Hcv基因型4复制子的制作方法

Hcv基因型4复制子的制作方法
【专利摘要】提供了基因型4丙型肝炎病毒（HCV）的复制子。这些复制子包括产生HCV的体外复制能力的适应性变异。还提供了基因型4复制子的制备方法和利用这些复制子筛选抗病毒药剂的方法。
【专利说明】HCV基因型4复制子
[0001]相关申请的相互引用
[0002]根据美国法典第35篇第119 Ce)节，本申请要求享有2011年7月6日提交的美国临时申请序列号61/504，853、2011年7月20日提交的序列号61/509，984、以及2012年I月23日提交的序列号61/589，789的权益，其中的每一个的内容均通过引用以其整体并入本公开。
【技术领域】
[0003]本公开涉及基因型4的丙型肝炎复制子(replicon)，以及制备和使用该复制子的方法。
【背景技术】
[0004]慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染仍然是全世界约1.6亿感染者的巨大全球健康负担。目前的护理标准是聚乙二醇干扰素加利巴韦林(ribavirin)的24-48周疗程。由于此治疗方案的局部疗效及较差的耐药性，新的抗病毒药剂的开发和研制一直在紧张的进行中。最近，这些努力以FDA审核批准两种NS3蛋白酶抑制剂(波普瑞伟和特拉匹韦)与聚乙二醇干扰素和利巴韦林联合使用以用于治疗慢性基因型IHCV感染而告终。许多其它抑制剂正处于进一步临床开发中，然而，大多数还是被研制用于治疗基因型I感染。
[0005]HCV是一种正链RNA病毒，显示极大的遗传多样性。已报道有6种主要基因型(SP基因型1-6)以及多种亚型(如基因型la、lb、lc等)。基因型1、2和3具有世界范围的分布。基因型Ia或Ib通常主要在北美、南美、欧洲和亚洲。然而，基因型2和3在这些地区也是常见的，并且可构成20-50%的感染。基因型4a主要在中东和许多非洲国家；高达15%的埃及人口感染有HCV，并且93%的感染是基因型4。基因型5在南非很普遍，而基因型6在亚洲更常见。尽管多数大陆 和国家具有一种“主要”基因型，但感染的人群几乎普遍是多种基因型的混合感染。此外，由于大规模移民和普遍的静脉用药，HCV感染的地理分布和多样性(流行病学)在不断演变。例如，基因型4a已明显传播到欧洲中部和北部。这就带来了临床挑战，因为对于直接抗病毒药物和包括当前护理标准的免疫调节疗法两者，各种基因型的响应不同，这是有据可查的。
[0006]HCV复制子是来源于HCV基因组的自复制RNA序列，并且一直是作为分子病毒学研究和药物研发的主要工具(workhorse)。迄今为止，已由两种基因型和三种亚型(基因型la、lb和2a)建立了复制子。这些复制子在药物研发和改进的多个方面都是极其重要的，包括新型抑制剂类型的识别、临床候选药物的优化和临床耐药性的表征。最近，研发对所有主要HCV基因型有效的新一代药物的兴趣正在持续增长。理想的是，对“泛基因型(pan-genotypic)”药物和治疗方案的审批将极大地简化HCV的治疗。
[0007]寻求泛基因型治疗方案的一个关键步骤将是研制使得能够研究所有主要基因型和亚型的体外工具。然而，来源于其它主要基因型(即除基因型la、Ib或2a以外的那些基因型)序列的复制子至今还未产生。尤其是，尽管基因型4HCV在中东、北非和欧洲的世界范围内流行，然而基因型4复制子至今未被描述。

【发明内容】

[0008]出乎意料地发现，通过将亚基因组基因型4cDNA转录和电穿孔至HCV允许细胞系(受纳细胞系，permissive cell line)可得到稳定复制基因型4复制子的克隆细胞系。与野生型病毒对比，已从这些克隆物中识别了适应性变异(adaptive mutation)。当通过定点诱变改造(engineer)这些变异并引入到细胞系中，随之而来的是HCV基因型4的复制。
[0009]对于基因型4，这些适应性变异位于NS3 (T343K/R、A200E、或T511K)、NS4A (Q34K/R或E52V)、或NS5A (L179P)中。强健(稳健，robust)基因型4复制子体系的建立为促进药物开发和研制工作提供了有力工具。
[0010]因此，本发明的一个实施方式提供了能够在真核细胞中复制的基因型4丙型肝炎病毒(HCV) RNA构建体，其中RNA序列包括5’ NTR,内部核糖体进入位点(IRES)，编码NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B中的一种或多种的序列，以及3’ NTR0
[0011]一方面，构建体包括NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B中的一个或多个适应性变异。非限制性实例包括(1)在2204位上的异亮氨酸，(2)在NS3中的残基200上的谷氨酸、残基343上的赖氨酸或精氨酸、残基511上的精氨酸、或它们的组合，(3)在NS4A中的残基34上的赖氨酸或精氨酸、残基52上的缬氨酸、或它们的组合，或者(4)在NS5A中的残基179上的脯氨酸。还设想了构建体包括至少2个、或者可替换的3个或4个适应性变异。一方面，适应性变异来自不同的基因。在一些方面，构建体是亚基因组或全长HCV复制子。
[0012]此外，还提供了转录为RNA构建体的DNA、包括RNA构建体的病毒颗粒、以及含有这种DNA或RNA的细胞。
[0013]在一个实施方式中，还提供了包括一个或多个相应适应性变异的单独的NS3、NS4A、或NS5A蛋白。还提供了编码这些蛋白的多核苷酸和特异性识别这些蛋白的抗体。
[0014]在本发明的另一个实施方式中，提供了一种包括基因型4丙型肝炎病毒(HCV)RNA的分离细胞，其中基因型4丙型肝炎病毒(HCV) RNA是在细胞中复制的。一方面，在细胞中不存在编码RNA的DNA构建体。另一方面，细胞包括至少10个拷贝的RNA，或者可替换地至少约 100、500、1000、2000、5000、10，OOOUxlO5, IxlO6、IxlO7, IxlO8 或 IxlO9个拷贝的 RNA。在这些方面中的任一个中，RNA可以是亚基因组HCV序列或全长HCV序列，并且可以包括如上所述的一个或多个适应性变异。
[0015]一方面，细胞是哺乳动物细胞，其可以是，例如，肝瘤细胞，特别是Huh71C细胞。
[0016]还提供了提高基因型4HCV病毒RNA在真核细胞中的复制能力的方法，包括以下各项中的一个或多个:(a)用谷氨酸取代NS3的残基200，(b)用赖氨酸或精氨酸取代NS3的残基343，(c)用精氨酸取代NS3的残基511，(d)用赖氨酸或精氨酸取代NS4A的残基34，Ce)用缬氨酸取代NS4A的残基52，或者(f)用脯氨酸取代NS5A的残基179。
[0017]在一个实施方式中，还提供了一种识别抑制基因型4HCV的复制或活性的药剂的方法，包括将任何以上实施方式中的细胞与候选药剂接触，其中，由RNA编码的蛋白质的复制减少或活性降低表明该药剂抑制HCV的复制或活性。可替换地，该方法包括将以上实施方式的任一个中的细胞裂解液与候选药剂接触，其中，由RNA编码的蛋白质的活性降低表明该药剂抑制HCV的活性。【专利附图】

【附图说明】
[0018]与附图一起阅读以下详细描述，可以对本发明有最好的理解。附图包括以下各图:
[0019]图1是基因型4a复制子构建体的示意图。HCV复制子用于生成新型基因型4a稳定复制子细胞系。ED434a菌株复制子编码新霉素磷酸转移酶II (A)或海肾荧光素酶(Rluc)-新霉素磷酸转移酶II融合报告子(B)。合成的复制子并入以下要素，从5’至3’:ED435’UTR;新霉素磷酸转移酶II基因(neo)或Rluc-Neo基因；脑心肌炎病毒(EMCV)IRES ；包括NS5A适应性变异(S2204I)的ED43的NS3-NS5B多聚蛋白区；以及ED43的3’UTR。实心黑方框表示HCV核心序列。圆点阴影方框表示HCV多聚蛋白序列。“ + ”表示S2204I适应性变异。5’和3’非翻译区(NTR)和EMCVIRES也有表示。
[0020]图2是基因型4a复制子的建立方案示意图。
[0021]图3示出了在三种不同细胞系中存活的菌落数。如在材料和方法中所述的，分别用GT4a复制子RNA转染Huh-7Lunet、51C和IC细胞。对于每次选择，对存活的菌落数计数。数据代表至少6次独立转染的平均值。Huh7_lunet获自ReBLikon GmbH(Mainz, Germany)。之前已描述了 51C 细胞的来源(Robinson 等，Antimicrob Agents Chemother54:3099-106(2010))。IC细胞是通过治愈获自51C细胞的GS-5885耐受性基因型Ia复制子克隆而得到的。GS-5885 是一种 NS5A 抑制剂，可获自 Gilead Sciences, Inc.Foster City, CA。该图显示，Huh71C细胞相比于Huh7-Lunet或51C细胞对GT4a复制子复制具有更高的允许度。
[0022]图4示出了选定的GT4a复制子克隆获得了适应性变异。从原始基因型4a复制子细胞克隆中提取总细胞RNA，然后按指定量将其电穿孔到Huh7-Lunet细胞中。使转染细胞再悬浮于完全DMEM培养基中，并以多种密度(范围为2 X IO5到2 X IO6个细胞)铺板于直径为IOOmm的盘(皿,dish)中。铺板48小时之后,培养基用以0.5mg/ml的G418增补的完全DMEM替换，每周更新两次。3周之后，用4%的甲醛固定菌落盘，并用0.05%在水中的结晶紫染色。平行转染体外转录的GT4a复制子RNA，用作对照组。从原始基因型4a复制子中提取的RNA的菌落形成效率极大提高，这表明在该克隆中的复制子已获得了使得能够在体外强健复制的适应性变异。
[0023]图5示出了在GT4a复制子细胞系中的强健NS5A和NS3表达(A)。用抗-NS5A抗体(Apath, Brooklyn, New York ;上图，浅灰色)和 Hoechst33342 (Invitrogen ；1 μ g/ml)(下图，深灰色表示细胞核)对GT4a复制子细胞池(cell pool)染色。对IC细胞进行染色作为阴性对照(下图)。GT4a复制子细胞对NS5A呈明显阳性，这表明是活性复制。(B)如在材料和方法中所述的，测定选定的GT4a复制子细胞系的细胞内NS3蛋白酶活性。，包括GTla和GTlb稳定复制子细胞，用于比较NS3蛋白酶活性。包括IC细胞，作为阴性对照。在GT4a复制子细胞系中观察到了强健的NS3活性，这表明其强健的复制子活性，一些GT4a复制子细胞系超过了由标准GTla和Ib复制子细胞产生的NS3信号。
[0024]图6证实了在GT4a复制子细胞系中强健的NS5A表达。将各自0.5xl06个稳定的GT4a和GTlb复制子细胞分离，并在100 μ I的SDS加载缓冲液(loading buffer)中完全裂解。取12 μ I的裂解液，进行SDS-PAGE和蛋白印迹(Western blot)分析。印迹用一级抗-NS5A抗体(Apath ； 1:10000稀释液)和二级抗-小鼠抗体染色(来自L1-COR的IRDye800CW山羊抗-小鼠IgG (H+L)，1:10，OOO稀释液)。然后，用Odyssey成像系统(L1-COR.Lincoln, Nebraska)分析染色。印迹还需用抗-BiP抗体(Abeam ；1:1000稀释液)和二级抗-兔抗体(来自L1-COR的IRDye800CW Goat抗-兔子IgG (H+L)，1:10，000稀释液)共同染色，作为加载对照组。在GT4a复制子细胞克隆中检测到NS5A的强表达，证实这些细胞稳定且强健地复制该复制子，超过由标准GTlb复制子细胞产生的NS5A表达水平或者可与上述NS5A表达水平相比较。
[0025]图7示出了 NS4A Q34R是GT4a复制的细胞培养适应性变异。将GT4aED43_neo构建体的Neo基因替换为Rluc-neo融合报告子，以有助于在细胞培养物中测定复制子的复制(利用荧光素酶)。然后，通过定点诱变将NS4A基因中的Q34R变异引入到GT4aED43-RlucNeo构建体中。分别将全部的三种复制子RNA转染到Huh7_Lunet (左图)和IC(右图)细胞中。对于每次选择，对存活的菌落数计数。数据代表至少2次独立转染的平均值。Q34R变异使得GT4a ED43-RlucNe0能够建立菌落，而没有这种变异的相同复制子没有建立菌落。选择GT4a RlucNeoQ34R的克隆，由于其较高的Rluc信号，并扩增以用于抗病毒检测。
[0026]图8呈现出以下数据，这些数据显示对于GT4a复制，NS3A200E、T343R、和T343K以及NS4A Q34R、Q34K和E52V变异是细胞培养适应性变异。将GT4a ED43_neo构建体的Neo基因替换为Rluc-neo融合报告子，以有助于在细胞培养中测定复制子的复制(利用荧光素酶)。然后，通过定点诱变，分别将NS3基因中的变异A200E、T343R、和T343K以及NS4A基因中的Q34K、Q34R、和E52V引入到GT4a ED43-RlucNeo构建体中。单独将全部的复制子RNA转染到IC细胞中，并将IX IO4个转染细胞铺板到96-孔板的孔中。在转染后的4小时和第I天到第8天中的每天，分析细胞的海肾荧光素酶活性。在第4天，进行细胞传代和再铺板。在每个时间点，对每次转染测定四倍孔，数据代表2次独立实验的平均值，带有误差条。所有测试的变异:NS3基因中的A200E、T343R、和T343K以及NS4A基因中的Q34K、Q34R、和E52V，显著提高了 GT4aED43-RlucNeu的复制，正如从在信号初始下降(由输入RNA的直接翻译引起，与RNA复制无关)之后的第2天开始Rlu信号的增加所证明的。相比之下，不含变异的相同复制子没有显示出任何有意义的复制。
【具体实施方式】
[0027]在更详细地描述本发明之前，将首先定义以下术语。
[0028]应当理解，本发明并不限于所描述的特定实施方式，当然，可以有所变化。还应理解，在本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而非意图限制，因为本公开内容的范围将仅由所附的权利要求来限定。
[0029]需注意，除非在上下文中另有明确规定，在本文中及在所附权利要求中使用的单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数对象。因此，举例来说，提及“该丝线”包括多个丝线。
[0030]1、定义
[0031]除非另有规定，在本文中使用的所有技术或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本文中使用的以下术语具有以下含义。
[0032]在本文使用的术语“包括”或“包含”意在表示组分和方法包括所列举的要素，但不排除其它。当“ 基本由…组成”用于限定组分和方法时，应表示排除对于为了所述目的而引用的组合具有任何实质意义的其它要素。因此，基本由在本文中限定的要素组成的组合物不排除其它对所要求保护的公开的基本或新特征不具有实质影响的材料或步骤。“由…组成”表示排出超过微量要素的其它成分和基本方法步骤。由所有这些过渡术语中的每一个限定的实施方式在本公开的范围之内。
[0033]当术语“约”用在数值标号，例如，温度、时间、数量和浓度(包括范围)之前时，是指可以相差(+ )或(_) 10%、5%或1%的近似值。
[0034]术语“蛋白质”和“多肽”可交换使用，且其最广泛的含义是指两个或更多个亚单元氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的化合物。亚单元可由肽键连接。在另一个实施方式中，亚基可以由其它键连接，例如酯、醚等。蛋白质或肽必须包括至少两个氨基酸，且不限制氨基酸的最大数量，可以包括蛋白质或肽的序列。在本文使用的术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和其D及L光学异构体，氨基酸类似物或拟肽。下面列出了天然产生的氨基酸的一个字母及三个字母的缩写。如果肽链较短，则三个或更多个氨基酸的肽通常被称作寡肽。如果肽链较长，肽通常被称作多肽或蛋白质。
[0035]
【权利要求】
1.一种能够在真核细胞中复制的基因型4丙型肝炎病毒(HCV)RNA构建体，其中，所述RNA的序列包括5’NTR，内部核糖体进入位点(IRES)，编码NS3、NS4A、NS4B、NS5A、或NS5B中的一种或多种的序列，以及3’ NTR0
2.根据权利要求1所述的RNA构建体，其中，与野生型相比，所述构建体包括在NS3、NS4A、NS4B、NS5A、*NS5B中的适应性变异。
3.根据权利要求2所述的RNA构建体，其中，所述变异包括在2204位上的异亮氨酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述变异包括在NS3中的残基200上的谷氨酸、残基343上的赖氨酸或精氨酸、残基511上的精氨酸、或它们的组合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述变异包括在NS4A中的残基34上的赖氨酸或精氨酸、残基52上的缬氨酸、或它们的组合。
6.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述变异包括在NS5A中的残基179上的脯氨酸。
7.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述构建体包括至少一个在NS3中的适应性变异和至少一个在NS4A中的适应性变异。
8.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述构建体包括至少一个在NS3中的适应性变异和至少一个在NS5A中的适应性变异。
9.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述构建体包括至少一个在NS4A中的适应性变异和至少一个在NS5A中的适应性变异。
10.根据前述权利要求`中任一项所述的RNA构建体，其中，所述构建体包括至少一个在NS3中的适应性变异、至少一个在NS4A中的适应性变异、和至少一个在NS5A中的适应性变巳
11.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述基因型4HCV是基因型4a HCV。
12.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，还包括用于选择的标记基因。
13.根据权利要求12所述的RNA构建体，其中，所述标记基因是新霉素磷酸转移酶基因。
14.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，还包括报告基因。
15.根据权利要求14所述的RNA构建体，其中，所述报告基因是荧光素酶。
16.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述构建体包括，从5’到3’:所述 5’ NTR,所述 IRES,编码 NS3、NS4A、NS4B、NS5A、和 NS5B 的序列，以及所述 3’ NTR。
17.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，还包括编码C、E1、或E2中的一种或多种的序列。
18.一种单链或双链DNA，可以转录为前述权利要求中任一项所述的RNA构建体。
19.一种病毒颗粒，包含权利要求1至17中任一项所述的RNA构建体。
20.一种分离细胞，包含权利要求1至17中任一项所述的RNA构建体或权利要求18所述的DNA。
21.—种HCV基因型4的NS3蛋白，包括残基200上的谷氨酸、残基343上的赖氨酸或精氨酸、残基511上的精氨酸、或它们的组合。
22.—种HCV基因型4的NS4A蛋白，包括残基34上的赖氨酸或精氨酸、残基52上的缬氨酸、或它们的组合。
23.—种HCV基因型4的NS5A蛋白，包括残基179上的脯氨酸。
24.—种HCV基因型4的NS5A蛋白，包括残基179上的脯氨酸和在2204位上的异亮氨酸。
25.—种多核苷酸,编码权利要求21至24中任一项所述的蛋白质。
26.根据权利要求25所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是RNA或DNA。
27.—种RNA或DNA构建体，包括权利要求25或26所述的多核苷酸。
28.—种细胞，包含权利要求25或26所述的多核苷酸或者权利要求27所述的RNA或DNA构建体。
29.一种抗体，特异性地识别权利要求21至24中任一项所述的蛋白。
30.一种分离细胞，包含在所述细胞中复制的基因型4丙型肝炎病毒(HCV) RNA。
31.根据权利要求30所述的细胞，其中，在所述细胞中不存在编码所述RNA的DNA构建体。
32.根据权利要求30或31所述的细胞，其中，所述细胞包括至少10个拷贝的所述RNA。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的细胞，其中，所述RNA包括亚基因组HCV序列。`
34.根据权利要求33所述的细胞，其中，所述RNA包括5’NTR，内部核糖体进入位点(11?3)，编码吧3、吧4六、吧48、吧5六、和NS5B的序列，以及3’NTR。
35.根据权利要求30至34中任一项所述的细胞，其中，所述RNA包括全基因组HCV序列。
36.根据权利要求30至35中任一项所述的细胞，其中，所述RNA包括在2204位上的异亮氨酸。
37.根据权利要求30至36中任一项所述的细胞，其中，所述RNA是基因型4a。
38.根据权利要求30至37中任一项所述的细胞，其中，所述RNA包括编码NS3的序列，所述NS3包括残基200上的谷氨酸、残基343上的赖氨酸或精氨酸、残基511上的精氨酸、或它们的组合。
39.根据权利要求30至38中任一项所述的细胞，其中，所述RNA包括编码NS4A的序列，所述NS4A包括残基34上的赖氨酸或精氨酸、残基52上的缬氨酸、或它们的组合。
40.根据权利要求30至39中任一项所述的细胞，其中，所述RNA包括编码NS5A的序列，所述NS5A包括残基179上的脯氨酸。
41.根据权利要求30至40中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。
42.根据权利要求41所述的细胞，其中，所述细胞是肝瘤细胞。
43.根据权利要求42所述的细胞，其中，所述细胞是Huh71C细胞。
44.一种提高基因型4HCV病毒RNA在真核细胞中的复制能力的方法，包括以下各项中的一个或多个: Ca)用谷氨酸取代NS3的残基200， (b)用赖氨酸或精氨酸取代NS3的残基343， (c)用精氨酸取代NS3的残基511， Cd)用赖氨酸或精氨酸取代NS4A的残基34，(e)用缬氨酸取代NS4A的残基52，或 Cf)用脯氨酸取代NS5A的残基179。
45.一种识别抑制基因型4HCV的复制或活性的药剂的方法，包括使权利要求1至17中任一项所述的细胞与候选药剂接触，其中，由RNA编码的蛋白质的复制减少或活性降低表明所述药剂抑制所述HCV的复制或活性。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述蛋白质是蛋白酶。
47.根据权利要求45或46所述的方法，还包括测定所述RNA的复制或由所述RNA编码的所述蛋白质的活性。
48.一种识别抑制基因型4HCV的活性的药剂的方法，包括使权利要求1至17中任一项所述的细胞的裂解液与候选药剂接触，其中，由RNA编码的蛋白质的活性降低表明所述药剂抑制所述HCV的活性。
49.根据权利要求48所述的方法，其中，所述蛋白质是蛋白酶。
50.根据权利 要求 48或49所述的方法，还包括测定所述RNA的复制或由所述RNA编码的所述蛋白质的活性。
【文档编号】C07K14/005GK103687868SQ201280033317
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年7月5日 优先权日:2011年7月6日
【发明者】威廉四世·E·德拉尼, 程国锋, 莫红梅, 徐思民, 彭倍儿 申请人:吉利德科学股份有限公司