含有抗pcsk9抗体的稳定配制剂的制作方法

含有抗pcsk9抗体的稳定配制剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一些医药配制剂，其含有一种与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)特异性结合的人源抗体。除一种抗PCSK9抗体之外，这些配制剂还可含有至少一种氨基酸、至少一种糖，或至少一种非离子型表面活性剂。本发明之医药配制剂在储存数月之后展现了很高的抗体稳定性。
【专利说明】含有抗PCSK9抗体的稳定配制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及治疗性抗体配制剂领域。尤其是，本发明涉及医药配制剂领域，该配制剂含有一种与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (PCSK9)特异性结合的人源抗体。
[0002]序列表
[0003]—份符合ST.25标准的序列表文本文件与本说明书同时提交。该文本文件的内容系通过引用而纳入本文。该序列表的一份纸质复印件(其内容与上述符合ST.25标准的序列表文本文件相同)作为本说明书的一部分而包括在此。
【背景技术】
[0004]治疗性大分子(例如抗体)必须以妥善方式配制，不仅使该分子适合于给药，而且在储存及随后使用过程中能保持其稳定性。例如，除非液体溶液经过妥善配制，治疗性抗体在该溶液中易发生降解、聚集或不希望发生的化学修饰。液体型配制剂中抗体的稳定性不仅取决于配制剂中所用赋形剂的类型，也取决于赋形剂彼此的相对用量和比例。而且，在制备液体型抗体配制剂时，除稳定性以外，还必须考虑一些其它因素。这类其它考虑因素的实例包括给定配制剂能够承受的溶液粘度和抗体浓度，以及配制剂的视觉效果或吸引力。因此，在配制治疗性抗体时必须十分小心，以得到一种能保持稳定、含有适当浓度的抗体，并具有适当粘度及其它属性的配制剂，以便能够方便地施予患者。
[0005]人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9蛋白(PCSK9)的抗体是需要妥善配制的治疗性大分子的一个实例。抗PCSK9抗体可临床用于治疗或预防高胆固醇血症之类的疾病和其它血脂异常症，以及其它病症。除其它专利以外，示范性抗PCSK9抗体在下列专利中有所叙述:TO2008/057457、 W02008/057458, W02008/057459, W02008/063382, W02008/125623,US7, 572，618、W02010/077854、US2010/0166768,以及 US2011/0065902。
[0006]虽然抗PCSK9抗体是已知的，但本领域内仍需要足够稳定且适合于给药的含抗PCSK9抗体的新型医药配制剂。
[0007]发明概述
[0008]通过提供含有与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (PCSK9)特异性结合的人源抗体之医药配制剂，本发明满足了上述需要。
[0009]在一个方面，提供了一种液体型医药配制剂，其含有:(i) 一种与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)特异性结合的人源抗体；(ii) 一种缓冲剂；(iii) 一种有机共溶剂；Qv) —种稳定剂；以及可选的(V) —种减粘剂。
[0010]在一个实施方案中，所提供抗体的浓度为50±7.5mg/mL至约200±30mg/mL。在另一个实施方案中，所提供抗体的浓度约为50mg/mL±7.5mg/mL。在另一个实施方案中，所提供抗体的浓度约为100mg/mL±15mg/mL。在另一个实施方案中，所提供抗体的浓度约为150mg/mL±22.5mg/mL。在另一个实施方案中，所提供抗体的浓度约为175mg/mL±26.25mg/mL。在另一个实施方案中，所提供抗体的浓度约为200mg/mL±30mg/mL。
[0011]在一个实施方案中，所述抗体包含序列号为1-8的氨基酸序列中的任何一个或多个氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体包含(a) —个重链可变区(HCVR)，其包含分别含有序列2、3和4的重链互补决定区1、2和3 (HCDR1-HCDR2-HCDR3)；以及
(b)一个轻链可变区(LCVR)，其包含分别含有序列6、7和8的轻链互补决定区1、2和3 (IXDR1-1XDR2-1XDR3)。在一个特别的实施方案中，该抗体包含一个HCVR和一个LCVR，其分别包含序列号为I和5的氨基酸序列。
[0012]在一个实施方案中，该液体型配制剂的pH值约为pH6.0±0.5、pH6.0±0.4、ρΗ6.0±0.3、ρΗ6.0±0.2、ρΗ6.0±0.1、ρΗ6.0±0.05、ρΗ6.0±0.01，或 ρΗ6.0。在一个特别的实施方案中，该液体型配制剂的pH值约为6.0±0.3。在一个实施方案中，该液体医药缓冲剂含有一种或多种缓冲剂，其有效缓冲范围为约ΡΗ5.5至约ρΗ7.4，或其pKa约为6.0。
[0013]在一个实施方案中，该缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，该组氨酸的浓度为5mM±0.75mM至50mM±7.5mM。在一个实施方案中，该组氨酸的浓度为10mM±l.5mM或约IOmM0在一个实施方案中，该组氨酸的浓度为20mM±3mM或约20mM。在一个实施方案中，该组氨酸的浓度为40nM±6mM或约40nM。
[0014]在一个实施方案中，该有机共溶剂是一种含聚氧乙烯基团的非离子型聚合物。在某些实施方案中，所述有机共溶剂是聚山梨醇酯20、聚羟体188和聚乙二醇3350中的一种或多种。在一个特别的实施方案中，该有机共溶剂是聚山梨醇酯20。
[0015]在一个实施方案中，该有机共溶剂的浓度为约0.005% ±0.00075%至约I %±0.15% “重量 / 体积”或“w/v””，其中例如 0.lg/ml = 10%及 0.01g/ml = 1%。在一个实施方案中，该有机共溶剂是聚山梨醇酯20，其浓度约为0.2% ±0.03% w/v。在另一个实施方案中，该有机共溶剂是聚山梨醇酯20，其浓度为0.01 % ±0.0015% w/v或约0.01 % w/
Vo
[0016]在一个实施方案中，该稳定剂是一种糖。在另一个实施方案中，所述的糖选自鹿糖、甘露糖醇及海藻糖。在一个特别`的实施方案中，该稳定剂是蔗糖。
[0017]在一个实施方案中，该稳定剂的浓度为1% ±0.15% w/v至20% ±3% w/v。在一个特别的实施方案中，该稳定剂是浓度为5% ±0.75% w/v或约5% w/v的蔗糖。在另一个特别的实施方案中，该稳定剂是浓度为10% ±1.5% w/v或约10% w/v的蔗糖。在另一个特别的实施方案中，该稳定剂是浓度为12% ±1.8% w/v或约12% w/v的蔗糖。
[0018]在一个实施方案中，所述减粘剂选自下列一组盐:精氨酸盐酸盐、硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫酸铵、氯化铵、氯化钙、氯化锌和乙酸钠。在一个实施方案中，所述减粘剂是L-精氨酸盐酸盐。
[0019]在一个实施方案中，所述减粘剂的浓度为10mM±l.5mM至150mM±22.5mM。在一个实施方案中，所述减粘剂是浓度为50mM±7.5mM或约50mM的L-精氨酸盐酸盐。在一个实施方案中，所述减粘剂是浓度为40mM±6mM或约40mM的L-精氨酸盐酸盐。
[0020]在一个实施方案中，所述液体型或重组的冻干型医药配制剂在25°C的粘度为低于或等于约15厘泊±10%。在一个实施方案中，25°C时的粘度是1.0厘泊±10%和18厘泊±10%。在一个实施方案中，25°C时的粘度是1.6厘泊±10%、1.7厘泊±10%、3.3厘泊 ±10%、3.5 厘泊 ±10%、4.8 厘泊 ±10%、6.0 厘泊 ±10%、7.0 厘泊 ±10%、7.1 厘泊±10%、7.2 厘泊 ±10%、7.9 厘泊 ±10%、8.9 厘泊 ±10%、10.0 厘泊 ±10%、10.6 厘泊±10%、11.4 厘泊 ±10%、11.6 厘泊 ±10%、11.8 厘泊 ±10%、12.4 厘泊 ±10%、13.9 厘泊 ±10%、14.0 厘泊 ±10%、15.5 厘泊 ±10%，或 17.9 厘泊 ±10%。
[0021]在一个实施方案中，所述液体型医药配制剂的渗透浓度介于100±15m0sm/kg和460±69m0sm/kg之间。在一个实施方案中，所述液体型医药配制剂的渗透浓度为103± 15m0sm/kg或约103m0sm/kg。在一个实施方案中，所述液体型医药配制剂的渗透浓度为195±29m0sm/kg或约195m0sm/kg。在一个实施方案中，所述液体型医药配制剂的渗透浓度为220±33m0sm/kg或约220m0sm/kg。在一个实施方案中，所述液体型医药配制剂的渗透浓度为330±50m0sm/kg或约330m0sm/kg。在一个实施方案中，所述液体型医药配制剂的渗透浓度为435±65m0sm/kg或约435m0sm/kg。在一个实施方案中，所述液体型医药配制剂的渗透浓度为440±66m0sm/kg或约440m0sm/kg。在一个实施方案中，所述液体型医药配制剂的渗透浓度为458±69m0sm/kg或约458m0sm/kg。
[0022]在一个实施方案中，在所述液体型医药配制剂于_80°C储存三个月之后，根据尺寸排阻色谱法测定，从所述液体型医药配制剂中回收了至少96%或至少97%非聚集和非降解形式的抗PCSK9抗体。在一个实施方案中，在所述液体型医药配制剂于-80°C储存三个月之后，根据离子交换色谱法测定，从所述液体型医药配制剂中回收了至少56%非碱性和非酸性形式(即主峰或主要荷电形式)的抗PCSK9抗体。
[0023]在一个实施方案中，在所述液体型医药配制剂于_30°C储存三个月之后，根据尺寸排阻色谱法测定，从所述液体型医药配制剂中回收了至少96%或至少97%非聚集和非降解形式的抗PCSK9抗体。在一个实施方案中，在所述液体型医药配制剂于-30°C储存三个月之后，根据离子交换色谱法测定，从所述液体型医药配制剂中回收了至少56%主要荷电形式的抗PCSK9抗体。
[0024]在一个实施方案中，在所述液体型医药配制剂于_20°C储存三个月之后，根据尺寸排阻色谱法测定，从所述 液体型医药配制剂中回收了至少96%或至少97%非聚集和非降解形式的抗PCSK9抗体。在一个实施方案中，在所述液体型医药配制剂于-20°C储存三个月之后，根据离子交换色谱法测定，从所述液体型医药配制剂中回收了至少56%主要荷电形式的抗PCSK9抗体。
[0025]在一个实施方案中，在所述液体型医药配制剂于5°C储存六个月之后，根据尺寸排阻色谱法测定，从所述液体型医药配制剂中回收了至少96%非聚集和非降解形式的抗PCSK9抗体。在一个实施方案中，在所述液体型医药配制剂于5°C储存三个月之后，根据离子交换色谱法测定，从所述液体型医药配制剂中回收了至少58%或58%主要荷电形式的抗PCSK9抗体。
[0026]在一个实施方案中，在所述液体型医药配制剂于25°C储存六个月之后，根据尺寸排阻色谱法测定，从所述液体型医药配制剂中回收了至少94%非聚集和非降解形式的抗PCSK9抗体。在一个实施方案中，在所述液体型医药配制剂于25 °C储存六个月之后，根据离子交换色谱法测定，从所述液体型医药配制剂中回收了至少45%或47%非碱性和非酸性形式的抗PCSK9抗体。
[0027]在一个实施方案中，在所述液体型医药配制剂于45°C储存28天之后，根据尺寸排阻色谱法测定，从所述液体型医药配制剂中回收了至少91%或92%非聚集和非降解形式的抗PCSK9抗体。在一个实施方案中，在所述液体型医药配制剂于45°C储存28天之后，根据离子交换色谱法测定，从所述液体型医药配制剂中回收了至少35%或37%非碱性和非酸性形式的抗PCSK9抗体。
[0028]在一个方面，提供了一种液体型医药配制剂，其含有:(i)50±7.5mg/ml至175±26mg/ml与人PCSK9特异性结合的人源抗体；(ii) OmM至40±6mMM组氨酸；(iii) 0%M 0.2% ±0.03% (w/v)聚山梨醇酯 20 ;(iv)0% 至 12% ±1.8% (w/v)蔗糖；以及(V) OmM至50 ±7.5mM精氨酸，pH为约5.3至约6.7。这一方面的抗PCSK9抗体包含一个重链可变区(HCVR)和一个轻链可变区(LCVR)，使得该HCVR/LCVR组合包含重链和轻链互补决定区(HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3)，该重链和轻链互补决定区分别包含序列号为2-3-4/6-7-8的氨基酸序列。在一个特别的实施方案中，所述抗PCSK9抗体包含一个重链可变区(HCVR)和一个轻链可变区(LCVR)，该重链和轻链可变区分别包含序列号为I和5的氨基酸序列(以下称为“mAb-316P”)。
[0029]在这一方面的一个实施方案中，所述液体型配制剂含有⑴50±7.5mg/mLmAb-316P;(ii)10±L5mM 组氨酸；I % ±0.015% (w/v)聚山梨醇酯 20 ;以及(iv)6% ±0.9% (w/v)蔗糖，pH值为6.0±0.3。在这一特定配制剂的一个实施方案中，其粘度约为1.7厘泊。在这一特定配制剂的一个实施方案中，其渗透浓度为220±44m0sm/kg。
[0030]在另一个实施方案中，所述液体型配制剂含有(i)100±20mg/mL mAb_316P ;
(ii)20±4mM 组氨酸；(iii)0.2% ±0.04% (w/v)聚山梨醇酯 20 ;以及(iv)12% ±2.4%(w/v)蔗糖，pH值为6.0±0.3。在这一特定配制剂的一个实施方案中，其粘度约为3.5厘泊。在这一特定配制剂的一个实施方案中，其渗透浓度为440±88m0sm/kg。
[0031]在另一个实施方案中，所述液体型配制剂含有(i)150±22.5mg/mL mAb_316P ;
(ii)10±L 5mM 组氨酸；(iii)0.2% ±0.03%或 0.01% ±0.0015% (w/v)聚山梨醇酯20 ;以及(iv)10% ±1.5% (w/v)蔗糖，pH值为6.0±0.3。在这一特定配制剂的一个实施方案中，其粘度约为6厘泊。在这一特定配制剂的一个实施方案中，其渗透浓度为435±65.25mOsm/kg。在这一特定配制剂的一个实施方案中，在所述配制剂于45°C储存28天之后，^ 92%的抗体是天然形式，^ 35%的抗体是主要荷电形式。在这一特定配制剂的一个实施方案中，在所述配制剂于25°C储存六个月之后，> 94%的抗体是天然形式，>45%的抗体是主要荷电形式。在这一特定配制剂的一个实施方案中，在所述配制剂于5°C储存六个月之后，^ 96%的抗体是天然形式，^ 58%的抗体是主要荷电形式。在这一特定配制剂的一个实施方案中，在所述配制剂于_20°C储存12个月之后，> 97%的抗体是天然形式，> 56%的抗体是主要荷电形式。在这一特定配制剂的一个实施方案中，在所述配制剂于-30°C储存12个月之后，^ 97%的抗体是天然形式，^ 56%的抗体是主要荷电形式。在这一特定配制剂的一个实施方案中，在所述配制剂于_80°C储存12个月之后，> 97%的抗体是天然形式，^ 56%的抗体是主要荷电形式。
[0032]在这一特定配制剂的某些实施方案中，> 85%的抗体在于45°C储存28天之后、^ 82%的抗体在于37°C储存28天之后，及/或> 98%的抗体在于25°C储存28天之后，仍保持了其生物效价。在这一特定配制剂的某些实施方案中，> 85%的抗体在于-20°C储存六个月之后、> 70%的抗体在于-30°C储存六个月之后，及/或≥79%的抗体在于-80°C储存六个月之后，仍保持了其生物效价。在这一特定配制剂的某些实施方案中，> 81 %的抗体在8个冻融周期之后仍保持了其生物效价，及/或> 84%的抗体在搅拌120分钟之后仍保持了其生物活性。[0033]在这一方面的另一个实施方案中，所述液体型配制剂含有(i)175±26.25mg/mLmAb-316P ; (ii) 10± 1.5mM 组氨酸；(iii) 0.01 % ±0.0015 % (w/v)聚山梨醇酯 20 ;(iv)5%±0.75% (w/v)蔗糖；以及(V) 50±7.5mM 精氨酸，pH 值为 6.0±0.3。在这一特定配制剂的一个实施方案中，其粘度约为10.6厘泊。在这一特定配制剂的一个实施方案中，其渗透浓度为330±50m0sm/kg。在这一特定配制剂的一个实施方案中，在所述配制剂于45°C储存28天之后，^ 91%的抗体是天然形式，^ 38%的抗体是主要荷电形式。在这一特定配制剂的一个实施方案中，在所述配制剂于25°C储存六个月之后，> 94%的抗体是天然形式，> 47%的抗体是主要荷电形式。在这一特定配制剂的一个实施方案中，在所述配制剂于5°C储存六个月之后，^ 96%的抗体是天然形式，^ 59%的抗体是主要荷电形式。在这一特定配制剂的一个实施方案中，在所述配制剂于_20°C储存三个月之后，> 96%的抗体是天然形式，> 56%的抗体是主要荷电形式。在这一特定配制剂的一个实施方案中，在所述配制剂于-30°C储存三个月之后，^ 96%的抗体是天然形式，^ 56%的抗体是主要荷电形式。在这一特定配制剂的一个实施方案中，在所述配制剂于_80°C储存三个月之后，^ 96%的抗体是天然形式，^ 56%的抗体是主要荷电形式。[0034]在一个方面，前述各方面的任何液体型医药配制剂均在一种容器内提供。在一个实施方案中，该容器是一种聚碳酸酯小瓶。在另一个实施方案中，该容器是一种玻璃小瓶。在一个实施方案中，该玻璃小瓶是一种I型硼硅酸盐玻璃小瓶，配有一个涂氟碳的丁基橡胶瓶塞。在另一个实施方案中，该容器是一种微量注射器。在另一个实施方案中，该容器是一种注射器。在一个特别的实施方案中，该注射器包括一种涂氟碳的柱塞。在一个特别的实施方案中，该注射器是一种ImL长型玻璃注射器,其含鹤量低于约10亿分之500,配有一根27-G注射针、一个涂氟碳的丁基橡胶塞以及一个不含胶乳、无细胞毒性的橡胶端盖。在一个更特别的实施方案中，该注射器是一种NUOVA OMPIlmL长型玻璃注射器，配有一根27-G薄壁注射针、一个涂有FLUR0TEC的4023/50橡胶塞以及一个FM27橡胶端盖。在另一个特别的实施方案中，该注射器是一种ImL或3mL塑料注射器,配有一根27-G注射针。在一个更特别的实施方案中，该塑料注射器是由BECT0NDICKINS0N经销的。
[0035]在一个方面，提供了一种医药配制剂，其含有(a) 175mg/mL±26.25mg/mL抗PCSK9抗体，(b)10mM±l.5mM 组氨酸，pH 值为 6±0.3，(c)0.01% w/v±0.0015%聚山梨醇酯 20，
(d)5% w/v±0.75%蔗糖，以及(e)50mM±7.5mM精氨酸，其中(a)所述抗体包含一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD，(b)该配制剂中90 %以上抗体的分子量为155kDa±lkDa，(c)该配制剂中50%以上抗体的等电点约为8.5，以及(d)该配制剂中75%至90%抗体是岩藻糖基化抗体。
[0036]在一个实施方案中，所述医药配制剂为下列组分的水溶液:(a) 175mg/mL±26.25mg/mL 前段中所述抗 PCSK9 抗体，(b) 10mM± 1.5mM 组氨酸，ρΗ6±0.3，(c)0.01%w/v±0.0015%聚山梨醇酯 20，(d)5%w/v±0.75%蔗糖，以及(e)50mM±7.5mM 精氨酸。
[0037]在一个方面，提供了一种医药配制剂，其含有(a)150mg/mL±22.5mg/mL抗PCSK9抗体，(b) 10mM±l.5mM组氨酸，pH值为6±0.3，(c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯20，以及
(d)10%W/V±l.5%蔗糖，其中(i)所述抗体包含一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD，(ii)该配制剂中90%以上抗体的分子量为155kDa±lkDa，(iii)该配制剂中50%以上抗体的等电点约为8.5，以及(iv)该配制剂中75%至90%抗体是岩藻糖基化抗体。[0038]在一个实施方案中，所述医药配制剂为下列组分的水溶液:(a) 150mg/mL±22.5mg/mL 前段中所述抗 PCSK9 抗体，(b) 10mM± L 5mM 组氨酸，ρΗ6±0.3，(c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯20，以及(d) 10% w/v±l.5%蔗糖。
[0039]在一个方面，提供了一种医药配制剂，其含有(a)150mg/mL±22.5mg/mL抗PCSK9抗体，(b)10mM±l.5mM 组氨酸，pH 值为 6±0.3，(c)0.01% w/v±0.0015%聚山梨醇酯 20，以及(d) 10^^/41.5%蔗糖，其中⑴所述抗体包含一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD, (ii)该配制剂中90%以上抗体的分子量为155kDa±lkDa，(iii)该配制剂中50%以上抗体的等电点约为8.5，以及(iv)该配制剂中75%至90%抗体是岩藻糖基化抗体。
[0040]在一个实施方案中，所述医药配制剂为下列组分的水溶液:(a) 150mg/mL±22.5mg/mL 前段中所述抗 PCSK9 抗体，(b) 10mM± 1.5mM 组氨酸，ρΗ6±0.3，(c)0.01%w/v±0.0015%聚山梨醇酯 20，以及(d) 10% w/v±l.5%蔗糖。
[0041]在一个方面，提供了一种医药配制剂，其含有(a) 100mg/mL± 15mg/mL抗PCSK9抗体，(b)20mM±3mM组氨酸，pH值为6±0.3，(c) 0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯20，以及
(d)12 % w/v ± 1.8 %蔗糖，其中(i)所述抗体包含一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD，(ii)该配制剂中90%以上抗体的分子量为155kDa±lkDa，(iii)该配制剂中50%以上抗体的等电点约为8.5，以及(iv)该配制剂中75%至90%抗体是岩藻糖基化抗体。
[0042]在一个实施方案中，所述医药配制剂为下列组分的水溶液:(a) 100mg/mL± 15mg/mL 前段中所述抗 PCSK9 抗体，(b)20mM±3mM 组氨酸，pH6±0.3, (c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯20，以及(d)12%界八±1.8%蔗糖。
[0043]在一个方面，提供了一种医药配制剂，其含有(a) 50mg/mL±7.5mg/mL抗体，
(b)10mM±l.5mM 组氨酸，pH 值为 6±0.3，(c)0.1 % w/v±0.015 % 聚山梨醇酯 20，以及
(d)6% w/v±0.9%蔗糖，其中(i)所述抗体包含一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD，(ii)该配制剂中90%以上抗体的分子量为155kDa±lkDa，(iii)该配制剂中50%以上抗体的等电点约为8.5，以及(iv)该配制剂中75%至90%抗体是岩藻糖基化抗体。
[0044]在一个实施方案中，所述医药配制剂为下列组分的水溶液:(a) 50mg/mL±7.5mg/mL 前段中所述抗 PCSK9 抗体，(b) 10mM±l.5mM 组氨酸，ρΗ6±0.3，(c) 0.1 % w/v±0.015%聚山梨醇酯20，以及(d)6% w/v±0.9%蔗糖。
[0045]在一个方面，提供了一种含抗PCSK9抗体和少于0.3%水的冻干型组合物的制备方法。所述方法包括下列步骤:(a)在一个玻璃小瓶内将水、一种抗PCSK9抗体、组氨酸、蔗糖和聚山梨醇酯20混合，(b)然后将该混合物于约5°C保持约60分钟；(c)然后以每分钟约0.5°C的速率降温，(d)然后将该混合物于约_45°C保持约120分钟，(e)然后将大气压降至约100毫托，(f)然后以每分钟约0.5°C的速率升温，(g)然后将该混合物于约_25°C保持约78小时(h)然后以每分钟0.2°C的速率升温，(i)然后将该混合物于约35°C保持约6小时，(j)然后以每分钟约0.5°C的速率降温，以及(k)在储存前，将该混合物于约25°C保持约60分钟。
[0046]在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤:(1)用氮气填充含有步骤(k)之混合物的玻璃小瓶；以及(m)于约80%大气压下给该小瓶加塞。在一个实施方案中，所述组合物在步骤(i)、(j)或(k)之后和小瓶加塞步骤之前先降温至2_8°C。[0047]在某些实施方案中，步骤(a)中所述抗PCSK9抗体浓度为50mg/mL±7.5mg/mL,组氨酸浓度为10mM±l.5mM(pH6.0)，聚山梨醇酯20浓度为0.1% ±0.015%，蔗糖浓度为6%±0.9%。在一个实施方案中，所述抗PCSK9抗体包含一个序列号为2的HCDRl、一个序列号为3的HCDR2、一个序列号为4的HCDR3、一个序列号为6的IXDR1、一个序列号为7的IXDR2，以及一个序列号为8的IXDR3。mAb_316P。在一个实施方案中，所述抗体含有一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD。在一个实施方案中，(i)所述抗体包含一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD ； (ii)该组合中90%以上的所述抗体分子量为155kDa± IkDa ； (iii)该组合中50%以上的所述抗体等电点约为8.5 ;以及(iv)该组合中75%至90%所述抗体是岩藻糖基化抗体。
[0048]在一个方面，提供了一种按照前一方面所述方法制备的含抗PCSK9抗体和少于0.3%水的冻干型医药组合物。
[0049]在一个方面，提供了一种医药组合物，其含有重新悬浮在水中的前一方面所述的冻干型医药组合物。在一个实施方案中，所述医药组合物为下列组分的水溶液:50mg/mL±7.5mg/mL 抗 PCSK9 抗体、10mM±l.5mM 组氨酸(pH6.0)、0.1 % ±0.015 % 聚山梨醇酯20，以及6% ±0.9%蔗糖。在一个实施方案中，所述医药组合物为下列组分的水溶液:100mg/mL±15mg/mL 抗 PCSK9 抗体、20mM±3mM 组氨酸(pH6.0)、0.2% ±0.03%聚山梨醇酯20，以及12% ±1.8%蔗糖。在另一个实施方案中，所述医药组合物为下列组分的水溶液:150mg/mL±22.5mg/mL 抗 PCSK9 抗体、30mM±4.5mM 组氨酸(ρΗ6.0),0.3% ±0.045 %聚山梨醇酯20，以及18% ±2.7%蔗糖。在另一个实施方案中，所述医药组合物为下列组分的水溶液:175mg/mL±26.25mg/mL 抗 PCSK9 抗体、35mM±5.25mM 组氨酸(ρΗ6.0) ,0.35%±0.0525%聚山梨醇酯20，以及21% ±3.15%蔗糖。
[0050]在某些实施方案中，(a)所述抗体包含一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD ； (b)该组合中90%以上的所述抗体分子量为155kDa土 IkDa ； (c)该组合中50%以上的所述抗体等电点约为8.5;以及(d)该组合中75%至90%所述抗体是岩藻糖基化抗体。
[0051]在一个方面，提供了一种前面诸方面所述的任何一种医药组合物，其中所述组合物被装在一个容器内。在一个实施方案中，该容器是一种小瓶，在某些实施方案中是一种玻璃小瓶。在另一个实施方案中，该容器是一种注射器。在某些实施方案中，该注射器是一种低钨玻璃注射器。在一个实施方案中，该注射器是一种NUOVA OMPIlmL长型玻璃注射器，配有一根27-G薄壁注射针、一个涂有FLUR0TEC的4023/50橡胶塞，以及一个FM27橡胶端盖。
[0052]在一个方面，提供了一种含有前面诸方面所述的任何一种医药组合物的试剂盒、一种容器，以及说明书。在一个实施方案中，该容器是一种预充式注射器。在一个特别的实施方案中，该注射器是一种NUOVA OMPIlmL长型玻璃注射器，配有一根27-G薄壁注射针、一个涂有FLUR0TEC的4023/50橡胶塞，以及一个FM27橡胶端盖。
[0053]在审阅随后的详细说明过程中，本发明之其它实施方案将变得明显。
[0054]详细说明
[0055]在叙述本发明之前先要指出，应该理解，本发明并不限于所述的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解，本文所用的术语仅出于说明具体实施方案的目的，并非意在限制本发明，因为本发明之范围仅受所附权利要求书的限制。[0056]除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均将具有与本发明所属【技术领域】的普通专业人员通常理解的相同含义。本文中所用的术语”约”，当用于列出的某一具体数值或数值范围时，意为该数值可在与所列数值相差不大于I %之范围内变化。例如，本文中所用的表达“约100 “包括99和101以及此两者之间的所有数值(例如99.1,99.2,99.3、99.4 等)。
[0057]尽管与本文所述之方法和材料类似或相当的任何方法和材料都可用于本发明之实施或试验，但现在描述的是较佳的方法和材料。本文所提及的所有出版物均通过引用而以其整体纳入本文。
[0058]医药配制剂
[0059]本文所用的表达"医药配制剂"意为至少一种活性成分(例如能够给人类或非人类动物施加某种生物效应的小分子、大分子、化合物等)和至少一种非活性成分(当其与活性成分或一种或多种其它非活性成分结合时，适合于给人类或非人类动物治疗性给药)的结合。除非另行特别说明，本文所用的术语“配制剂”意为“医药配制剂”。本发明提供了含有至少一种治疗性多肽的医药配制剂。按照本发明的某些实施方案，所述治疗性多肽是一种与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (PCSK9)蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段。更确切地说，本发明包括含有以下组分的医药配制剂:(i) 一种与人PCSK9特异性结合的抗体；(ii) 一种组氨酸缓冲剂；(iii) 一种有机共溶剂(一种非离子型表面活性剂)；(iv)热稳定剂(一种碳水化合物)；以及可选的(V) —种减粘剂(一种盐)。本发明所包括的具体示范性组分和配制剂将在下文中详述。
[0060]与PCSK9特异性结合的抗体
[0061]本发明的医药配制剂可包含一种与人PCSK9特异性结合的抗体或其抗原结合片段。本文所用的术语“PCSK9”意为一种人类前蛋白转化酶，属于分泌枯草杆菌酶家族的蛋白酶K亚族。证据提示，通过与低密度脂蛋白颗粒受体结合和促进其降解，PCSK9可提高血浆LDL水平。一种示范性人PCSK9氨基酸序列在9号序列中叙述。US2010/0166768、US2011/0065902和W02010/077854等专利申请公开书均叙述了抗人PCSK9的抗体。
[0062]本文所用的术语“抗体”一般是指由四条多肽链即两条重(H)链和两条轻(L)链以二硫键相互连接而组成的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如IgM);但是，仅由重链组成(即缺乏轻链)的免疫球蛋白分子也包括在术语“抗体”的定义之内。每条重链均包含一个重链可变区(本文简称为HCVR或VH)和一个重链恒定区。该重链恒定区包含三个结构域:CH1、CH2和CH3。每条轻链均包含一个轻链可变区(本文简称为LCVR或和一个轻链恒定区。该轻链恒定区包含一个结构域(CLl)。V1^P'区可进一步分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着较保守的称为框架区(FR)的区域。每个Vh和'均由三个CDR和四个FR组成，从胺基端到羧基端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
[0063]除非另行特别指出，本文所用的术语“抗体”应被理解为包括完整抗体分子及其抗原结合片段。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”或“抗体片段”)是指抗体中保持了与人PCSK9或其表位特异性结合能力的一个或多个片段。
[0064]本文所用的“分离抗体”意指实质上不含其它具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如与人PCSK9特异性结合的分离抗体就在实质上不含能与除人PCSK9以外的抗原特异性结合的抗体)。
[0065]“特异性结合”或类似术语意为一个抗体或抗原结合片段与一个在生理条件下相对稳定的抗原形成复合体。特异性结合可以至少约为I X IO-6M或更大的解离常数来描述。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振等方法。但是，与人PCSK9特异性结合的分离抗体对于其它抗原，如源自其它物种的PCSK9分子(直系同源物)，可具有交叉反应性。在本发明的情况下，与人PCSK9以及一个或一个以上其它抗原结合的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，也被认为是与人PCSK9 “特异性结合”的抗体。而且，分离抗体可实质上不含其它细胞材料或化学物质。
[0066]可被包括在本发明的医药配制剂内的示范性抗人PCSK9抗体在专利申请公开书US2010/0166768、US2011/0065902和W02010/077854中均有阐述，其公开内容均通过引用以其整体纳入本文。
[0067]按照本发明的某些实施方案，所述抗人PCSK9mAb_316P抗体是一种人IgGl，含有一个重链可变区(系IGHV3-23亚型)和一个轻链可变区(系IGKV4-1亚型)(参阅 Barbie and Lefranc, The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genesand Joining (IGKJ) Segments, Exp.Clin.1mmunogenet.1998 ； 15:171-183 ；及 Scaviner,D.et al., Protein Displays of the Human Immunoglobulin Heavy, Kappa and LambdaVariable and Joining Regions, Exp.Clin.1mmunogenet., 1999 ； 16:234-240)。
[0068]在某些实施方案中，所述抗人PCSK9mAb_316P含有至少一个氨基酸取代，其导致该抗体相对于种系IGKV4-1序列的一个暴露表面上的一种电荷变化。所述种系IGKV4-1序列和本文所提出的氨基酸位置指定编号均遵循如Lefranc，Μ.-P.，etal.，1MGT?,, the international ImMunoGeneTics information system?,, Nuc1.Acids Res, 37，D1006-D1012(2009)所述的国际免疫遗传学(MGT)信息系统。在某些实施方案中，所述暴露表面包含一个互补决定区(CD R)。在某些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是选自取代IGKV4-1的CDRl内(例如位置32上)不带电的极性氨基酸的碱性氨基酸。抗体电荷分布的独特排列，尤其是在环境介面上(例如在CDR中)的排列，预期将产生变幻莫测的条件，从而维持或促进抗体在溶液中的稳定性。
[0069]在某些实施方案中，所述抗人PCSK9mAb_316P抗体含有至少一个氨基酸取代，其在抗体相对于种系IGHV3-23序列或种系IGKV4-1序列的一个可变区的框架区中产生了一种电荷变化。在某些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是选自(a)对于IGHV3-23的框架区3(FR3)(例如位置77上)内一个极性氨基酸的一种疏水性氨基酸取代，以及(b)对于IGKV4-1的框架区2 (FR2)(例如位置51上)内一个碱性氨基酸的一种极性氨基酸取代。肽链折叠能力的变化，尤其是框架区内的变化，将影响CDR与溶剂的界面，预期将产生变幻莫测的条件，从而维持或促进抗体在溶液中的稳定性。
[0070]按照本发明的某些实施方案，所述抗人PCSK9抗体或其抗原结合片段包括一个序列号为2的重链互补决定区HCDR1、一个序列号为3的HCDR2，以及一个序列号为4的HCDR3。在某些实施方案中，抗人PCSK9抗体或其抗原结合片段包含一个序列号为I的HCVD。
[0071]按照本发明的某些实施方案，所述抗人PCSK9抗体或其抗原结合片段包括一个序列号为6的轻链(K)互补决定区IXDR1、一个序列号为7的IXDR2,以及一个序列号为8的IXDR3。在某些实施方案中，抗人PCSK9抗体或其抗原结合片段包含一个序列号为5的LCVD。
[0072]在本文实施例中所用的非限制性、示范性抗体被称为“mAb_316P”。此抗体在US7, 608, 693中又被称为H4H098P。mAb_316P (H4H098P)含有一个序列对号为1/5的HCVP/LCVR氨基酸序列对；以及以序列对号2-3-4/6-7-8代表的HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3 结构域。
[0073]取决于希望该配制剂所具有的特定性质，以及打算使用该配制剂的具体环境和目的，本发明之医药配制剂中所包含的抗体或其抗原结合片段量是可以改变的。在某些实施方案中，该医药配制剂是液体型配制剂，其中可含有50±7.5mg/mL至250±37.5mg/mL 抗体；60±9mg/mL 至 240±36mg/mL 抗体；70±10.5mg/mL 至 230±34.5mg/mL 抗体；80 土 12mg/mL 至 220±33mg/mL 抗体；90 土 13.5mg/mL 至 210 ±31.5mg/mL 抗体；100 土 15mg/mL 至 200±30mg/mL 抗体；110± 16.5mg/mL 至 190±28.5mg/mL 抗体；120± 18mg/mL至 180±27mg/mL 抗体；130± 19.5mg/mL 至 170±25.5mg/mL 抗体；140±21mg/mL 至160±24mg/mL抗体150±22.5mg/mL抗体；或175±26.25mg/ml。例如，本发明之配制剂可包含约 50mg/mL 约 60mg/mL ;约 65mg/mL ;约 70mg/mL ;约 75mg/mL ;约 80mg/mL ;约 85mg/mL ；约 90mg/mL ;约 95mg/mL ;约 100mg/mL ;约 105mg/mL ;约 110mg/mT,;约 115mg/mL ;约 120mg/mL ；约 125mg/mL ；约 130mg/mL 约 135mg/mL ；约 140mg/mT,约 145mg/mL ；约 150mg/mL ；约155mg/mL ;约 160mg/mL 约 165mg/mL ;约 170mg/mL 约 175mg/mL ;约 180mg/mL 约 185mg/mL ；约 190mg/mL ;约 195mg/mL ;约 200mg/mL ;约 205mg/mL ;约 210mg/mL ;约 215mg/mL ;约 220mg/mL ;约 225mg/mL ;约 230mg/mL ;约 235mg/mL ;约 240mg/mL ;约 245mg/mL ;或约 250mg/mL 与人PCSK9特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
[0074]赋形剂和pH值
[0075]本发明之医药 配制剂包含一种或多种赋形剂。本文所用的术语“赋形剂”意为加入该配制剂以赋予所需的一致性、粘度或稳定效应的任何非治疗剂。
[0076]在某些实施方案中，本发明之医药配制剂包含至少一种有机共溶剂，其类型和用量可在剧烈操作或搅拌条件下，例如涡旋条件下，稳定所述人PCSK9抗体。在某些实施方案中，所谓“稳定”的意思是在剧烈的操作过程中，预防抗体总量的3% (以摩尔计)以上形成聚集抗体。在某些实施方案中，剧烈操作是指使含有抗体和有机共溶剂的溶液涡旋约60分钟或约120分钟。
[0077]在某些实施方案中，所述有机共溶剂是一种非离子型表面活性剂，如烷基聚氧乙烯。可包括在本发明之配制剂中的具体非离子型表面活性剂包括，例如聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81，以及聚山梨醇酯85);聚羟体(如聚羟体181、聚羟体188、聚羟体407)；或聚7 二醇(PEG)。聚山梨醇酯20又称为TWEEN20、山梨糖醇酐单月桂酸酯和聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯。聚羟体188又称为PLURONIC F68。
[0078]取决于希望该配制剂所具有的特定性质，以及打算使用该配制剂的具体环境和目的，本发明之医药配制剂中所包含的非离子型表面活性剂的量是可以改变的。在某些实施方案中，所述配制剂可包含0.01% ±0.0015%至0.2% ±0.03%表面活性剂。例如，本发明之配制剂可包含约0.0085% ;约0.01% ;约0.02% ;约0.03% ;约0.04% ;约0.05% ;约0.06% ;约 0.07% ;约 0.08% ;约 0.09% ;约 0.1% ;约 0.11% ;约 0.12% ;约 0.13% ;约0.14% ;约 0.15% ;约 0.16% ;约 0.17% ;约 0.18% ;约 0.19% ;约 0.20% ;约 0.21% ;约0.22% ;或约0.23%聚山梨醇酯20或聚羟体188。
[0079]本发明之医药配制剂也可包含一种或多种稳定剂，其类型和用量可在热应力条件下稳定所述人PCSK9抗体。在某些实施方案中，所谓“稳定”的意思是当含有该抗体和热稳定剂的溶液于约45°C保温多达约28天时，仍可使约91%以上的抗体保持天然构象。在某些实施方案中，所谓“稳定”的意思是当含有该抗体和热稳定剂的溶液于约45°C保温多达约28天时，只有少于约6%的抗体发生聚集。本文所用的“天然”意为以尺寸排阻法测定的抗体主要形式，其总的说来是一种完整的抗体单体。 [0080]在某些实施方案中，所述热稳定剂是一种选自蔗糖、海藻糖和甘露糖醇或其任何组合的糖或糖醇，取决于使用该配制剂的具体环境和预期目的，该配制剂所含的热稳定剂用量可以改变。在某些实施方案中，该配制剂可含有约3%至约14%糖或糖醇；约4%至约13%糖或糖醇；约5%至约12%糖或糖醇；约6%至约11%糖或糖醇；约7%至约10%糖或糖醇；约8%至约9%糖或糖醇；约4%至约6%糖或糖醇；约5%至约7%糖或糖醇；约9%至约11%糖或糖醇；或约11%至约13%糖或糖醇。例如，本发明的医药配制剂可含有4% ±0.6% ；5% ±0.75% ；6% ±0.9% ；7% ±1.05% ；8% ±1.2% ；9% ±1.35% ；10%±1.5%;11% ±1.65%;12% ±1.8%;13% ±1.95%;或约 14% ±2.1%糖或糖醇(例如蔗糖、海藻糖或甘露糖醇)。
[0081]本发明之医药配制剂也可包含一种缓冲剂或缓冲剂体系，其作用是维持稳定的PH值和帮助稳定所述人PCSK9抗体。在某些实施方案中，所谓“稳定”的意思是当含有该抗体和缓冲剂的溶液于约45°C保存多达约28天时，只有少于4.5% ±0.5%或少于6.0%±0.5%的抗体发生聚集。在某些实施方案中，所谓“稳定”的意思是当含有该抗体和缓冲剂的溶液于约37°C保存多达约28天时，只有少于3% ±0.5%或少于2.6% ±0.5%的抗体发生聚集。在某些实施方案中，所谓“稳定”的意思是当含有该抗体和缓冲剂的溶液于约45°C保存多达约28天时，根据尺寸排阻色谱法测定，有至少91% ±0.5%或至少92% ±0.5%的抗体处于其天然构象状态。在某些实施方案中，所谓“稳定”的意思是当含有该抗体和缓冲剂的溶液于约37°C保存多达约28天时，根据尺寸排阻色谱法测定，有至少94% ±0.5%或至少95% ±0.5%的抗体处于其天然构象状态。所谓“天然”或“天然构象”的意思是指未聚集或未降解的那部分抗体。通常这是以测量抗体整体相对尺寸的方法如尺寸排阻色谱测定法测定的。未聚集和未降解的抗体是以相当于天然抗体的馏分洗脱的，且通常是主要洗脱馏分。聚集的抗体是在尺寸大于天然抗体的馏分中洗脱的。降解的抗体是在显示尺寸小于天然抗体的馏分中洗脱的。
[0082]在某些实施方案中，所谓“稳定”的意思是当含有该抗体和缓冲剂的溶液于约45°C保存多达约28天时，根据阳离子交换色谱法测定，有至少38% ±0.5%或至少29%±0.5%的抗体处于其主要荷电形式。在某些实施方案中，所谓“稳定”的意思是当含有该抗体和缓冲剂的溶液于约37土C保存多达约28天时，根据阳离子交换色谱法测定，有至少46% ±0.5%或至少39% ±0.5%的抗体处于其主要荷电形式。所谓“主要荷电”或“主要荷电形式”的意思是指从离子交换树脂以主峰形式洗脱的抗体馏分，通常在主峰一侧有较为“碱性”的峰，在主峰另一侧有较为“酸性”的峰。
[0083]本发明之医药配制剂的pH值可处于约5.2至约6.4的范围。例如，本发明之配制剂的pH值可为约5.5 ;约5.6 ;约5.7 ;约5.8 ;约5.9 ;约6.0 ;约6.1 ;约6.2 ;约6.3 ;约6.41 或约6.5。在某些实施方案中，该pH值可为 6.0±0.4 ；6.0±0.3 ；6.0±0.2 ；6.0±0.I ；约 6.0 ;或6.0。
[0084]在某些实施方案中，该缓冲剂或缓冲剂体系含有至少一种缓冲剂，其缓冲范围完全或部分地覆盖PH5.5至7.4的范围。在一个实施方案中，该缓冲剂的pKa约为6.0±0.5。在某些实施方案中，该缓冲剂含有一种组氨酸缓冲剂。在某些实施方案中，该组氨酸的浓度为 5mM±0.75mM 至 15mM±2.25mM ;6mM±0.9mM 至 14mM±2.1mM ;7mM±l.05mM 至13mM±l.95mM ;8mM±l.2mM 至 12mM±l.8mM ;9mM±l.35mM 至 llmM±l.65mM ;10mM±l.5mM ；或约10mM。在某些实施方案中，该缓冲剂体系含有的组氨酸浓度为10mM±l.5mM, pH值为6.0±0.3。
[0085]本发明之医药配制剂也可包含一种或多种赋形剂，用于维持较低的粘度或降低含有高浓度抗PCSK9抗体药物(例如，通常> 150mg/ml抗体)的配制剂之粘度。在某些实施方案中，该配制剂含有精氨酸，其含量足以将该液体型配制剂的粘度维持在低于20±3厘泊、低于15±2.25厘泊，或低于11 ± 1.65厘泊。在某些实施方案中，该配制剂含有精氨酸，其含量足以将粘度维持在10.6±1.59厘泊或之下。在某些实施方案中，本发明之配制剂含有精氨酸，较佳的是L-精氨酸盐酸盐，其浓度为10mM±l.5mM至90mM±13.5mM、20mM±3mM至 80mM±12mM、30mM±4.5mM 至 70mM±10.5、40mM±6mM 至 60土g mM 或 50mM±7.5mM。
[0086]示范性配制剂
[0087]按照本发明的 一个方面，该医药配制剂是一种低粘度、通常是生理等渗性液体型配制剂，其含有:(i) 一种与人PCSK9特异性结合的人抗体(例如mAb-316P)，其浓度为50mg/mL + 7.5mg/mL、100mg/rnl ± 15mgmL、150mg/rnL±22.5mg/mL,或 175mg/mL + 26.25mg/mL ； (ii) 一种缓冲剂体系，于约pH6.0±0.3起足够的缓冲作用；(iii) 一种糖，其主要作用是作为一种热稳定剂；(iv) —种有机共溶剂，其作用是保护抗体的结构完整性；以及(V) —种氨基酸盐，其作用是将粘度维持在易于控制的水平，以便以方便的剂量进行皮下注射。
[0088]按照一个实施方案，该医药配制剂含有:(i) 一种人IgGl抗体，其与人PCSK9特异性结合且含有一个取代的IGHV3-23型重链可变区和一个取代的IGLV4-1型轻链可变区(例如mAb-316P)，其浓度为50±7.5mg/mL至约175±26.25mg/mL ； (ii) 一种含有组氨酸的缓冲剂体系，其于约pH6.0±0.3条件下起有效的缓冲作用；(iii)鹿糖；(iv) —种非离子型去污剂，如聚山梨醇酯；以及可选的(V) —种精氨酸盐。
[0089]按照一个实施方案，该医药配制剂含有:⑴一种人IgGl抗体，其与人PCSK9特异性结合且含有一个序列号为2的HCDR1、一个序列号为3的HCDR2、一个序列号为4的HCDR3、一个序列号为6的IXDRl、一个序列号为7的LCDR2，以及一个序列号为8的IXDR3，其浓度为175mg/ml±26.25mg/mL ；(ii)组氨酸，其浓度为 10mM±l.5mM，于ρΗ6.0±0.3条件下起缓冲作用蔗糖，其浓度为5%W/v±0.75%w/v ；(iv)聚山梨醇酯20，其浓度为0.01 % w/v±0.0015% w/v ;以及(V) L-精氨酸盐酸盐，其浓度为50mM±7.5mM。
[0090]按照一个实施方案，该医药配制剂含有:⑴一种人IgGl抗体，其与人PCSK9特异性结合且含有一个序列号为2的HCDR1、一个序列号为3的HCDR2、一个序列号为4的HCDR3、一个序列号为6的IXDR1、一个序列号为7的IXDR2，以及一个序列号为8的IXDR3，其浓度约为 150mg/ml±22.5mg/mL ；(ii)组氨酸，其浓度为 10mM± 1.5mM，于 ρΗ6.0±0.3 条件下起缓冲作用蔗糖，其浓度为10% w/v ±1.5% w/v;以及(iv)聚山梨醇酯20，其浓度为0.2% w/v±0.03% w/v 或 0.01 % w/v±0.0015% w/v。
[0091]按照一个实施方案，该医药配制剂含有:(i) 一种人IgGl抗体，其与人PCSK9特异性结合且含有一个序列号为2的HCDR1、一个序列号为3的HCDR2、一个序列号为4的HCDR3、一个序列号为6的IXDR1、一个序列号为7的IXDR2，以及一个序列号为8的IXDR3，其浓度约为100mg/mi±15mg/mL ; (ii)组氨酸,其浓度约为20mM±3mM,于ρΗ6.0±0.3条件下起缓冲作用蔗糖，其浓度为12% w/v±1.8% w/v ;以及(iv)聚山梨醇酯20，其浓度为0.2% w/v±0.03% w/v 或 0.01 % w/v±0.0015% w/v。
[0092]按照一个实施方案，该医药配制剂含有:⑴一种人IgGl抗体，其与人PCSK9特异性结合且含有一个序列号为2的HCDR1、一个序列号为3的HCDR2、一个序列号为4的HCDR3、一个序列号为6的IXDR1、一个序列号为7的IXDR2，以及一个序列号为8的IXDR3，其浓度约为50mg/ml ±7.5mg/mL ； (ii)组氨酸，其浓度为IOmM土 1.5mM,于pH6.0±0.3条件下起缓冲作用蔗糖，其浓度为6% W/V±0.9% w/v;以及(iv)聚山梨醇酯20，其浓度为0.1 % w/v±0.015% w/v 或 0.01 % w/v±0.0015% w/v。
[0093]按照一个实施方案，该医药配制剂含有:⑴一种人IgGl抗体，其与人PCSK9特异性结合且含有一个序列号为I的重链可变区以及一个序列号为5的轻链可变区，其浓度为175mg/ml±26.25mg/mL ； (ii)组氨酸，其浓度为 10mM±l.5mM，于pH6.0±0.3 条件下起缓冲作用蔗糖，其浓度为5% w/v±0.75%w/v ；(iv)聚山梨醇酯20，其浓度为0.01 % w/v±0.0015% w/v ;以及(V) L-精氨酸盐酸盐，其浓度为50mM±7.5mM。
[0094] 按照一个实施方案，该医药配制剂含有:⑴一种人IgGl抗体，其与人PCSK9特异性结合且含有一个序列号为I的重链可变区以及一个序列号为5的轻链可变区，其浓度约为 150mg/ml±22.5mg/mL ；(ii)组氨酸，其浓度为 10mM± 1.5mM，于 pH6.0±0.3 条件下起缓冲作用蔗糖，其浓度为lO^w/vil.S^w/v;以及(iv)聚山梨醇酯20，其浓度为0.2% w/v±0.03% w/v 或 0.01 % w/v±0.0015% Mv。
[0095]按照一个实施方案，该医药配制剂含有:⑴一种人IgGl抗体，其与人PCSK9特异性结合且含有一个序列号为I的重链可变区以及一个序列号为5的轻链可变区，其浓度约为100mg/ml±15mg/mL ; (ii)组氨酸,其浓度约为20mM±3mM,于pH6.0±0.3条件下起缓冲作用蔗糖，其浓度为12% w/v± 1.8% w/v以及(iv)聚山梨醇酯20，其浓度为0.2%w/v±0.03% w/v 或 0.01 % w/v±0.0015% w/v。
[0096]按照一个实施方案，该医药配制剂含有:⑴一种人IgGl抗体，其与人PCSK9特异性结合且含有一个序列号为I的重链可变区以及一个序列号为5的轻链可变区，其浓度约为50mg/ml±7.5mg/mL ；(ii)组氨酸，其浓度为10mM± 1.5mM，于pH6.0±0.3条件下起缓冲作用蔗糖，其浓度为6% w/v±0.9% w/v以及(iv)聚山梨醇酯20，其浓度为0.1%w/v±0.015% w/v 或 0.01 % w/v±0.0015% w/v。
[0097]本发明所包括的医药配制剂的其它非限制性实例在本文的其它部分阐述，包括下文所述的工作实施例。
[0098]医药配制剂的稳定性和粘度
[0099]本发明之医药配制剂通常展示高度的稳定性。本文关于医药配制剂所用的术语“稳定的”意为该医药配制剂内的抗体在一定条件下储存之后仍保持可接受程度的化学结构或生物功能。即使所含的抗体在经过一定时间储存之后未能保持其100%的化学结构或生物功能，医药配制剂也可以是稳定的。在某些情况下，在经过一定时间储存之后，能维持约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的抗体结构或功能，也可被认为是“稳定的”。
[0100]当配制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，通过测定其中剩余的天然抗体的百分比(及其它方法)，可以测量其稳定性。除其它方法外，天然抗体的百分比可以通过尺寸排阻色谱法(例如尺寸排阻高效液相色谱法[SE-HPLC])来测量，于是，“天然的”就意味着未聚集的和未降解的。本文所用的短语“可接受程度的稳定性”意为，当配制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，其中可检测出至少90%天然形式的抗体。在某些实施方案中，当配制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，其中可检测出至少约92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%天然形式的抗体。在测量稳定性之前储存的一定时间可以是至少14天、至少28天、至少I个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，或更长。当评估稳定性时，容许储存医药配制剂的一定温度可以是约_80°C至约45°C范围内的任何温度，例如储存于约_80°C、约-30°C、约-20°C、约(TC、约 4-8°C、约 5°C、约 25°C、约 35°C、约 37°C，或约 45°C。例如，如果于5°C温度下储存6个月之后，以SE-HPLC检测出多于约95%、96%、97%或98%的天然抗体，就可认为医药配制剂是稳定的。如果于25°C温度下储存6个月之后，以SE-HPLC检测出多于约94%、95 %、96 %、97 %或98 %的天然抗体，也可认为医药配制剂是稳定的。如果于45°C温度下储存28天之后，以SE-HPLC检测出多于约91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%或98%的天然抗体，也可认为医药配制剂是稳定的。如果于_20°C温度下储存3个月之后，以SE-HPLC检测出多于约96%、97%或98%的天然抗体，也可认为医药配制剂是稳定的。如果于_30°C温度下储存3个月之后，以SE-HPLC检测出多于约96%、97%或98%的天然抗体，也可认为医药配制剂是稳定的。如果于_80°C温度下储存3个月之后，以SE-HPLC检测出多于约96 %、97 %或98 %的天然抗体，也可认为医药配制剂是稳定的。
[0101]当配制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，通过测定其中形成聚集物的抗体之百分比(及其它方法)，可以测量稳定性，其中稳定性与所形成聚集物的百分比成反t匕。除其它方法外，聚集抗体的百分比可以通过尺寸排阻色谱法(例如尺寸排阻高效液相色谱法[SE-HPLC])来测量。本文所用的短语“可接受程度的稳定性”意为，当配制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，其中可检测出的聚集形式的抗体最多不超过6%。在某些实施方案中，可接受程度的稳定性意为当配制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，其中可检测出的聚集形式的抗体最多不超过约6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%，或0.1 %。在测量稳定性之前储存的一定时间可以是至少2周、至少28天、至少I个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，或更长。当评估稳定性时，容许储存医药配制剂的温度可以是约_80°C至约45°C范围内的任何温度，例如储存于约-80°C、约-30°C、约-20°C、约(TC、约 4_8°C、约 5°C、约 25°C、约 35°C、约 37°C，或约45°C。例如，如果于5°C温度下储存6个月之后，检测出少于约3%、2%、1%、0.5%或0.1%聚集形式的抗体，就可认为医药配制剂是稳定的。如果于25°C温度下储存6个月之后，检测出少于约4 %、3 %、2 %、I %、0.5 %或0.1 %聚集形式的抗体，也可认为医药配制剂是稳定的。如果于45°C温度下储存28天之后，检测出少于约6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1 %聚集形式的抗体，也可认为医药配制剂是稳定的。如果于-20°c、-30°c或-80°c温度下储存3个月之后，检测出少于约3 %、2 %、I %、0.5 %或0.1 %聚集形式的抗体，也可认为医药配制剂是稳定的。
[0102]通过测定在离子交换期间在比抗体主馏分(“主要荷电形式”)较为酸性的馏分中迁移的抗体(“酸性形式”)的百分比(及其它方法)，可以测量稳定性，其中稳定性与酸性形式抗体的百分比成反比。虽然不希望受理论的约束，但抗体的脱酰氨基反应可使抗体变得带更多的负电荷，从而相对于未脱酰氨基的抗体变得较为酸性(参阅，例如Robinson，N.,Protein Deamidation,PNAS,Aprill6, 2002,99 (8):5283-5288)。除其它方法外，“酸化”抗体的百分比可以通过离子交换色谱法(例如阳离子交换高效液相色谱法[CEX-HPLC])来测量。本文所用的短语“可接受程度的稳定性”意为，当配制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，其中可检测出的较为酸性的抗体最多不超过49%。在某些实施方案中，可接受程度的稳定性意为当配制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，其中可检测出的酸性形式的抗体最多不超过约 49%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3 %、2 %、I %、0.5 %或0.1 %。在测量稳定性之前储存的一定时间可以是至少2周、至少28天、至少I个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，或更长。当评估稳定性时，容许储存医药配制剂的一定温度可以是约-80°C至约45°C范围内的任何温度，例如储存于约-80°C、约-30°C、约-20°C、约(TC、约4_8°C、约5 °C、约25 °C，或约45 °C。例如，一种医药配制剂可被认为是稳定的，如果于-80 V、-30 V或-20°C的温度下储存三个月之后，少于约30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%,21%,20%,19%,18%,17%,16%,15%,14%,13%,12%,10%,9%,8%,7%,6%,
或0.1 %的抗体是处于一种较为酸性的形式。一种医药配制剂可被认为是稳定的，如果于5 °C温度下储存六个月之后，少于约32 %、31 %、30 %、29 %、28%,27%,26%,25%,24%,23%,22%,21 %,20%,19%,18%,17%,16%,15%,14%,13%,12%,10%,9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,1%>0.5%或 0.1 % 的抗体是处于一种较为酸性的形式。一种医药配制剂可被认为是稳定的，如果于25°C温度下储存六个月之后，少于约 43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%,29%,28%,27%,26%,25%,24%,23%,22%,21 %,20%,19%,18%,17%,16%,15%,14%,13%,12%,10%,9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,1%>0.5%或 0.1%的抗体是处于一种较为酸性的形式。一种医药配制剂可被认为是稳定的，如果于45°C温度下储存 28 天之后，少于约 49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%,37%,36%,35%,34%,33%,32%,31 %,30%,29%,28%,27%,26%,25%,24%,23%,22%,21%,20%,19%,18%,17%,16%,15%,14%,13%,12%,10%, g%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%U%>0.5%或0.1 %的抗体是处于一种较为酸性的形式。
[0103]其它方法也可用于评估本发明之配制剂的稳定性，例如，测定热稳定性的差示扫描量热法(DSC)、测定机械稳定性的控制搅拌法，以及于约350nm或约405nm测定溶液浊度的吸收法。例如，如果本发明之配制剂于约5°C至约25°C的温度下储存6个月或更长时间之后，其OD4tl5与最初的OD405相比变化小于约0.05(例如0.04、0.03、0.02、0.01，或更小)，
则可认为配制剂是稳定的。
[0104]测量抗体的生物活性或抗体与其标靶结合的亲和力也可用于评估稳定性。例如，如果配制剂于例如5°C、25°C、45°C等温度下储存一定时间(例如I至12个月)之后，该配制剂所含抗PCSK9抗体与PCSK9结合的亲和力为所述储存之前抗体结合亲和力的至少90%、95%或以上，则可认为本发明之配制剂是稳定的。结合亲和力也可用例如ELISA或等离子共振技术测定。生物活性可用PCSK9活性测定法来测定，例如让一种表达PCSK9的细胞与含有该抗PCSK9抗体的配制剂接触。抗体与这样一种细胞的结合可用例如FACS分析法直接测量。或者，可在存在该抗体的情况下测量PCSK9系统的下游活性，并与不存在该抗体的情况下该PCSK9系统的活性作比较。在某些实施方案中，PCSK9可以对该细胞呈内源性。在其它一些实施方案中，PCSK9可以在该细胞内异位性表达。
[0105]评估配制剂中抗体稳定性的其它方法在下文的实施例中说明。
[0106]本发明之液体型医药配制剂在某些实施方案中可展示低水平至中等水平的粘度。本文所用的术语“粘度”可以是“运动粘度”或“绝对粘度”。“运动粘度”是对流体在重力影响下所产生的抵抗性流动的一种测量指标。当两种相同体积的流体被分别置入两个相同的毛细管粘度计并靠重力流动时，粘性流体流过毛细管所需的时间比粘度较低的流体所需的时间为长。例如，如果一种流体用了 200秒流完而另一种流体用了 400秒，那么在运动粘度表上第二种流体的粘度就是第一种流体的两倍。“绝对粘度”，有时称为动态粘度或简单粘度，是运动粘度与流体密度的乘积(绝对粘度=运动粘度X密度)。运动粘度的量纲是L2/T，其中L是长度，T是时间。通常，运动粘度以厘沲(cSt)表示。运动粘度的国际单位制单位是mm2/s，即lcSt。绝对粘度以厘泊(cP)单位表示。绝对粘度的国际单位制单位是毫帕斯卡-秒(mPa-s),其中 IcP = ImPa-S0
[0107]对于本发明之液体型配制 剂，本文所用的术语“低水平粘度”将表示低于约15厘泊(cP)的绝对粘度。例如，如果当使用标准粘度测量技术测量时，该配制剂展示的绝对粘度为约15cP、约14cP、约13cP、约12cP、约llcP、约IOcPj^] 9cP、约8cP，或更低，则本发明之液体型配制剂将被认为是具有“低粘度”。对于本发明之液体型配制剂，本文所用的术语“中等水平粘度”将表示介于约35cP和约15cP之间的绝对粘度。例如，如果当使用标准粘度测量技术测量时，该配制剂展示的绝对粘度为约34cP、约33cP、约32cP、约31cP、约30cP、约 29cP、约 28cP、约 27cP、约 26cP、约 25cP、约 24cP、约 23cP、约 22cP、约 2 IcP、约 20cP、约19cP、18cP、约17cP、约16cP，或约15.lcP，则本发明之液体型配制剂将被认为是具有“中等粘度”。
[0108]如以下实施例所显示，本发明作出了惊人的发现，通过将抗体与浓度为约25mM至约IDOmM的精氨酸一起配制,可以获得含高浓度(例如从约100mg/ml至至少200mg/mL)抗人PCSK9抗体的低粘度至中等粘度的液体型配制剂。此外，还进一步发现，通过将蔗糖含量调节至低于约10%，可进一步降低该配制剂的粘度。
[0109]容器和给药方法
[0110]本发明之医药配制剂可被容纳在任何适宜于医药和其它治疗组合物储存的容器内。例如，该医药配制剂可被容纳在一个密封和消毒的、具有一定容量的塑料或玻璃容器内，例如小瓶、安瓿、注射器、药筒或药瓶。有各种不同类型的小瓶可用于容纳本发明之配制剂，包括例如透明和不透明(例如琥珀色)的玻璃或塑料小瓶。同样，任何类型的注射器均可用于容纳或注射本发明之医药配制剂。
[0111]本发明之医药配制剂可被容纳在“正常钨含量”注射器或“低钨含量”注射器内。如本发明所属【技术领域】的普通专业人员将会理解，制造玻璃注射器的过程通常涉及用一根热钨棒刺穿玻璃而形成一孔，使液体可通过该孔被吸入或排出注射器。此过程导致痕迹量的钨沉淀在注射器内表面。随后的洗涤和其它处理步骤可降低注射器内的钨含量。本文所用的术语“正常钨含量”意为该注射器含钨量高于或等于十亿分之500(即500ppb)。术语“低钨含量”意为该注射器含钨量低于500ppb。例如，本发明之低钨注射器的含钨量以ppb计可低于约 490、480、470、460、450、440、430、420、410、390、350、300、250、200、150、1D0、90、80、70、60、50、40、30、20、10 或更低。
[0112]注射器内的橡胶柱塞和用于封闭小瓶的橡胶瓶塞可涂有涂层，以防污染注射器或小瓶内的药物，或保持其稳定性。因此，按照某些实施方案，本发明之医药配制剂可被容纳在配有一带涂层柱塞的注射器内，或以带涂层橡胶塞封闭的小瓶内。例如，所述柱塞或瓶塞可以涂一层氟碳薄膜。适宜于在容纳本发明之医药配制剂的小瓶和注射器上使用的带涂层瓶塞或柱塞的实例在下列美国专利中提及:4，997, 423 ;5，908，686 ;6，286, 699 ；6，645，635;以及7，226，554。其内容通过引用而以其整体纳入本文。可用于本发明的特别示范性带涂层瓶塞或柱塞可经由商业途径从West Pharmaceutical Services, Inc.(Lionville, PA)购得,其商标名称为Fluro Tec?。Fluro Tec?,是氟碳涂层的一个实例,用于尽量减少或预防药品粘在橡胶表面。
[0113]按照本发明的某些实施方案，医药配制剂可被容纳在一种含有涂氟碳柱塞的低钨注射器内。
[0114]医药配制剂可通过非肠胃途径如注射(例如皮下、静脉内、肌内、腹膜内等)或经皮、粘膜、鼻腔、肺或口服给药等方式施予患者。许多可重复使用的笔型或自动注射给药装置可用于皮下注射本发明之医药配制剂。其实例包括但不限于AUTOPEN?(Owen Mumford,Inc., Woodstock, UK)、DISETRONIC? 笔(Disetronic Medical Systems, Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX75/25? 笔、HUMALOGTM 笔、HUMALIN70/30? 笔(EliLillyand C0., Indianapolis, IN) > NOVOPEN? 1、II 和 III 型(Novo Nordisk, Copenhagen,Denmark) > NOVOPEN JUNIOR?(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark) > BD? 笔(BectonDickinson, Franklin Lakes, NJ)、OPTIPEN?、OPTIPEN PRO?、OPTIPEN STARLET?,以及OPTICLIK?(sanof1-aventis, Frankfurt, Germany)。用于皮下注射本发明之医药组合物的一次性使用的笔型或自动给药装置的实例包括但不限于S0L0STAR?笔(sanof1-aventis)、FLEXPEN?(Novo Nordisk)、KWIKPENTM(EliLilly)、SURECLICK? 自动注射器(Amgen，Thousand Oaks, CA)、PENLET?(HaseImeier, Stuttgart, Germany)、EPIPEN(Dey, L.P.),以及 HUMIRATM 笔(Abbott Labs, Abbott Park,IL)。
[0115]用于本发明之医药组合物给药的一种微输注器，也包括在本文之中。本文所用的术语“微输注器”意为一种皮下给药装置，设计用于在一段很长的时间内(例如约10、15、20、25、30分钟或更长时间内)缓慢地输注大量(例如多达约2.5mL或更多)的治疗配制剂。参阅例如，U.S.6，629，949 ；US6, 659，982 ；以及 Meehan et al.，J.Controlled Release46:107-116(1996)。对于含有大剂量治疗蛋白的高浓度(例如约100、125、150、175、200mg/mL或更高浓度)或粘性溶液的输注，微输注器尤其有用。
[0116]在一个实施方案中，含有约175mg/mL±26.25mg/mL抗PCSK9抗体的液体型医药配制剂，以约1.14mL±0.17ml的剂量通过一个预充式注射器皮下注射。在一个实施方案中，该注射器是一种ImL长型玻璃注射器，配有一根27-G薄壁注射针、一个涂氟碳的橡胶柱塞和一个橡胶针罩。在一个实施方案中，该注射器是一种OMPIlmL长型玻璃注射器,配有一根27-G注射针、一个FM27橡胶针罩，以及一个涂有FLUROTEC?的4023/50橡胶柱塞。
[0117]在一个实施方案中，含有约150mg/mL±22.5mg/mL抗PCSK9抗体的液体型医药配制剂，以约lmL±0.15ml的剂量通过一个预充式注射器皮下注射。在一个实施方案中，该注射器是一种ImL长型玻璃注射器,配有一根27-G薄壁注射针、一个涂氟碳的橡胶柱塞和一个橡胶针罩。在一个实施方案中，该注射器是一种OMPIlmL长型玻璃注射器,配有一根27-G注射针、一个FM27橡胶针罩，以及一个涂有FLUROTEC?的4023/50橡胶柱塞。
[0118]医药配制剂的治疗用途
[0119]除其它用途外，本发明之医药配制剂可用于治疗、预防或改善任何与PCSK9活性相关的疾病或失调，包括PCSK9介导的疾病或失调。可以本发明之医药配制剂治疗或预防的示范性、非限制性疾病和失调包括各种血脂异常症，例如高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、闻脂血症、家族性闻脂血症、异常β脂蛋白血症、家族性异常β脂蛋白血症、闻甘油三酯血症和家族性高甘油三酯血症。
实施例
[0120]举出以下实施例是为了向本发明所属【技术领域】的普通专业人员就如何利用本发明之方法和组合物提供一个完整的公开和说明，并非是为了限制发明人视为其发明的范围。业已作出努力以确保所用数字(例如剂量、温度等)的准确性，但也应考虑到某些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是指摩尔份数，分子量是指平均分子量，温度是指摄氏度，压力是指大气压或接近大气压。
[0121]最初的配制剂开发活动涉及筛选液体型和冻干型mAb_316P (本发明之抗PCSK9抗体)配制剂所用的有机共溶剂、热稳定剂和缓冲剂，以鉴别与该蛋白相容并提高其稳定性的赋形剂，同时维持接近生理条件的渗透浓度和低粘度以供静脉和皮下注射。为了确定最佳PH值以达到尽可能高的蛋白稳定性，还检验了缓冲条件。
[0122]实施例1:抗PCSK1MAB-316P配制剂的开发
[0123]筛选了各种各样的缓冲剂、有机共溶剂和热稳定剂，以鉴别能提高PCSK9抗体稳定性的赋形剂。为了确定最佳PH值以达到尽可能高的蛋白稳定性，还检验了缓冲条件。这些研究的结果被用于开发适宜于临床使用的稳定的液体型配制剂以及冻干型配制剂，以用于静脉(IV)或皮下注射(SC)。对于冻干型药品，开发了一种简易的两用配制剂，可用无菌注射用水(WFI)重组成浓度为50mg/mL的IV注射液或浓度为100mg/mL的SC注射液。一旦重组至50mg/mL,该药品可进一步稀释并装入含0.9%氯化钠的IV输液袋供IV给药。对于液体型配制剂，将mAb_316P配制成175±27mg/ml和150±23mg/ml两种浓度。在一个实施方案中，浓度为175±27mg/mL的mAb-316P是在10±1.5mM组氨酸(pH6.0±0.3)、0.01% ±0.0015%聚山梨醇酯20和5% ±0.75%蔗糖中配制的。在一个实施方案中，浓度为 150±23mg/mL 的 mAb-316P 是在 10±1.5mM 组氨酸(ρΗ6.0±0.3) ,0.2% ±0.03%或0.01% ±0.0015%聚山梨醇酯20和10% ±1.5%蔗糖中配制的。
[0124]实施例2:抗PCSK1MAB-316P的缓冲剂和pH值
[0125]在液体型配制剂中检验了 pH值和缓冲剂类型对PCSK9抗体稳定性的影响。于45°C将 2mg/mL抗PCSK9mAb-316P 分别在 IOmM 乙酸盐(ρΗ5.0-5.5)、柠檬酸盐(ρΗ5.5-6.0)、琥珀酸盐(ρΗ6.0)、组氨酸(ρΗ6.0)、磷酸盐(ρΗ6.0-7.5)，或三羟甲基氨基甲烷(Tris) (ρΗ8.0)缓冲剂中孵育，以评估缓冲剂和PH值对蛋白热稳定性的影响(表1)。对于这一实验，将
0.35mL液体型配制剂置入一个配有涂FLUROTEC?的4432/50 丁基橡胶瓶塞的2mL容量I型硼硅酸盐玻璃小瓶。采用逆相色谱法测定回收的mAb-316P总量。采用尺寸排阻色谱法测定天然形式与聚集形式mAb-316P所占的百分比。采用阳离子交换色谱法测定酸性与碱性形式mAb-316P所占的百分比。当在IOmM组氨酸缓冲剂(pH6.0)中配制抗PCSK9mAb_316P时，如尺寸排阻色谱法(SE)和阳离子交换色谱法(CEX)两种方法所测定，观察到了最高的蛋白稳定性。
[0126]然后，将10mg/mL mAb_316P于45°C在组氨酸缓冲剂(pH值在5.5和6.5之间)中孵育，确定了最适宜于mAb-316P的pH值。当在组氨酸缓冲剂(pH6.0)(表2)中配制mAb-316P时，如SE和CEX两种方法所测定，观察到了最高的蛋白稳定性。这些分析也揭示，蛋白降解的主要途径是聚集物、裂解产品和带电变体的形成。基于这些结果，选择PH值为
6.0的IOmM组氨酸缓冲剂用于液体型和冻干型mAb-316P配制剂的开发。
[0127]配制剂开发研究的结果表明，在碱性条件下(pH≥6.5)，溶液中的抗PCSK9mAb-316P可能经历了脱酰氨基化反应。反之，在pH≤5.5时，观察到了 mAb_316P分子量变体形成速率的升高。基于这些数据，用于mAb-316P配制剂的缓冲剂pH值被维持在PH5.7和pH6.3之间。在此pH范围内，mAb_316P稳定性加速上升的情况是类似的。
[0128]实施例3:抵抗搅拌应力的保护剂之选择
[0129]对于各种各样的共溶剂，分别测试了它们在含mAb_316P的混合物中减少因搅拌应力而形成的微粒的能力。对于搅拌后药物的浊度分析显示，将含有mAb-316P的溶液(0.35mL 的 25mg/mL mAb_316P、IOmM 组氨酸、ρΗ6.0±0.2，置于配有涂FLUROTEC⑧的4432/50 丁基橡胶瓶塞的2mL容量I型硼硅酸盐玻璃小瓶内)在涡旋条件下搅拌120分钟后，405nm处的光密度(OD)上升(表3)。凡是含有所评估的任何共溶剂的配制剂似乎都阻止了因搅拌而引起的浊度增加。但是，如SE所测定，20% PEG300,10% PEG300和20%丙二醇显著地降低了 mAb-316P的热稳定性(表4 ;与上述润旋试验采用同样的mAb_316P浓度、缓冲剂和容器条件)。如SE和CEX所测定，含有聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、PluronicF68和PEG3350的配制剂对mAb_316P的热稳定性无显著影响，所以这些共溶剂适宜于配制抗PCSK9mAb-316P。聚山梨醇酯20被选为用于开发冻干型和液体型mAb_316P配制剂的有机溶剂，因为它在mAb-316P的搅拌试验和热试验中均显示了良好的稳定性。
[0130] 实施例4:抵抗热应力的保护剂之选择
[0131]对于选自各种含糖、含氨基酸和含无机盐产品的各种各样赋形剂分别进行了测试，以最佳地提高mAb-316P的热稳定性。归纳在表5中的是某些热稳定剂的试验结果。对于这些试验，将“热稳定剂”赋形剂加入含20mg/mL mAb_316P的IOmM组氨酸溶液中(0.35mL,置于配有涂FLUROTEC?的4432/50 丁基橡胶瓶塞的2mL容量I型硼硅酸盐玻璃小瓶内)。如SE分析所测定，在含有蔗糖、山梨糖醇、甘露醇和海藻糖的配制剂中，mAb-316P的降解量为最小。但是，与含有蔗糖、海藻糖和甘露醇的配制剂相比，含有山梨糖醇的配制剂显示了惊人的浊度增加(表5)。在多个冻融周期中，未观察到蔗糖、海藻糖和甘露醇对抗PCSK9mAb-316P带电变体形成的影响，但观察到甘露醇会使蛋白不稳定。因此，当与蔗糖或海藻糖一起配制时，mAb-316P具有相似的稳定性。
[0132]实施例5:冻干型配制剂 [0133]开发了一种冻干型配制剂以提高抗PCSK9mAb_316P，尤其是其带电变体的稳定性，并提高可输注的mAb-316P最高浓度。在一个配有涂FLUROTEC?的4432/50 丁基橡胶瓶塞的2mL容量I型硼硅酸盐玻璃小瓶内，将各种冻干保护剂分别与0.7mL的50mg/mLmAb-316P、10mM组氨酸混合、冻干,并检验它们于50°C孵育时稳定冻干mAb_316P的能力。在分析之前，将冻干饼重组为100mg/mL mAb_316P。经SE和CEX确定的稳定性最高的两种冻干型配制剂含有:1)6%蔗糖，或2)2(%蔗糖加2(%精氨酸。选择6(%蔗糖用于1^13-316?药品配制剂。因此，以冻干法以优化水基缓冲配制剂形式生产了抗PCSK9mAb-316P冻干型药品，其含有IOmM组氨酸(pH6.0±0.1)、0.1% (w/v)聚山梨醇酯20、6% (w/v)鹿糖以及50mg/mL抗PCSK9mAb-316P。此冻干型配制剂的储存和应力稳定性列于表7中。
[0134]抗pPCSK9mAb_316P的冻干周期的研发是基于用低温调制差示扫描量热法(mDSC)测定的配制剂Tg’ (冷冻玻璃化转变温度)。在初步干燥期间，产品温度不得高于Tg’，后者经测定为-27.9°C。
[0135]冻干型mAb_316P的生产过程是先将5.3mL的50mg/mL mAb_316P、IOmM组氨酸(pH6.0),0.1 %聚山梨醇酯20、6%蔗糖配制剂注入20!^1型玻璃小瓶，再按照下列步骤冻干:
[0136]1.在装料期间所需的货架温度:5-25°C
[0137]2.初步保温:于5°C保持60分钟
[0138]3.冷冻降温速率(时间):0.5V /分钟(100分钟)
[0139]4.保温:于_45°C保持120分钟
[0140]5.真空设定值:100毫托
[0141]6.加热至初步干燥步骤的升温速率(时间):0.5°C /分钟(40分钟I
[0142]7.初步干燥时的货架温度:-25°C
[0143]8.初步干燥持续时间:78小时
[0144]9.加热至二次干燥步骤的升温速率(时间):0.2°C /分钟(300分钟)
[0145]10.二次干燥时的货架温度:
[0146]11.二次干燥持续时间:6小时
[0147]12.冷却降温速率(时间):0.5°C /分钟(20分钟)
[0148]13.保温:于25°C保持60分钟！
[0149]14.用氮气填充
[0150]15.在真空条件下加塞:80%大气压(606, 000臺托)
[0151]若在二次干燥之后和加塞步骤之前需要长时间储存，则将冻干机的货架温度升至2_8°C。采用上述最终周期生产的冻干药品具有良好的冻干饼外观、低水分含量(0.3%)，其重组时间少于4分钟，且重组溶液不混浊。
[0152]当将mAb-316P药品(mAb_316P DP)于50°C孵育2个月或于5°C储存3个月后，冻干饼的外观未受影响。对重组mAb-316P药品的pH、外观或浊度无影响，且mAb_316P的回收量无显著区别。于50°C孵育2个月之后，SE-HPLC测定该冻干型mAb_316P药品的降解量增加了 1.1%，CEX-HPLC测定降解量增加了 8.3%。当将该冻干型mAb_316P药品于5°C储存3个月之后，未观察到显著的降解。用抗PCSK9生物测定法测定效价，在任何受到应力的样品中均未观察到效价的显著下降。
[0153]实施例6:液体型和重组MAB-316P
[0154]取决于给药途径，有两种重组冻干型mAb-316P药品的方法。对于IV注射，用5.0mL无菌注射用水(WFI)重组mAb-316P药品，生成5.3mL溶液，其中含有50mg/mLmAb-316P、IOmM组氨酸(pH6.0)、0.1% (w/v)聚山梨醇酯20以及6 % (w/v)蔗糖。对于SC注射，用2.3mL无菌注射用水(WFI)重组mAb_316P药品，生成2.7mL溶液，其中含有100mg/mLREGN727、20mM组氨酸(ρΗ6.0)、0.2% (w/v)聚山梨醇酯20以及12% (w/v)蔗糖。IV注射时可抽出4.8mL, SC注射时可抽出2.0mL ；SC小瓶内含有0.7mL的重组溶液过载量。
[0155]作为一种选择，将液体mAb_316P配制成液体型配制剂，而不经过中间的冻干步骤。液体型mAb_316P配制剂可含抗150mg/mL(± 15 % )或175mg/mL(± 15 % )PCSK9mAb-316P、10±l.5mM 组氨酸(ρΗ6.0±0.3)、0.01 % ±0.0015 % 或 0.2 % ±0.03%聚山梨醇酯20、5% ±0.75%或10% ±1.5%蔗糖，在175mg/mL配制剂中，精氨酸含量为50 ±7.5mM0
[0156]在无菌过滤后，发现抗PCSK9mAb_316P是稳定的。在临床供应品的制造过程中使用了一种Millipore MILLIPAK过滤装置，而在研究过程中则使用了一种同样组成的过滤器(Millipore MILLEX DURAP0RE)。与储存在玻璃小瓶中的情况相比，当储存在聚丙烯管、聚苯乙烯管、聚碳酸酯管，或含有不锈钢滚珠轴承的玻璃小瓶中时，以mAb-316P配制的药物(mAb-316P FDS)之稳定性未受显著影响(表8)。
[0157]实施例7:预充式注射 器中的液体型配制剂
[0158]还进行了一些配制剂开发研究，其目的是开发一种可装在预充式注射器(PFS)中的高浓度液体型mAb-316P配制剂，供SC注射。冻干型REGN727配制剂开发阶段的结果显示，最佳缓冲剂、PH值、有机共溶剂和热稳定剂分别为组氨酸、pH6.0、聚山梨醇酯20和蔗糖(如上所述)。上述同样的赋形剂也用于开发150mg/mL和175mg/mL mAb_316P药品配制剂。精氨酸被加入175mg/mL mAb-316P药品，以降低配制剂的粘度。检验了容纳在ImL长型玻璃Nuova OMPI预充填注射器(PFS)中的150和175mg/mL mAb_316P药品的应力稳定性，并与对照玻璃小瓶中的150和175mg/mL药品的稳定性作比较。于45°C孵育150或175mg/mLmAb-316P药品之后，未观察到OMPI PFS和玻璃对照小瓶之间在物理或化学降解量方面的显著区别。这些数据表明，150和175mg/mL抗PCSK9mAb_316P药品配制剂具有足够的稳定性，可在PFS中使用。
[0159]实施例8:以MAB-316P配制的药物之稳定性
[0160]为了确定150和175mg/mL mAb_316P配制剂的储存和应力稳定性,进行了稳定性研究。采用浊度分析和RP-HPLC分析，以评估mAb-316P的物理稳定性。物理稳定性的定义是溶液中可溶性抗PCSK9mAb-31 6P的回收。蛋白损失的原因可以是蛋白沉淀或表面吸附。溶液中微粒的存在可通过目视检查或405nm波长处光密度(OD)的测量(浊度测量)来检测。在后一检测过程中，OD的增加表明由于微粒形成而导致浊度增加。OD测量所确定的微粒存在表明，该样品未能维持稳定性。mAb-316P的回收是以RP-HPLC测量的。在RP-HPLC分析中，抗PCSK9mAb-316P抗体是从逆相柱中作为单峰洗脱的。每个试样的浓度是根据洗脱的mAb-316P抗体峰的面积，与用给定蛋白载荷的mAb-316P标准所产生的校准曲线作比较而确定的。
[0161]化学稳定性是指样品中抗PCSK9抗体(mAb_316P)的化学结构完整性。大部分化学稳定性可归因于蛋白的共价修饰形式(例如共价聚集物、裂解产品或带电变体)和蛋白的非共价修饰形式(例如非共价聚集物)的形成。迄今为止，唯一检测到的mAb-316P降解产品是分子量或电荷不同的变体。可以用SE-HPLC从天然mAb-316P中分离出分子量较高或较低的降解产品。尺寸排阻色谱法中天然mAb-316P的百分比是根据天然峰面积与所有mAb-316P抗体峰总面积的比率而确定的。
[0162]mAb_316P的带电变体形式是用阳离子交换色谱法与天然mAb_316P分离的。从CEX-HPLC柱洗脱的保留时间比主峰早的峰被标为“酸性峰”，而从CEX-HPLC柱洗脱的保留时间比主峰晚的峰则被标为“碱性峰”。阳离子交换色谱法中降解的mAb-316P的百分比是根据主峰、酸性峰、碱性峰的面积与所有mAb-316P抗体峰总面积相比的相对百分比的变化而确定的。
[0163]让抗体经受各种应力试验，在加速条件下对mAb_316P进行了评估。这些试验代表了所配制药物在药品制造过程中可能经受的极端操作条件。将用mAb-316P配制的药物充入5mL聚碳酸酯小瓶，以在搅拌、冻融周期以及冷冻储藏等条件下进行评估。将用mAb-316P配制的药物充入玻璃小瓶，以在高温下检验其应力稳定性。
[0164]实施例9:所配制药物(FDS)的储存稳定性研究
[0165]于≤-20°C储存12个月后发现，用150mg/mL mAb-316P配制的药物(FDS ；0.5mL，储存于5mL聚碳酸酯小瓶；150mg/mL mAb_316P抗体、IOmM组氨酸[pH6.0]、0.2%聚山梨醇酯20以及10%蔗糖)在物理上和化学上都是稳定的。采用尺寸排除法或离子交换色谱法，未观察到显著的mAb-316P损失和显著的化学降解。如尺寸排除法所确定，97%以上回收的mAb-316P是“天然”结构；如离子交换色谱法所确定，56%以上回收的mAb_316P是“主要带电变体”。其结果归纳在表9中。
[0166]于≤-20°C储存3个月后发现，用175mg/mL mAb-316P配制的药物(FDS ；0.75mL，储存于5mL聚碳酸酯小瓶；175mg/mL mAb_316P抗体、IOmM组氨酸[pH6.0]、0.01 %聚山梨醇酯20、5%蔗糖，以及50mM精氨酸)在物理上和化学上都是稳定的。采用尺寸排除法或离子交换色谱法，未观察到显著的mAb-316P损失和显著的化学降解。如尺寸排除法所确定，96 %以上回收的mAb-316P是“天然”结构；如离子交换色谱法所确定，56 %以上回收的mAb-316P是“主要带电变体”。其结果归纳在表10中。
[0167]实施例10:所配制药物的应力稳定性研究
[0168]对以150mg/mL mAb_316P 配制的药物(FDS) (0.3SmT-0.5mL 的 150mg/mLmAb-316P、IOmM组氨酸[ρΗ6.0]、0.2%聚山梨醇酯 20、10%蔗糖)和以 175mg/mL mAb-316P配制的药物(0.5mL_l.7mL 的 175mg/mL mAb_316P、IOmM 组氛酸[ρΗ6.0]、0.01 %聚山梨醇酯20、5%蔗糖、50mM精氨酸)，分别进行了应力稳定性研究。在一个配有涂FLUROTEC?的4432/50 丁基橡胶瓶塞的2mL容量I型硼硅酸盐玻璃小瓶内进行了高温研究；其余研究是在一个5mL聚碳酸酯小瓶内进行的。搅拌(润旋)两小时后发现，用150mg/mL和175mg/mL抗PCSK9mAb-316P配制的药物在物理上和化学上都是稳定的。溶液保持清晰透明，未出现蛋白损失，也未形成分子量变体或带电变体(表11和12)。经观察，当经受冻至_80°C和融至室温的8个周期后，MAb-316P在物理上和化学上也是稳定的。在8个冻融周期之后，蛋白溶液仍保持清晰透明，未见蛋白损失。分别以SE或CEX分析检验，未检测出分子量变体(可溶性聚集物或裂解产物)或带电变体形式。
[0169]虽然于37°C或45°C孵育28天后，以150和175mg/mL抗PCSK9mAb_316P配制的药物在物理上是稳定的，但观察到了一些化学降解(表11和12)。这些应力试验表明，主要的降解途径是聚集物、裂解产品和带电变体的形成。正如所预料的，37°C时抗PCSK9mAb-316P抗体的降解速率比45°C时要慢。于25°C孵育28天后，以150或175mg/mL mAb-316P配制的药物其物理或化学稳定性无显著变化。
[0170]实施例11:药品(DP)的储存稳定性
[0171]该150mg/mL mAb_316P 药品含有 IOmM 组氨酸(ρΗ6.0)、0.01 %聚梨醇酯 20、10%鹿糖，以及 150mg/mL 抗 PCSK9mAb_316P 抗体。该 175mg/mL mAb_316P 药品含有 IOmM 组氨酸(pH6.0)、0.0I % 聚山梨醇酯 20、5 % 蔗糖、50mM 精氨酸，以及 175mg/mL 抗 PCSK9mAb_316P抗体。于5°C在预充式注射器(PFS ；0MPIlmL长型玻璃注射器，配有一根27-G薄壁注射针和一个FM27橡胶针罩，以一个涂FLUROTEC?的4023/50橡胶柱塞封闭)内储存6个月之后，上述150mg/mL或175mg/mL mAb-316P药品(DP)的物理和化学稳定性均无变化(表13和14)。在经受这些应力后，溶液仍保持清晰透明，未观察到蛋白损失，pH值也未发生变化。此外，分别以SE和CEX检验，分子量变体或带电变体也无显著变化。
[0172] 实施例12:药品(DP)的应力稳定性
[0173]于25°C和45°C孵育预充式注射器内的药品，分别检验了 150mg/mL mAb_316P药品和175mg/ml mAb-316P药品的应力稳定性。于45°C孵育28天或于25°C孵育6个月后，每种药品在物理上都是稳定的(表13和14)。在经受这些应力后，溶液仍保持清晰透明，未观察到蛋白损失，PH值也未发生变化。但是，当于45°C和25°C孵育蛋白时，检测出聚集物和带电变体。此应力试验表明，这些是药品的主要降解途径。于45°C将150mg/mL药品孵育28天后，mAb-316P聚集物增加了 1.9%，酸性形式增加了 19.1%。于25°C孵育蛋白时，检测出化学降解程度下降。于25°C孵育6个月后，聚集物的相对量增加了 0.8 %，酸性形式则增加了 10.3%。于45°C将175mg/mL药品孵育28天后，mAb_316P聚集物增加了 1.8%，酸性形式增加了 17.0%。于25°C孵育蛋白时，检测出化学降解程度下降。于25°C孵育6个月后，聚集物增加了 0.7%，酸性形式则增加了 9.4%。对于150和175mg/mL药品而言，于25°C孵育I个月后，mAb-316P的稳定性均无显著变化。
[0174]实施例13:填充体积
[0175]含有150mg/mL REGN727药品的预充式注射器(PFS)，其可注射体积是1.0mL。含有175mg/mL REGN727药品的PFS，其可注射体积是1.14mL。在任一种PFS内均未包括过载量，因为该注射器内的死体积可忽略不计(0.005to0.01mL)。
[0176]实施例14:MAB-316P在储藏材料中的稳定性
[0177]在无菌过滤后，发现抗PCSK9mAb_316P是稳定的。在研究过程中和临床供应品的制造过程中使用了一种MILLIPORE MILLIPAK过滤装置。与储存在玻璃小瓶中的情况相比，当储存在聚丙烯管、聚苯乙烯管、聚碳酸酯管，或含有不锈钢垫圈的玻璃小瓶中时，以150和175mg/mL mAb_316P配制的药物之稳定性未受显著影响(表15和表16)。虽然将配制的药物于40°C孵育14天后观察到降解现象，但在比较对照、玻璃小瓶，以及接触塑料容器和不锈钢时，未观察到mAb-316P降解量的显著区别。
[0178]实施例15:抗PCSK9抗体MAB-316P的鉴定
[0179]以尺寸排阻色谱法和多角度激光散射法(SEC-MALLS)分析了至少两批mAb-316P(第I批和第2批)样品；这是一种给出蛋白或糖蛋白摩尔质量估计值的分析方法。第I批和第2批样品的摩尔质量分别为154.5和154.6kDa。其它批次的摩尔质量为154.4至154.8kDa(平均约为155kDa)，对应于从SE基质洗脱的主峰。这一主峰代表了总蛋白峰面积的约96.7-99.2%，对应于完整的mAb-316P单体(即本文所述的“天然的”)。
[0180]以毛细管等电聚焦法(cIEF)分析了 mAb_316P，以确定主要成分异构体的等电点。以cIEF法确定的mAb-316P样品的等电点和平均峰面积(总峰面积的％ )归纳在表17中。每一批都显示了一个等电点计算值约为8.5的主峰(峰5)，分别位于第I批样品和第2批样品的66.4%和68.0%处。主峰(峰5)非常可能代表完整的但缺乏C-端赖氨酸的糖基化抗体(即，如本文所述的“主要荷电形式”)。
[0181]对于第I批和第2批还原mAb_316P胰蛋白酶图谱的质谱(MS)分析，证实了在这两批样品的Fe结构域内均存在单一糖基化位点Asn298。位于此糖基化位点的主要共价连接聚糖形式归纳在表18中。总之，经确定两批药品均含有复合型双触角聚糖，其大多数在Asn298位点已经岩藻糖基化。但是，第2批中含有糖链形式的岩藻糖基化无半乳糖基(GO)的相对量比第I批中这种糖型的相对量稍微高些。反之，与第I批相应糖链结构的相对量相比，第2批中含有糖链形式的岩藻糖基化二半乳糖基(G2)和岩藻糖基化单半乳糖基(Gl)的相对量有所下降。对上述两个药物样品(峰16)的LC/MS结果进行分析，也发现在第I批和第2批的样品中分别有2.9%和8.4%的重链肽在Asn298位点不存在聚糖。
[0182]对于上述每一批mAb_316P样品释放低`聚糖之后以HPLC产生的聚糖曲线进行了分析。在每幅色谱图上，所衍生的低聚糖被分为两大类:非岩藻糖基化的双触角低聚糖和岩藻糖基化的双触角低聚糖。在每一类内(岩藻糖基化与非岩藻糖基化)，上述低聚糖又进一步分为二半乳糖基(G2)、单半乳糖基(Gl)以及无半乳糖基(G0)。通过MALD1-T0F质谱获得了低聚糖结构位置。两幅色谱图中每个峰的积分揭示，两批mAb-316P的岩藻糖基化水平一般都很高，在第I批和第2批中观察到的岩藻糖基化水平分别为80.0%和86.9%。
[0183]虽然这两批的岩藻糖基化总百分比相似，但这两批中存在的每种聚糖形式的相对丰度却有着量的差别(表19)。对于第I批，对应于G0、G1和G2岩藻糖基化聚糖结构所确定的峰面积百分比分别为34.4%,39.6%和11.7%。相比之下，第2批中对应于GO、Gl和G2岩藻糖基化聚糖结构所确定的峰面积百分比分别为45.8%、33.3%和7.1%，表明在这两批之间在半乳糖基化程度上存在着差别。两批中均检测到一个甘露糖聚糖(man5聚糖)高峰(峰2)，相对于所观察到的糖链总量，其相对丰度为1.8-2.9% (表19)。在以此方法检测的两批样品中，总共检测到9个峰面积百分比范围为0.5%至1.5%的未知峰，其代表在每批样品中检测到的< 3%的总聚糖峰面积。对两批样品的等摩尔混合物所进行的分析未产生新峰，且基于每批样品的单独分析，在上述等摩尔混合物中所有峰的峰面积百分比与预期值之间有着很好的相关性(表19)。
[0184]
【权利要求】
1.一种医药配制剂，含有:(i) 一种与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(人PCSK9)特异性结合的抗体；(ii) 一种PH值为6.0±0.3的缓冲剂；(^丨)一种非离子型去污剂；以及(iv) —种稳定剂。
2.权利要求1所述之医药配制剂，其特征为所述抗体包含一个序列号为2的HCDR1、一个序列号为3的HCDR2、一个序列号为4的HCDR3、一个序列号为6的IXDRl、一个序列号为7的IXDR2，以及一个序列号为8的IXDR3。
3.权利要求1和2中任一项所述之医药配制剂，其特征为所述抗体包含一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD。
4.权利要求1至3中任一项所述之医药配制剂，其特征为: (a)90%以上的所述抗体分子量为155kDa±lkDa ； (b)50%以上的所述抗体等电点约为8.5 ;以及 (c)75%至90%所述抗体是岩藻糖基化抗体。
5.权利要求1至4中任一项所述之医药配制剂，其特征为所述抗体浓度为50mg/mL + 7.5mg/mL 至 175mg/mL + 26.25mg/mL。
6.权利要求1至4中任一项所述之医药配制剂，其特征为所述缓冲剂是组氨酸。
7.权利要求6所述之医药配制剂，其特征为所述组氨酸浓度为10mM±l.5禮。
8.权利要求1至7中任一项所述之医药配制剂，其特征为所述非离子型去污剂是聚山梨醇酯20。`
9.权利要求8所述之医药配制剂，其特征为所述聚山梨醇酯20浓度为0.01 % w/ν±0.0015%至 0.2% w/v±0.03%。
10.权利要求1至9中任一项所述之医药配制剂，其特征为所述稳定剂是蔗糖。
11.权利要求10所述之医药配制剂，其特征为所述蔗糖浓度为5%±0.75%至12%±1.8% (w/v)。
12.权利要求1至11中任一项所述之医药配制剂，其特征为所述抗体浓度为175mg/mL±26.25mg/mL,缓冲剂为10mM±l.5mM组氨酸(pH6±0.3)，所述非离子型去污剂为0.01% w/v±0.0015%聚山梨醇酯20，稳定剂为5% w/v±0.75%蔗糖，并进一步包含50mM±7.5mM 精氛酸。
13.权利要求1至11中任一项所述之医药配制剂，其特征为所述抗体浓度为150mg/mL±22.5mg/mL，缓冲剂为10mM±l.5mM组氨酸(pH6±0.3)，所述非离子型去污剂为0.2%w/v±0.03%聚山梨醇酯20,以及稳定剂为10% w/v± 1.5%鹿糖。
14.权利要求1至11中任一项所述之医药配制剂，其特征为所述抗体浓度为150mg/mL±22.5mg/mL，缓冲剂为10mM±l.5mM组氨酸(pH6±0.3)，所述非离子型去污剂为0.01%w/v±0.0015%聚山梨醇酯20，以及稳定剂为10% w/v±l.5%蔗糖。
15.权利要求1至11中任一项所述之医药配制剂，其特征为所述抗体浓度为IOOmg/mL±15mg/mL，缓冲剂为20mM±3mM组氨酸(pH6±0.3)，所述非离子型去污剂为0.2 % w/v±0.03%聚山梨醇酯20，以及稳定剂为12% w/v±l.8%蔗糖。
16.权利要求1至11中任一项所述之医药配制剂，其特征为所述抗体浓度为50mg/mL±7.5mg/mL，缓冲剂为10mM±l.5mM组氨酸(pH6±0.3)，所述非离子型去污剂为0.l%w/v±0.015%聚山梨醇酯20，以及稳定剂为6% w/v±0.9%蔗糖。
17.权利要求1至16中任一项所述之医药配制剂，其特征为至少91%的所述抗体于45°C储存28天后具有天然构象。
18.权利要求1至16中任一项所述之医药配制剂，其特征为至少35%的所述抗体于45°C储存28天后是所述抗体的主要带电变体。
19.权利要求1至16中任一项所述之医药配制剂，其特征为至少94%的所述抗体于25°C储存6个月后具有天然构象。
20.权利要求1至16中任一项所述之医药配制剂，其特征为至少45%的所述抗体于25°C储存6个月后是所述抗体的主要带电变体。
21.权利要求1至16中任一项所述之医药配制剂，其特征为至少96%的所述抗体于5°C储存6个月后具有天然构象。
22.权利要求1至16中任一项所述之医药配制剂，其特征为至少58%的所述抗体于5°C储存6个月后是所述抗体的主要带电变体。
23.权利要求1至16中任一项所述之医药配制剂，其特征为至少96%的所述抗体于-20°C、-30°C或_80°C储存3个月后是所述抗体的主要带电变体。
24.权利要求1至16中任一项所述之医药配制剂，其特征为至少56%的所述抗体于-20°C、_30°C或_80°C储存3个月后是所述抗体的主要带电变体。
25.一种医药配制剂，含有(a)175mg/mL±26.25mg/mL 抗 PCSK9 抗体，(b)10mM±l.5mM组氨酸，ρΗ6±0.3，(c)0.01% w/v±0.0015%聚山梨醇酯 20，(d) 5% w/v±0.75%蔗糖，以及(e)50mM±7.5mM精氨酸，其中: (a)所述抗体含有一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD； (b)90%以上的所述抗体分子量为155kDa±lkDa ； (c)50%以上的所述抗体等电点约为8.5 ;以及 (d)75%至90%所述抗体是岩藻糖基化抗体。
26.权利要求25所述之医药配制剂,其为下列组分的水溶液:(a)175mg/mL±26.25mg/mL所述抗体,(b) 10mM±l.5mM组氨酸，pH6±0.3, (c)0.01 % w/v±0.0015%聚山梨醇酯 20,(d)5% w/v±0.75%蔗糖，以及(e)50mM±7.5mM 精氨酸。
27.一种医药配制剂，其含有(a) 150mg/mL±22.5mg/mL抗PCSK9抗体，(b) 10mM±l.5mM组氨酸，pH6±0.3, (c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯 20,以及(d) 10% w/v±l.5%鹿糖，其中: (a)所述抗体含有一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD； (b)90%以上的所述抗体分子量为155kDa±lkDa ； (c)50%以上的所述抗体等电点约为8.5 ;以及 (d)75%至90%所述抗体是岩藻糖基化抗体。
28.权利要求27所述之医药配制剂,其为下列组分的水溶液:(a)150mg/mL±22.5mg/mL 所述抗体，(b)10mM±l.5mM 组氨酸，ρΗ6±0.3，(c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯 20，以及(d) 10% w/v± 1.5%鹿糖。
29.一种医药配制剂，其含有(a) 150mg/mL±22.5mg/mL抗PCSK9抗体，(b) 10mM±l.5mM组氨酸，pH6±0.3，(c) 0.01 %W/V±0.0015%聚山梨醇酯 20，以及(d) 10% w/v± L 5%蔗糖，其中:(a)所述抗体含有一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD； (b)90%以上的所述抗体分子量为155kDa±lkDa ； (c)50%以上的所述抗体等电点约为8.5 ;以及 (d)75%至90%所述抗体是岩藻糖基化抗体。
30.权利要求29所述之医药配制剂,其为下列组分的水溶液:(a)150mg/mL±22.5mg/mL所述抗体,(b) 10mM±l.5mM组氨酸，pH6±0.3, (c)0.01 % w/v±0.0015%聚山梨醇酯 20,以及(d) 10% w/v± 1.5%鹿糖。
31.一种医药配制剂，其含有(8)10011^/1^±1511^/1^抗？051(9抗体，(b)20mM±3mM 组氨酸，pH6±0.3，(c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯 20，以及(d) 12% w/v± L 8%蔗糖，其中: (a)所述抗体含有一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD； (b)90%以上的所述抗体分子量为155kDa±lkDa ； (c)50%以上的所述抗体等电点约为8.5 ;以及 (d)75%至90%所述抗体是岩藻糖基化抗体。
32.权利要求31所述之医药配制剂,其为下列组分的水溶液:(a)100mg/mL± 15mg/mL所述抗体，(b)20mM±3mM组氨酸，pH6±0.3，(c)0.2% w/v±0.03%聚山梨醇酯20，以及(d)12% w/v± 1.8%·鹿糖。
33.一种医药配制剂，其含有(a)50mg/mL±7.5mg/mL含有一个序列号为I的HCVD和一个序列号为 5 的 LCVD 的抗体，(b)10mM±l.5mM 组氨酸，ρΗ6±0.3，(c) 0.1 % w/v±0.015%聚山梨醇酯20，以及(d)6% w/v±0.9%蔗糖，其中: (a)所述抗体含有一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD； (b)90%以上的所述抗体分子量为155kDa±lkDa ； (c)50%以上的所述抗体等电点约为8.5 ;以及 (d)75%至90%所述抗体是岩藻糖基化抗体。
34.权利要求33所述之医药配制剂,其为下列组分的水溶液:(a)50mg/mL±7.5mg/mL所述抗体，(b)10mM±L 5mM组氨酸，ρΗ6±0.3，(c)0.1% w/v±0.015%聚山梨醇酯20，以及(d)6% w/v±0.9% 鹿糖。
35.一种含有抗PCSK9抗体和少于0.3%水的组合物之制备方法，所述方法包括下列步骤: a)在一个玻璃小瓶内将水、一种抗PCSK9抗体、组氨酸、蔗糖和聚山梨醇酯20混合。 b)将步骤(a)之混合物于约5°C保持约60分钟；然后 c)以每分钟约0.5°C的速率降温；然后 d)于约_45°C保持约120分钟；然后 e)将大气压降至约100毫托； f)以每分钟约0.5°C的速率升温；然后 g)于约_25°C保持约78小时；然后 h)以每分钟0.2°C的速率升温；然后 i)于约35°C保持约6小时；然后 j)以每分钟约0.5°C的速率降温；然后k)在储存前，于约25°C保持约60分钟。
36.权利要求35所述之方法，进一步包括下列步骤: I)用氮气填充含有步骤(k)之混合物的玻璃小瓶；以及 m)于约80%大气压下给上述小瓶加塞。
37.权利要求35或36所述之方法，其特征为所述组合物在步骤(i)、(j)或(k)之后和小瓶加塞步骤之前先降温至2-8°C。
38.权利要求35至37中任一项所述之方法，其特征为50mg/mL±7.5mg/mL抗PCSK9抗体、10mM±l.5mM组氨酸(pH6.0)、0.1% ±0.015%聚山梨醇酯20以及6% ±0.9%蔗糖在步骤(a)中混合，且所述抗PCSK9抗体包含一个序列号为2的HCDR1、一个序列号为3的HCDR2、一个序列号为4的HCDR3、一个序列号为6的IXDR1、一个序列号为7的IXDR2，以及一个序列号为8的LCDR3。mAb_316P。
39.权利要求35至38中任一项所述之方法，其特征为所述抗PCSK9抗体包含一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD。
40.权利要求35至39中任一项所述之方法，其特征为(a)所述抗体包含一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD ； (b)90%以上的所述抗体分子量为155kDa±lkDa ； (c)50%以上的所述抗体等电点约为8.5;以及(d) 75%至90%所述抗体是岩藻糖基化抗体。
41.一种按照权利要求35至40中任一项所述之方法生产的医药组合物，其含有一种抗PCSK9抗体和少于0.3%的水。
42.一种医药组合物，其含有重新悬浮在水中的权利要求41所述之医药组合物。
43.权利要求42所述之医药组合物,其为下列组分的水溶液:50mg/mL±7.5mg/mL抗体、10mM±l.5mM 组氨酸(pH6.0)、0.1% ±0.015%聚山梨醇酯 20，以及 6% ±0.9%蔗糖。
44.权利要求42所述之医药组合物,其为下列组分的水溶液:100mg/mL±15mg/mL抗体、20mM±3mM组氨酸(pH6.0)、0.2% ±0.03%聚山梨醇酯20，以及12% ±1.8%蔗糖。
45.权利要求42所述之医药组合物,其为下列组分的水溶液:150mg/mL±22.5mg/mL抗体、30mM±4.5mM 组氨酸(pH6)、0.3% ±0.045%聚山梨醇酯 20，以及 18% ±2.7%蔗糖。
46.权利要求42所述之医药组合物，其为下列组分的水溶液:175mg/mL±26.25mg/mL 抗体、35mM±5.25mM 组氨酸(pH6.0)、0.35 % ±0.0525 % 聚山梨醇酯 20，以及 21%±3.15%鹿糖。
47.权利要求41至46中任一项所述之医药组合物，其特征为(a)所述抗体包含一个序列号为I的HCVD和一个序列号为5的LCVD ;(b)90%以上的所述抗体分子量为155kDa±lkDa ； (c) 50%以上的所述抗体等电点约为8.5 ;以及(d)75%至90%所述抗体是岩藻糖基化抗体。
48.权利要求1至34和41至47中任一项所述之医药组合物，其特征为所述组合物被容纳在一个容器内。
49.权利要求48所述之医药组合物，其特征为所述容器是一种小瓶。
50.权利要求49所述之医药组合物，其特征为所述小瓶是玻璃制成的。
51.权利要求48所述之医药组合物，其特征为所述容器是一种注射器。
52.权利要求51所述之医药组合物，其特征为所述注射器是低钨玻璃制成的。
53.权利要求51所述之医药组合物，其特征为所述注射器是一种NUOVAOMPIlmL长型玻璃注射器，配有27-G薄壁注射针、涂有FLUR0TEC的4023/50橡胶塞和FM27橡胶端盖。
54.一种试剂盒，其包括权利要求1至34和41至47中任一项所述之医药组合物、一种容器，以及说明书。
55.权利要求54所述之试剂盒，其特征为所述容器是一种预充式注射器。
56.权利要求55所述之试剂盒，其特征为所述注射器是一种NUOVAOMPIlmL长型玻璃注射器，配有27-G薄壁注射针、涂有FLUR0TEC的4023/50橡胶塞和FM27橡胶端盖。
【文档编号】C07K16/40GK103717237SQ201280037861
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年7月27日 优先权日:2011年7月28日
【发明者】S·沃尔什, D·迪克斯 申请人:瑞泽恩制药公司