P6 / 0.05% Tween-20，用于FcRn)洗2次板并用PBS / 4% BSA(或PBS / 4%脱脂奶粉用于Fe Y RI，或P6 / 4%脱脂奶粉用于FcRn)在37°C饱和2小时。
[0262]对于Fe y RIIIaV158, Fe y RIIIaF158, Fe y RIIaR131, Fe y RIIaH131 和 Fe y RIIb结合检测测试，在PBS中将纯化的IgG稀释为2-4μ g / ml的终浓度并与相同浓度的HRPF(ab' )2山羊抗人F(ab' )2室温混合2小时。在PBS中系列稀释后，然后在温和揽祥下在30°C在饱和的ELISA板上孵育I小时F(ab' )2聚集的IgG。然后用TMB(Pierce)显色板并在450nm处读取吸光度。对Fe y RI和FcRn进行直接的ELISA。在补充4%脱脂奶粉和0.01 % Tween20的PBS中(或在P6中，对于FcRn)稀释纯化的IgG并在板上孵育2小时。然后用在相同的缓冲液中稀释的HRP F(ab' )2山羊抗人F(ab' )2(1 / 2500)检测结合的抗体。在37°C孵育2小时后，用TMB(Pierce)使板显色并读取450nm处的吸光度。
[0263]II1.2 结果
[0264]II1.2.1在293-F细胞的上清中生产的IgG
[0265]对每种IgG变体，进行2次独立的实验(生产、上清滴定和5个受体上的ELISA)。将ELISA结果表示为IgG变体得到的特异性信号(0D450nm)相对IgG-WT的信号的比例。这些ELISA测试显示突变294De I大大削弱了变体相比其分别的亲本多肽结合CI q (比例/ IgG-WIX0.50)和Fe Y R(比例/ IgG_WT〈0.25)的能力。相反地，所述突变仅导致组合294Del和至少另一个突变的变体约0-35%的FcRn结合的损失。下面以表1和2显示结果。
[0266]表1:在对于靶蛋白 <:19，卩(^1?11&1?131，卩(^1?1113，卩(^1?111&￥158，卩(^1?1和卩^?11的ELISA测定中，IgGl变体的特异性信号与野生型IgGl得到的特异性信号的比例
[0267]
【权利要求】
1.生产包含Fe区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质Clq和/或与至少一种受体Fe Y R的结合，其中在亲本多肽的Fe区中引入氨基酸修饰，所述氨基酸修饰选自由下述组成的组: (i)294Del，其中所述氨基酸修饰294del是引入亲本多肽的Fe区中的唯一氨基酸修饰，
(ii)293Del，和
(iii)293Del/ 294Del, Fe区中的氨基酸的编号指根据EU索引，或在Kabat中的等同物的编号。
2.根据权利要求1的方法，其中氨基酸修饰293Del是引入亲本多肽的Fe区中的唯一氨基酸修饰。
3.根据权利要求1的方法，其中氨基酸修饰del293/ del294是引入亲本多肽的Fe区中的唯一氨基酸修饰。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中亲本多肽的Fe区是IgGFe区，所述IgGFe 区选自由 SEQ ID NO:1 的 Fe 区，SEQ ID NO:2 的 Fe 区，SEQ ID NO:3 的 Fe 区和 SEQ IDNO:4的Fe区及其片段组成的组。
5.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中亲本多肽的Fe区是包含氨基酸修饰的野生型IgG Fe区的变体，所述氨基酸修饰选自由434Y，378V，259I / 315D / 434Y和256N /378V / 383N / 434Y 组成的组。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中变体选自由Fe融合蛋白、Fe缀合物和抗体组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中在亲本多肽的Fe区中引入所述氨基酸修饰的步骤包括: (i)提供编码亲本多肽的核酸， (?)修饰在步骤(i)中提供的核酸以得到编码所述变体的核酸，和 (iii)在宿主细胞中表达在步骤(ii)中得到的核酸并回收所述变体。
8.包含Fe区的亲本多肽的变体，所述变体由如在权利要求1至8的任一项中定义的方法得到，且展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质Clq和与至少一种受体Fe Y R的结合。
9.根据权利要求8的变体，其中变体是针对靶分子的中和抗体，所述靶分子选自由膜受体，人可溶性蛋白质，毒素，病毒、细菌和真菌蛋白质组成的组。
10.分离的核酸，其编码如在权利要求8至9的任一项中定义的变体。
11.载体，其包含权利要求10的核酸。
12.宿主细胞，其含有权利要求11的载体。
13.亲本多肽变体，其用于预防或治疗病理学病况，所述病理学病况中不希望诱导ADCC和/或⑶C应答，所述变体包含Fe区，展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质Clq和与至少一种受体Fe Y R的结合，且相比其多肽亲本的Fe区在其Fe区中包含选自294Del，293Del和293Del / 294Del的氨基酸修饰，附带条件是亲本多肽的所述变体不在于294Del / T307P / N434Y或293Del / T307P / N434Y变体，在Fe区中的氨基酸编号指根据EU索引，或在Kabat中的等同物的编号。
14.药物组合物，其包含如在权利要求8，9或13的任一项中定义的变体。
【文档编号】C07K16/00GK103827142SQ201280031137
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年6月25日 优先权日:2011年6月24日
【发明者】A·丰泰纳, S·若里约克斯, C·莫内-马尔斯, P·蒙东, A·卡拉特, K·布阿亚迪 申请人:法国血液分割暨生化制品实验室