抗angptl3抗体及其用途

抗angptl3抗体及其用途
【专利摘要】本发明提供了一种完全人源化抗体或人抗体的抗原结合片段，其与人血管生成素样蛋白3（hANGPTL3）特异性结合，并抑制或干扰其至少一种活性。该人抗hANGPTL3抗体可用于治疗与ANGPTL3相关的疾病或失调，如高脂血症、高脂蛋白血症和血脂异常，包括高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症等。此外，该hANGPTL3抗体可以给需要预防或治疗疾病或失调的受试者施用，对其而言，异常的脂质代谢是一种危险因素。这类疾病或失调包括心血管疾病，如动脉粥样硬化和冠状动脉疾病；急性胰腺炎；非酒精性脂肪性肝炎（NASH）；糖尿病；肥胖症等。
【专利说明】抗ANGPTL3抗体及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及与人血管生成素样蛋白3 (hANGPTL3)特异性结合的人抗体和人抗体的抗原结合片段，以及使用那些抗体的治疗方法。
【背景技术】
[0002]所述血管生成素样蛋白3 (ANGPTL3)基因是基于信号序列和两亲性螺旋结构从EST数据库鉴定的，随后从人胚胎肝/脾cDNA文库分离出ANGPTL3全长cDNA (Conklinet al.，1999,Genomics62:477-482)。推断的460个氨基酸组成的hANGPTL3蛋白与小鼠ANGPTL3具有76%氨基酸序列同一性，并具有血管生成素的特征结构，即一个信号肽、一个预期将形成二聚或三聚卷曲螺旋的伸展的螺旋结构域、一个短连接肽，以及一个球状纤维蛋白原同源结构域(FD) (Conklin et al.，1999，出处同上)。ANGPTL3含有4个保守的半胱氨酸残基，与FD内分子内二硫键密切相关；但是，ANGPTL3既不包含另两个半胱氨酸，也不包含在血管生成素(ANGs ;即ANG1、ANG2和ANG4)的FD内所发现的特征性钙结合基序(Conklin et al.，1999，出处同上);血管生成素是促进血管生成的蛋白生长因子。此外，不同于ANGs，ANGPTL3不与Tie2结合；但是，通过它的C-端FD与整联蛋白α νβ 3结合，它也可诱导血管生成(Camenisch et al.，2002，J Biol Chem277:17281-17290)。
[0003] 综合的体内试验数据是从远系繁殖的KK小鼠模型获得的，这是一种中度肥胖的小鼠，其血浆胰岛素、血糖和血脂水平特别高，类似于人的II型糖尿病症状(Koishi et al.，2002，NatureGenetics30:151-157)。但是，经发现，小鼠的一个亚株KK/San具有特别低的血浆脂质水平(低脂血症)，呈孟德尔隐性遗传。该基因被定位于4号染色体，并被最终确定是编码ANGPTL3的基因，其外显子6中有4个碱基核苷酸序列插入(Koishi et al.，2002，出处同上)。相反，在腺病毒介导的ANGPTL3基因转移后，或给KK/San小鼠注射重组人ANGPTL3后，血浆脂质水平则上升。此效应不是由涉及胆固醇合成、脂蛋白清除或NEFA氧化的基因变化介导的(Koishi et al.，2002，出处同上)。而且，重组蛋白的体外分析显示，ANGPTL3直接抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)活性；这表明它是一种通过抑制LPL活性而调节极低密度脂蛋白(VLDL)甘油三酯水平的脂质代谢调节剂(Shimizugawa et al., 2002, J BiolChem277 (37): 33742-33748)。业已显示，对于其提高小鼠血浆甘油三酯水平的活性，需要ANGPTL3的N-端螺旋卷曲结构域，尤其是N-端区残基17-165，但不需要C-端FD (Ono etal., 2003, J Biol Chem278:41804-41809)。
[0004]人ANGPTL3的氨基酸和核苷酸序列分别显示在序列161和162中。ANGPTL3抗体在例如W02008/073300和US7, 935，796中均有所公开。
[0005]发明概述
[0006]在第一个方面，本发明提供了完全人源化单克隆抗体(mAbs)及其抗原结合片段，其特异性地结合并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰ANGTPL3，尤其是人类ANGPTL3 (序列号161)的至少一种活性。可被本发明的抗体或其片段中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰的ANGPTL3的活性，包括但不限于LPL活性的抑制、血管生成的诱导作用等。在一个实施方案中，本发明的抗体或其片段通过与hANGPTL3的一个直接参与hANGPTL3靶向活性的表位结合，能中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰hANGPTL3的活性。在另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段通过与hANGPTL3的一个不直接参与hANGPTL3靶向活性的表位结合，能中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰hANGPTL3的活性，因其所结合的抗体或片段在空间或构象上抑制、阻断、消除、降低或干扰hANGPTL3的靶向活性。在另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段与hANGPTL3的一个不直接参与hANGPTL3靶向活性(例如抑制LPL活性、诱导血管生成等)的表位结合(即一种非阻断性抗体)，但与抗体或其片段不存在的情况下hANGPTL3的清除率相比，所结合的抗体或片段导致hANGPTL3从循环系统的清除率上升，从而间接地抑制、阻断、消除、降低或干扰hANGPTL3的活性。将在与hANGPTL3特异性结合过程中不相互竞争的两种或更多种不同的非阻断性抗体结合，尤其可以提高hANGPTL3从循环系統清除的清除率。 [0007]这些抗体(Abs)可以是全长的(例如IgGl或IgG4抗体)，或可仅包含一个抗原结合部分(例如Fab、F(ab’ )2或scFv片段),并可加以修饰以影响其功能,例如消除残余的效应子功能(Reddy et al., 2000, J.1mmunol.164:1925-1933)。
[0008]在一个实施方案中，本发明包括一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个选自下列一组序列的重链可变区(HCVR):序列号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146和180，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在另一个实施方案中，该抗体或其抗体结合片段包含一个HCVR，其含有选自下列一组序列的氨基酸序列:序列号2、18、34、66、82、114和180。在另一个实施方案中，该抗体或其抗体结合片段包含一个HCVR，其含有序列号为66的氨基酸序列。
[0009]在一个实施方案中，抗体或抗体的抗原结合片段包含一个选自下列一组序列的轻链可变区(LCVR):序列号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154和188，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在另一个实施方案中，该抗体或抗体的结合部分包含一个LCVR，其含有选自下列一组序列的氨基酸序列:序列号10、26、42、74、90、122和188。在另一个实施方案中，该抗体或其抗体结合部分包含一个LCVR，其含有序列号为74的氨基酸序列。
[0010]在进一步的实施方案中，该抗体或其片段包含一对选自下列一组序列对的HCVR和 LCVR 序列对(HCVR/LCVR):2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154和180/188。在一个实施方案中，该抗体或其片段包含一对选自下列一组序列对的 HCVR 和 LCVR 序列对:2/10、18/26、34/42、66/74、82/90、114/122 和 180/188。在另一个实施方案中，该抗体或其片段包含一对序列号为66/74的HCVR和LCVR序列对。
[0011]在第二个方面，本发明的特点是一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个选自下列一组序列的重链互补决定区3 (HCDR3)氨基酸序列:序列号8、24、40、56、72、88、104、120、136、152和186，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及一个选自下列一组序列的轻链⑶R3 (LCDR3)氨基酸序列:序列号16、32、48、64、80、96、112、128、144、160和194，或与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在一个实施方案中，该抗体或其片段包含一对 HCDR3/LCDR3 氨基酸序列对，其包含序列对 8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160或186/194。在另一个实施方案中，该抗体或其片段包含一对HCDR3/LCDR3氨基酸序列对，其包含序列对8/16、24/32、40/48、72/80、88/96、120/128或186/194。在另一个实施方案中，该抗体或其片段包含一对HCDR3/LCDR3氨基酸序列对，其包含序列对72/80。
[0012]在一个进一步的实施方案中，该抗体或其片段进一步包含一个选自下列一组序列的重链 CDRKHCDRl)氨基酸序列:序列号 4、20、36、52、68、84、100、116、132、148 和 182，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及一个选自下列一组序列的重链CDR2 (HCDR2)氨基酸序列:序列号6、22、38、54、70、86、102、118、134、150和184，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及可选地进一步包含一个选自下列一组序列的轻链⑶Rl(IXDRl)氨基酸序列:序列号12、28、44、60、76、92、108、124、140、156和190，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；及/或一个选自下列一组序列的轻链CDR2(LCDR2)氨基酸序列:序列号14、30、46、62、78、94、110、126、142、158和192，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。
[0013]或者，本发明的特点是一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个选自下列一组序列组合的 HCDR1/HCDR2/HCDR3 组合:4/6/8、20/22/24、36/38/40、52/54/56、68/70/72、84/86/88、100/102/104、116/118/120、132/134/136、148/150/152 和 182/184/186 ；及/或一个选自下列一组序列组合的LCDR1/LCDR2/LCDR3组合:12/14/16、28/30/32、44/46/48、60/62/64、76/78/80、92/94/96、108/110/112、124/126/128、140/142/144、156/158/160和190/192/194。在一个实施方案中，该重链和轻链CDR氨基酸序列包含一个选自下列一组序列组合的CDR序列组合:4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48,52/54/56/60/62/64,68/70/72/76/78/80,84/86/88/92/94/96,100/102/104/108/110/112、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160 和 182/184/186/190/192/194。在一个实施方案中，该重链和轻链CDR氨基酸序列包含一个选自下列一组序列组合的CDR序列组合:4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32,36/38/40/44/46/48,68/70/72/76/78/80,84/86/88/92/94/96,116/118/120/124/126/128 或 182/184/186/190/192/194。在另一个实施方案中，该重链和轻链CDR氨基酸序列包含一个序列组合68/70/72/76/78/80。
[0014]在一个相关的实施方案中，本发明包括一种与hANGPTL3特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含选自下列一组序列对的HCVR/LCVR对所含有的重链和轻链 CDR 结构域:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154和180/188。鉴定HCVR/LCVR氨基酸序列内CDR的方法和技术是本领域内已知的，并可用于鉴定本文所公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴定⑶R区边界的传统定义包括Kabat定义、Chothia定义以及AbM定义。总的来说，Kabat定义是基于序列可变性，Chothia定义是基于结构环区的位置，AbM定义则是Kabat法与Chothia法两者之间的折衷。参阅例如Kabat, "Sequences of Proteinsof Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)；Al-Lazikani et al., J.Mo 1.Biol.273:927-948 (1997);以及 Martin et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:9268-9272 (1989)。公共数据库也可供利用，以鉴定抗体内的CDR序列。在一个实施方案中，该抗体或其片段包含选自下列一组序列对的HCVR和LCVR对所含有的CDR 序列:2/10、18/26、34/42、66/74、82/90、114/122 或 180/188。在另一个实施方案中，该抗体或其片段包含序列号为66/74的HCVR和LCVR序列对所含有的CDR序列。
[0015]在另一个相关的实施方案中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段在与hANGPTL3特异性结合时，与一个包含选自下列一组序列对的HCVR/LCVR序列对所含有的重链和轻链CDR序列的抗体或其抗原结合片段竞争:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154 或 180/188。在一个实施方案中，在与hANGPTL3特异性结合时，本发明的抗体或其抗原结合片段与一个包含一个序列号为66/74的HCVR/LCVR序列对的抗体或其抗原结合片段竞争:在另一个实施方案中，在与hANGPTL3特异性结合时，本发明的抗体或其抗原结合片段与一个包含一个选自下列一组序列组合的重链和轻链CDR序列组合的抗体或其抗原结合片段竞争:4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32,36/38/40/44/46/48,52/54/56/60/62/64,68/70/72/76/78/80,84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128,132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160 及 182/184/186/190/192/194。在一个实施方案中，在与hANGPTL3特异性结合时，本发明的抗体或其抗原结合片段与一个包含一个序列号为68/70/72/76/78/80的重链和轻链CDR序列的抗体或其片段竞争。
[0016]在另一个相关的实施方案中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与hANGPTL3上由一个包含选自下列一组HCVR/LCVR序列对的重链和轻链CDR序列的抗体或其片段识别的同一表位结合:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154 或 180/188。在一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段与hANGPTL3上由一个包含一个序列号为66/74的HCVR/LCVR序列对的抗体或其片段识别的同一表位结合:在一个实施方案中，本发明的抗体或其片段与hANGPTL3上由一个包含一个选自下列一组序列组合的重链和轻链⑶R序列组合的抗体或其抗原结合片段识别的同一表位结合:4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48,52/54/56/60/62/64,68/70/72/76/78/80,84/86/88/92/94/96,100/102/104/108/110/112、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160 及 182/184/186/190/192/194。在一个实施方案中，这样的表位是被一个包含一个序列号为68/70/72/7`6/78/80的重链和轻链CDR序列组合的抗体或其片段识别的。
[0017]在第三个方面，本发明的特点是一种分离的抗hANGPTL3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与位于161号序列的第17至209残基的N-端螺旋卷曲区内的一个表位结合，並中和、抑制、消除、降低或干扰hANGPTL3的至少一种活性。在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的抗体或抗体的抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与位于hANGPTL3 (161号序列)的N-端螺旋卷曲区内的一个表位结合，並中和、抑制、消除、降低或干扰hANGPTL3的至少一种活性，但其前提是该抗体或其片段不与序列号为170的ANGPTL3肽(对应于161号序列hANGPTL3的Glu32至Leu57残基)结合。在一个实施方案中，本发明的抗体或其片段可任选地与位于hANGPTL3(161号序列)的17至200、17至100、17至70、17至65、17至60、17至57或17至50残基内的一个表位特异性结合，其前提是该抗体或其片段不与序列号为170的ANGPTL3肽结合。在另一个实施方案中，该抗体或其片段可任选地与位于hANGPTL3 (161号序列)的40至200、40至100、40至70、50至200、50至100、50至70、58至200、58至100、58至70、58至68或61至66残基内的一个表位结合，其前提是该抗体或其片段不与序列号为170的ANGPTL3肽结合。在某些实施方案中，该抗体或其片段可任选地与一个可涉及hANGPTL3的N-端螺旋卷曲区内一个以上所列表位或残基的表位结合，其前提是该抗体或其片段不与序列号为170的ANGPTL3肽结合。
[0018]在第四个方面，本发明提供了编码抗ANGPTL3抗体或其片段(尤其是上述任何一种抗体或其片段)的核酸分子。本发明还包括运载本发明核酸的重组表达载体，以及引入这类载体的宿主细胞，例如细菌细胞，如大肠杆菌，或哺乳动物细胞，如CHO细胞，并包括一些在允许产生抗体的条件下通过培养宿主细胞而产生抗体，以及回收所产生抗体的方法。
[0019]在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体或其片段，其包含一个由选自下列一组序列的核酸序列编码的HCVR:1、17、33、49、65、81、97、113、129、145和179，或一个与其实质上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列。在另一个实施方案中，该抗体或其片段包含一个由序列号为1、17、33、65、81、113或179的核酸序列编码的HCVR0在另一个实施方案中，该抗体或其片段包含一个由序列号为65的核酸序列编码的HCVR0
[0020]在一个实施方案中，抗体或其抗体结合片段包含一个由选自下列一组序列的核酸序列编码的LCVR:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153和187，或一个与其实质上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列。在另一个实施方案中，该抗体或其片段包含一个由序列号为9、25、41、73、89、121或187的核酸序列编码的1^0^。在另一个实施方案中，该抗体或其片段包含一个由序列号为73的核酸序列编码的LCVR。
[0021]在进一步的实施方案中，该抗体或其片段包含一个由选自下列一组序列对的核酸序列对编码的 HCVR 和 LCVR (HCVR/LCVR)序列对:1/9、17/25、33/41、49/57、65/73、81/89、97/105、113/121、129/137、145/153和179/187。在一个实施方案中，该抗体或其片段包含一个由序列号为1/9、17/25、33/41、65/73、81/89、113/121或179/187的核酸序列对编码的HCVR/LCVR序列对。在另一个实施方案中，该抗体或其片段包含一个由序列号为65/73的核酸序列对编码的HCVR/LCVR序列对。
[0022]在一个实施方案中，本发明的特点是一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的HCDR3结构域:7、23、39、55、71、87、103、119、135、151和185，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列；以及一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的LCDR3结构域:15、31、47、63、79、95、111、127、143、159和193，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列。在一个实施方案中，该抗体或其片段包含一个由序列号为 7/15、23/31、39/47、55/63、71/79、87/95、103/111、119/127、135/143、151/159 或185/193的核酸序列对编码的HCVR和LCVR序列对。在另一个实施方案中，该抗体或其片段包含一个由序列号为7/15、23/31、39/47、71/79、87/95、119/127或185/193的核酸序列对编码的HCVR和LCVR序列对。在另一个实施方案中，该抗体或其片段包含一个由序列号为71/79的核酸序列对编码的HCVR和LCVR序列对。
[0023]在一个进一`步的实施方案中，该抗体或其片段进一步包含一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的HCDRl结构域:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147和181，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列；以及一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的HCDR2结构域:5、21、37、53、69、85、101、117、133、149和183，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列；以及可选地进一步包含一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的LCDRl结构域:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155和189，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列；及/或一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的LCDR2结构域:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157和191，或一种与其实质上相似、具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列。
[0024]或者，本发明的特点是一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个由选自下列一组序列组合的核苷酸序列组合编码的HCDR1/HCDR2/HCDR3组合:3/5/7、19/21/23、35/37/39、51/53/55、67/69/71、83/85/87、99/101/103、115/117/119、131/133/135、147/149/151和181/183/185 ;及/或一个选自下列一组序列组合的核苷酸序列组合编码的LCDR1/LCDR2/LCDR3 组合:11/13/15、27/29/31、43/45/47、59/61/63、75/77/79、91/93/95、107/109/111、123/125/127、139/141/143、155/157/159 和 189/191/193。在一个实施方案中，该抗体或其片段包含由一个序列号为67/69/71/75/77/79的核苷酸序列组合编码的重链和轻链CDR序列。
[0025]在第五个方面，本发明的特点是一种人抗ANGPTL3抗体或其抗原结合片段，其包含一个由衍生自VH、Dh和Jh种系序列的核苷酸序列片段编码的重链可变区(HCVR)，以及一个由衍生自Vk和Jk种系序列的核苷酸序列片段编码的轻链可变区(LCVR)，其中的HCVR和LCVR由选自下列一组组合的种系序列组合所衍生的核苷酸序列片段编码:(i)VH3-43、Dh3-3、Jh3、Vk1-5 和 JK2 ; (ii) VH3_11、DH1_1、JH4、Vk1-39 和 JK4 ; (iii) VH3_30、DH1_7、JH6、VKl-5 和 JkI ;(^八113-30、0111-26、16、￥1?1-12和13;(￥)￥113-30、0113-10、16、￥1?1-12和13 ；以及(vi) Vh3-23、Dh3-10、Jh4、Vk1-5 和 JkI。
[0026]在第六个方面，本发明的特点是一种与hANGPTL3特异性结合的抗体或其抗原结合片段，以表面等离子共振分析(如BIAC0RE?)测量时，其平衡解离常数(Kd)为约7nM或以下、约6nM或以下、约5nM或以下、约4nM或以下、约3nM或以下、约2nM或以下，或约InM或以下。在某些实施方案中，本发明的抗体显示的Kd为约SOOpM或以下；约700?11或以下；约600pM或以下^ 500pM或以下^400pM或以下44 300ρΜ或以下^ 200ρΜ或以下；约IOOpM或以下；或约50pM或以下。
[0027]在第七个方面，本发明提供了一种抗hANGPTL3抗体或其抗原结合片段，根据如本文所述的ELISA、表面等离子共振分析，或LUMINEX? XMAP?技术测定，该抗体或其抗原结合片段与序列号为161的hANGPTL3蛋白结合，但不与相关的蛋白如人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4，序列号为164)发生交叉反应。ANGPTL4是另一种分泌蛋白，已知能降低LPL活性并含有一个N-端螺旋卷曲区和一个C-端纤维蛋白原样结构域(Ge et al.，2004，J BiolChem279:2038-2045;Yau et al.，2009，J Biol Chem284:11942-11952)。在一些相关的实施方案中，本发明提供了一种抗hANGPTL3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与hANGPTL3蛋白结合并与hANGPTL4蛋白发生交叉反应。在某些实施方案中，该hANGPTL3抗体或其片段与hANGPTL4蛋白的结合亲和力是该抗体或其片段与hANGPTL3蛋白的结合亲和力的约75%或以下，或约50%或以下。[0028]在另一个相关的实施方案中，本发明提供了一种抗hANGPTL3抗体或其抗原结合片段，其不与小鼠ANGPTL3 (mANGPTL3 ;序列号163)或大鼠ANGPTL3 (rANGPTL3 ;序列号175)发生交叉反应，但与猕猴(Macaca fascicularis)ANGPTL3 (MfANGPTL3)例如序列号为177的N-端17-170残基(一种MfANGPTL3的部分氨基酸序列)发生交叉反应。在另一个相关的实施方案中，本发明提供了一种抗hANGPTL3抗体或其抗原结合片段，其与MfANGPTL3、mANGPTL3和rANGPTL3发生交叉反应。
[0029]本发明包括具有一种经修饰的糖基化模式的抗hANGPTL3抗体。在某些应用中，进行修饰以除去某些不希望的糖基化位点也许是有益的，或例如除去岩藻糖基以提高抗体依赖细胞毒性(ADCC)功能(参阅Shield et al.(2002) JBC277:26733)。在其它一些应用中，除去糖基化位点也许会减弱不希望发生的对治疗性抗体的免疫反应，或增强抗体的亲和力。在另一些应用中，为了改变补体依赖细胞毒性(CDC)，可进行半乳糖基化的修饰。
[0030]在第八个方面，本发明之特点是一种含有与hANGPTL3特异性结合的重组人抗体或其片段以及一种药学上可接受载体的医药组合物。在一个实施方案中，本发明提供了一种医药组合物，其含有一种或多种不相互交叉竞争的本发明的抗hANGPTL3抗体或其片段，以及一种药学上可接受的载体。在一个实施方案中，本发明的医药组合物可含有两种或多种在与hANGPTL3特异性结合过程中不相互交叉竞争并能有效地将hANGPTL3从循环系统中清除的非阻断性抗体。适宜的非阻断性抗体组合包括但不限于包含选自下列一组序列对的HCVR和LCVR序列对(HCVR/LCVR)的抗体组合:(i)序列号分别为82/90和180/188的序列对；(ii)序列号分别为114/122和180/188的序列对；(iii)序列号分别为82/90和18/26的序列对；或(“)序列号分别为114/122和18/26的序列对。
[0031]在一些相关的实施方案中，本发明之特点是一种组合物，它是本发明之抗体或其抗原结合片段与第二种治疗剂的结合。第二种治疗剂可以是下列任何药剂中的一种或多种:(1)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂，例如西利维司汀(cerivastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastin)、瑞舒 伐它汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)等；(2)胆固醇吸收和/或胆汁酸再吸收的抑制剂；(3)增加脂蛋白分解代谢的烟酸；(4)降低低密度脂蛋白(LDL)水平、改善高密度脂蛋白(HDL)和TG水平，以及减少非致命心脏病发作次数的贝特类药物(fibrates)或两性羧酸；以及(5)在胆固醇如22-羟基胆固醇的清除过程中起作用的LXR转录因子的活化剂，或某些固定组合，如依泽替米贝(ezetimibe)加辛伐他汀(simvastatin)种他汀类药物加胆汁树脂(如消胆胺(cholestyramine)、降脂树脂 II (colestipol)、考来维仑(colesevelam),烟酸与一种他汀类药物的固定组合(如烟酸加洛伐他汀)；或与其他降脂质药剂如欧米加-3-脂肪酸乙酯(如omacor)的固定组合。此外，第二种治疗剂可以是ANGPTL3的一种或多种其它抑制剂，以及其它分子如ANGPTL4、ANGPTL5、ANGPTL6以及前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (PCSK9)的抑制剂，它们参与脂质代谢，尤其是胆固醇和/或甘油三酯的动态平衡。这些分子的抑制剂包括与这些分子特异性结合及阻断其活性的小分子和抗体。
[0032]在一些相关的实施方案中，该第二种治疗剂可以是一种或多种抗癌剂，如化疗剂、抗血管生成剂、生长抑制剂、细胞毒剂、凋亡剂，以及本领域内众所周知的治疗癌症或其它增生性疾病或失调的其它治疗剂，以及其它治疗剂，如止痛药、抗炎药，包括非类固醇抗炎药(NSAIDS)，如Cox-2抑制剂等，以便改善和/或减轻伴随潜在癌症/肿瘤的症状。
[0033]在第九个方面，本发明的特点是一些利用一种或多种本发明的抗hANGPTL3抗体或其抗原结合片段以中和、抑制、阻断、降低或干扰hANGPTL3活性的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种给需要治疗的受试者施用一种治疗有效量医药组合物的治疗方法，该医药组合物含有一种或多种本发明的抗hANGPTL3抗体或其抗原结合片段，以及可选地含有一种或多种上述其它治疗剂。本发明的抗ANGPTL3抗体或其抗原结合片段可以是抗ANGPTL3的中和抗体或非阻断型抗体，或其组合。
[0034]在一些相关的实施方案中，本发明提供了一些从需要治疗的受试者之循环系统中清除hANGPTL3时提高清除率的方法，该方法包括给受试者施用至少两种在与hANGPTL3的结合过程中不相互竞争的本发明的抗hANGPTL3抗体或其片段，较佳的是不阻断hANGPTL3的至少一种活性的抗体或其片段(即非阻断性抗体)。所提及的hANGPTL3的至少一种活性包括，但不限于，抑制LPL活性、诱导血管生成等。在一个实施方案中，相对于非施用抗体或片段的情况，一种包含至少两种非阻断性抗hANGPTL3抗体或其片段的结合，将从循环系统清除hANGPTL3的清除率提高了至少约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%，或约80%。循环系统中hANGPTL3的水平可以本领域内众所周知及本文所述的体外测定法测量。在另一个实施方案中，所述至少两种非阻断性抗hANGPTL3抗体的结合包含选自以下序列对的HCVR和LCVR序列对(HCVR/LCVR):(i)序列号分别为82/90和180/188的序列对；(ii )序列号分别为114/122和180/188的序列对；(iii)序列号分别为82/90和18/26的序列对；或(iv)序列号分别为114/122和18/26的序列对。
[0035]可用本发明的方法治疗的疾病或失调是，与不用抗hANGPTL3抗体治疗的疾病或失调(例如ANGPTL3-介导的疾病或失调)相比，通过除去、抑制、降低或干扰ANGPTL3的活性，可得到改善、减轻、抑制或防止，或发生率下降的任何疾病或失调。可用本发明之方法治疗的疾病或失调的实例包括但不限于涉及脂质代谢的疾病，如高脂血症、高脂蛋白血症和血脂异常，包括致动脉粥样硬化的血脂异常、糖尿病性血脂异常、高甘油三酯血症，包括TG>1000mg/dL的严重高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症、混合性血脂异常(肥胖症、代谢综合症、糖尿病等)、脂肪代谢障碍、脂肪萎缩等，引起上述疾病的原因为:例如，LPL活性下降和/或LPL缺乏、LDL受体(LDLR)活性下降和/或LDL受体缺乏(例如，特征为LDLR+的纯合子型家族性高胆固醇血症)、ApoC2改变、ApoE缺乏、ApoB增加、极低密度脂蛋白(VLDL)产生增加和/或消除下降、某些药物治疗(例如，糖皮质激素治疗引起的血脂异常症)，任何遗传倾向、饮食，生活方式等。本发明的方法也可以预防或治疗与高脂血症、超脂蛋白血症和/或血脂异常相关或由其引起的疾病，包括但不限于，心血管疾病或失调，如动脉粥样硬化、动脉瘤、高血压、心绞痛、中风、脑血管疾病、充血性心脏衰竭、冠状动脉疾病、心肌梗塞、周围血管疾病等；急性胰腺炎；非酒精性脂肪性肝炎(NASH);血糖失调，如糖尿病；肥胖症等。
[0036]可用本发明的方法治疗的疾病或失调的其它实例包括癌症/肿瘤和非肿瘤性血管生成相关的疾病或病症，包括眼部血管生成性疾病或失调，如年龄相关性黄斑变性、视网膜中央静脉阻塞或视网膜分支静脉阻塞、糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病等；炎症性疾病或失调，如关节炎、类风湿关节炎(RA)、银屑病等。 [0037]在审阅随后的详细说明的过程中，其它实施方案将变得明显。[0038]附图简要说明
[0039]图1显示了在一项抗hANGPTL3抗体结合实验(实施例5)中，使用肽1_3与hANGPTL3序列相关部分(即161号序列或GenBank # NP_055310的第30至70残基)的序列比对。肽I (对照:ANGPTL4肽；168号序列)；肽2 (ANGPTL3肽；169号序列)；及肽3(ANGPTL3 肽；170 号序列)。
[0040]图2显示了抗hANGPTL3抗体与hANGPTL3的N-端螺旋卷曲区的肽(肽2和3)或hANGPTL4 (肽I)结合的结果:同型对照；和H4H1276S抗体。
[0041]详细说明 [0042]在详细说明本发明之前，应该理解，本发明并不限于所说明的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解，本文所用的术语仅出于说明具体实施方案的目的，并非意在限制本发明，因为本发明之范围仅受所附权利要求书的限制。
[0043]除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均将具有与本发明所属【技术领域】的一般专业人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料都可用于本发明之实施或试验，现将说明的是首选的方法和材料。
[0044]定义
[0045]本文所用的术语“人血管生成素样蛋白3”或〃hANGPTL3〃是指含有162号序列所示核酸序列和161号序列所示氨基酸序列或其生物活性片段的ANGPTL3。
[0046]本文所用的术语“抗体”意指由四条多肽链即两条重链(H)和两条轻链(L)以二硫键相互连接而组成的免疫球蛋白分子。每条重链均由一个重链可变区(HCVR)和一个重链恒定区组成(Ch ;由Ch1、Ch2和Ch3结构域组成)。每条轻链均由一个轻链可变区(LCVR)和一个轻链恒定区(Q)组成。该HCVR和LCVR区可进一步分为被称为互补决定区(⑶R)的高变区，其中散布着一些更保守的被称为框架区(FR)的区域。每个HCVR和LCVR均由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按照以下顺序排列:FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
[0047]一个或多个CDR残基的取代或一个或多个CDR的删除也是可能的。在科学文献中已经叙述了其中一个或两个CDR可被删除以用于结合的抗体。Padlan et al.(1995FASEBJ.9:133-139)基于已发表的晶体结构，分析了抗体及其抗原之间的接触区，并得出结论，只有约五分之一至三分之一的⑶R残基与抗原实际接触。Padlan还发现了许多抗体，其中一个或两个⑶R不含与抗原接触的氨基酸(还可参阅Vajdos et al.2002J MolBiol320:415-428)。
[0048]那些不接触抗原的CDR残基可基于先前的研究，通过分子模拟和/或根据经验从位于Chothia⑶R区外的Kabat⑶R区识别(例如⑶RH2中的H60-H65残基往往是不需要的)。如果一个CDR或其残基被删除，通常它会被另一个人抗体序列或这类序列共有区内占据相应位置的氨基酸取代。CDR和氨基酸内的取代位置也可根据经验选择。经验取代可以是保守的或非保守的取代。
[0049]本文所用的术语“人抗体”意在包括含有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明之人HlAbs抗体可包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)，例如可在CDR中尤其是在CDR3中包括这样的氨基酸残基。但是，本文所用的术语“人抗体”并不意图包括其中衍生自另一哺乳动物物种(如小鼠)的CDR序列被嫁接到人框架序列上的mAbs抗体。
[0050]与相应的种系序列相比，本文所公开的完全人源化抗hANGPTL3抗体，在重链和轻链可变区的框架区和/或CDR区可包含一个或多个氨基酸的取代、插入和/或缺失。通过将本文所公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库可获得的种系序列相比，可以轻易地证实这类突变。本发明包括衍生自本文所公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生该抗体的种系序列的相应残基，或突变为另一个人类种系序列的相应残基，或突变为相应的种系序列残基的保守氨基酸取代(这类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本发明所属【技术领域】的一般专业人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，能容易地产生许多包含一个或多个单个种系的回复突变或其组合的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方案中，上述Vh和/或\结构域内的所有框架和/或CDR残基均回复突变为在衍生该抗体的原始种系序列中发现的残基。在其它实施方案中，只有某些残基才回复突变为原始种系序列，例如，只有在FRl的最先8个氨基酸或FR4的最后8个氨基酸中发现的突变残基，或只有CDRl、CDR2或CDR3中发现的突变残基，才回复突变为原始种系序列。在其它实施方案中，一个或多个框架和/或CDR残基回复突变为一个不同种系序列(即一个不同于最初衍生该抗体的种系序列的种系序列)的相应残基。此外，本发明之抗体可在框架区和/或⑶R区内含有两个或多个种系突变的任何组合，例如，其中某些残基分别突变为一个特定种系序列的相应残基，而某些其它不同于原始种系序列的残基则保持不变或突变为一个不同种系序列的相应残基。一旦获得含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段之后，就能容易地测试其一种或多种所需的特性，例如改善的结合特异性、提高的结合亲和力、改善或增强的拮抗或对抗的生物学特性(视情况而定)、 下降的免疫原性等。以此一般方式获得的抗体和抗原结合片段均包括在本发明的范围内。
[0051]本发明还包括含有本文所公开的任何HCVR、LCVR和/或⑶R氨基酸序列之变异体的抗ANGPTL3抗体，该变异体含有一个或多个保守的氨基酸取代。例如，本发明包括含有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗ANGPTL3抗体，该氨基酸序列相对于本文所公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，含有例如10个或以下、8个或以下、6个或以下、4个或以下、2个或I个保守的氨基酸取代。在一个实施方案中，HCVR包含其中有10个或以下保守氨基酸取代的487号氨基酸序列。在另一个实施方案中，HCVR包含其中有8个或以下保守氨基酸取代的487号氨基酸序列。在另一个实施方案中，HCVR包含其中有6个或以下保守氨基酸取代的487号氨基酸序列。在另一个实施方案中，HCVR包含其中有4个或以下保守氨基酸取代的487号氨基酸序列。在另一个实施方案中，HCVR包含其中有2个或I个保守氨基酸取代的487号氨基酸序列。在一个实施方案中，LCVR包含其中有10个或以下保守氨基酸取代的44号氨基酸序列。在另一个实施方案中，LCVR包含其中有8个或以下保守氨基酸取代的44号氨基酸序列。在另一个实施方案中，LCVR包含其中有6个或以下保守氨基酸取代的44号氨基酸序列。在另一个实施方案中，LCVR包含其中有4个或以下保守氨基酸取代的44号氨基酸序列。在另一个实施方案中，LCVR包含其中有2个或I个保守氨基酸取代的44号氨基酸序列。
[0052]除非另行特别指出，本文所用的术语“抗体”应被理解为包括含有两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链(即“完整的抗体分子”)及其抗原结合片段的抗体分子。本文所用的抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等术语，包括与一个抗原特异性结合而形成复合体的任何天然产生的、以酶促方式获得的、合成的或基因改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区和(可选地)恒定区的DNA之操纵和表达的重组基因改造技术，从完整的抗体分子产生。这样的DNA是已知的和/或很容易从例如市售来源、DNA库(包括例如噬菌体展示-抗体库)获得，或可以合成。该DNA可以测序且以化学方法或分子生物学技术加以操纵，例如将一个或多个可变区和/或恒定区排列成一种适宜的构型，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。
[0053]抗原结合片段的非限制性实例包括:(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv) Fv片段；(V)单链Fv(scFv)分子；(vi) dAb片段；以及(vii)由模拟该抗体高变区(例如一个孤立的互补决定区⑶R，如一个⑶R3肽)或一个FR3-⑶R3-FR4构型约束肽的氨基酸残基组成的最小识别单位。其它工程分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域删除的抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双抗体、三聚抗体、四聚抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块化免疫药物(SMIP)，以及鲨鱼可变IgNAR结构域，也被包括在本文所用的“抗原结合片段”这一表达中。
[0054]一个抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变区。可变区可以是任何大小或由任何氨基酸组成，且通常包含至少一个邻近一个或多个框架序列或位于其中的⑶R。在含有与\区相关联之Vh区的抗原结合片段中，该Vh区和\区的相对位置可处于任何适宜的排列。例如，该可变区可以是二聚化的且含有VH-VH、VH-'或二聚体。或者，一个抗体的抗原结合片段可含有一个单一的Vh区或 '区。
[0055]在某些实施方案中，一个抗体的抗原结合片段可含有与至少一个恒定区共价连接的至少一个可变区。在本发明之抗体的抗原结合片段内可发现的可变区和恒定区的非限制性示范性构型包括:⑴ Vh-ChI ； (ii) Vh-Ch2 ; (iii) Vh-Ch3 ； (iv) VH-CH1-CH2 ； (v)Vh-Ch1-Ch2-Ch3 ； (vi)VH-CH2-CH3 ； (vii) Vh-Cl ； (viii) Vl-ChI ； (ix)VL-CH2 ； (x) VL-CH3 ； (xi)VL-CH1-CH2 ；(xii)VL-CHl-CH2-C`H3 ；(xiii)VL-CH2-CH3 ;以及(Xiv)Vk 在可变区和恒定区的任何构型中，包括上述任何示范性构型，该可变区和恒定区可直接地相互连接或可籍由一个完全的或部分的铰链区或连接区连接。一个铰链区可含有至少2个(例如5、10、15、20、40,60个或更多的)氨基酸，其在一个单一肽分子中相邻的可变区和/或恒定区之间形成一种柔性或半柔性的连接。此外，本发明之抗体的抗原结合片段可包含上述可变区和恒定区的任何构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)，该可变区和恒定区以非共价键相互连接和/或与一个或多个单一的Vh区或\区(例如通过二硫键)连接。
[0056]如同完整的抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性(例如双特异性的)。一个抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变区，其中每个可变区能够特异性地与另一个抗原或同一抗原的不同表位结合。对于任何多特异性抗体形式，包括本文所公开的示范性双特异性抗体形式，均可用本领域内可利用的惯用技术，使其适应于涉及本发明之抗体的抗原结合片段的用途。
[0057]在某些实施方案中，本发明之抗体或抗体片段可与一种治疗基团(“免疫偶联物”)如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素等偶联。[0058]“特异性结合”或类似术语意为一个抗体或其抗原结合片段与一个在生理条件下相对稳定的抗原形成复合体。特异性结合可以约为IxlO-6M或更小的平衡解离常数(Kd)来描述(换言之，较小的Kd就意味着较紧密的结合)。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振等方法。但是，一种与hANGPTL3特异性结合的分离抗体可能显示出与其它抗原(如源自其它物种的ANGPTL3分子，例如猕猴ANGPTL3、小鼠ANGPTL3、大鼠ANGPTL3，及/或含有序列号为164的氨基酸序列的hANGPTL4)的交叉反应性。然而，与hANGPTL3及一个或一个以上其它抗原结合的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，按照本文所用的说法，依然被认为是与hANGPTL3“特异性结合”的抗体。
[0059]“高亲和力”抗体这一术语是指与hANGPTL3的结合亲和力很高的抗体，经表面等离子共振技术例如BIAC0RE?或溶液亲和力ELISA测定，其表达为Kd的结合亲和力为约2xl(T9M或以下、约1.5χ10-9Μ或以下、约IxKT9M或以下、约0.5xl(T9M或以下、约0.25xl(T9M或以下、约IxKT10M或以下，或约0.5xlO_1QM或以下。
[0060]本文所用的术语“KD”意指特定的抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
[0061]术语“慢解离速率”(slow off rate)、“K0fT”或“kd”是指经表面等离子共振技术例如BIAC0RE?测定，抗体从hANGPTL3解离时速率常数为4x I (TY1或以下、3x I θ?或以下、2110_3^或以下、IxKT3iT1或以下、ΙχΙΟ?或以下。
[0062]术语“内在亲和力常数”或“ka”是指经表面等离子共振技术例如BIAC0RE?测定，抗体与hANGPTL3结合时速率常数约为IxlO3M-1S-1或更高。
[0063] 本文所用的“分离抗体”意指实质上不含其它具有不同抗原特异性的mAbs的抗体(例如与hANGPTL3特异性结合的分离抗体就在实质上不含能与除hANGPTL3以外抗原特异性结合的mAbs)。但是，一种与hANGPTL3特异性结合的分离抗体也可具有与其它抗原(如源自其它物种例如猕猴、小鼠、大鼠的ANGPTL3分子及/或其它相关蛋白如hANGPTL4)的交叉反应性。
[0064]本文所用的术语“中和”、“阻断”或“消除”抗体(或“中和”、“阻断”或“消除” ANGPTL3活性的抗体)，意指一种经本领域内标准体外测定法确定(例如，参阅下文的实施例)，其与ANGPTL3的结合导致了 ANGPTL3的至少一种生物活性被抑制的抗体。“中和”、“抑制”、“阻断”和“消除”等术语在本文中可互换使用。“非阻断性抗体”是指一种经标准的体外测定法确定，其与ANGPTL3的结合不直接阻断ANGPTL3靶向活性的抗体，但其仍然可以是一种“干扰”抗体，其与ANGPTL3的结合，导致了体内ANGPTL3至少一种生物活性的间接抑制、降低、弱化或其它干扰，例如通过提高ANGPTL3从循环系统的清除率的方式。ANGPTL3从循环系统的清除率尤其可通过至少两种非阻断性抗体的结合而提高。ANGPTL3生物活性的中和、抑制、取消、降低、弱化或干扰，可通过以本领域内周知的若干标准的体外或体内测定法中一种或多种方法测定ANGPTL3生物活性的一个或多个指标进行评估(也参阅下文的实例)。
[0065]本文所用的术语“表面等离子共振”是指一种光学现象，基于这种光学现象可利用例如 BIAC0RE? 系统(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)来检测生物传感器基质中蛋白质浓度的变化，从而对实时生物特异性相互作用进行分析。
[0066]术语“表位”是指抗原中与抗体结合的区域。表位可定义为结构性表位或功能性表位。功能性表位通常是结构性表位的一个亚型，并具有直接影响相互作用亲和力的残基。表位可以是构象表位，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可包括决定簇，后者是分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基类或磺酰基类；在某些实施方案中，表位可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
[0067]术语“实质上同一性”或“实质上相同”，当指核酸或其片段时，表示当以适当的核苷酸插入或删除与另一个核酸(或其互补链)最佳比对时，以如下所述的任何众所周知的序列同一性算法如FASTA、BLAST或GAP测量，至少具有90%的核苷酸碱基序列同一性，更佳的是至少有95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸碱基序列同一性。
[0068]当应用于多肽时，术语“实质上相似性”或“实质上相似”意为当使用诸如GAP或BESTFIT等程序的预设间隙重量，两个肽序列在达到最佳比对时，具有至少90%的序列同一性，更佳的是具有至少95%、98%或99%的序列同一性。较佳的是，不相同的残基位置的差别仅在于保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是指这样一种取代，即一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似的侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般而言，保守的氨基酸取代不会在实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多的氨基酸序列相互之间的差别仅在于某些保守取代的情况下，可将序列相似性的百分比或程度向上调整，以针对取代的保守特性作出校正。进行这种调整的方法是本领域专业人员众所周知的。参阅例如Pearson (1994) Methods Mol.Biol.24:307-331。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括:1)脂族侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链:丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链:天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链:天冬氨酸和谷氨酸，以及7)含硫侧链:半胱氨酸和甲硫氨酸。较佳的保守氨基酸取代类别是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守的取代是Gonnet et al.(1992) Science256:144345中所公开的PAM250对数似然矩阵(PAM2501og-likelihood matrix)中任何正值的变化。“中度保守的”取代是PAM250对数似然矩阵中非负值的任何变化。
[0069]多肽的序列相似性通常用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件用指定给各种取代(包括保守氨基酸取代)、缺失和其它修饰的相似性程度对相似的序列进行比对。例如，GCG软件含有诸如GAP和BESTFIT程序，可以默认参数使用这些程序，以确定紧密相关的多肽例如源自不同生物物种的同源多肽之间的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白及其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参阅例如GCG Version6.1。还可以用GCGVersion6.1中的FASTA程序以默认参数或推荐参数来比较多肽序列。FASTA (例如FASTA2和FASTA3)能提供被查询序列和被搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分t匕(Pearson(2000)，出处同上)。当将本发明之序列与含有大量源自不同生物之序列的数据库进行比较时，另一较佳的算法是BLAST电脑程序，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参阅例如 Altschul et al.(1990) J.Mol.Biol.215:403410 及(1997) Nucleic AcidsRes.25:3389402。
[0070]“治疗有效量”这一短语意为对受药对象能产生预期作用的量。确切的剂量将取决于治疗目的、治疗对象的年龄和体形大小、给药途径等，并可由本领域专业人员利用已知技术确定(例如参阅 Llo`yd(1999)The Art, Science and Technology of PharmaceuticalCompounding)。
[0071]人源抗体的制备
[0072]在转基因小鼠体内产生人源抗体的方法是已知的。任何这类周知的方法均可依据本发明用于制造与ANGPTL3特异性结合的人抗体。
[0073]采用VEL0CIMMUNE?技术或任何其它产生单克隆抗体的已知技术，初步分离出对ANGPTL3具有高亲和力的含有一个人类可变区和一个小鼠恒定区的嵌合抗体。如下文实验部分所述，根据所需的特点包括亲和力、选择性、表位等来鉴定和选择抗体。
[0074]一般而言，本发明的抗体具有很高的亲和力，当根据其与固定在固相或液相的抗原之间的结合进行测量时，其Kd通常为约KT12M至约10_9M。用合乎需要的人类恒定区取代小鼠恒定区，例如野生型或经修饰的IgGl或IgG4，以产生本发明之完全人源化抗体。所选择的恒定区可根据特定的用途而改变，而抗体的高亲和力抗原结合特性和靶标特异性特征则保留于可变区中。
[0075]表位作图和相关技术
[0076]为了筛选与特定表位结合的抗体,可讲行如Antibodies, Harlow and Lane (ColdSpring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY) 一文中所述的常规交叉阻断测定。其它方法包括丙氨酸扫描突变体分析、妝印迹分析(Reineke (2004) Methods Mol Bio1248:443-63)或肽切割分析。另外，还可采用诸如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(Tomer(2000)Protein Science9:487-496)。
[0077]术语“表位”是指抗原上B细胞和/或T细胞对其作出响应的位点。B细胞表位可由相连的氨基酸形成，或者由通过蛋白的三级折叠而并列在一起的不相连氨基酸形成。由相连氨基酸形成的表位在接 触变性溶剂时通常可得以保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常会失去。表位通常包括至少3个、更经常是至少5个或8-10个以独特空间构象出现的氨基酸。
[0078]修饰辅助概况分析(Modification-Assisted Profiling, MAP)，也被称为基于抗原结构的抗体概况分析(Antigen Structure-based Antibody Prof iling, ASAP),是一种根据每种抗体与经化学或酶学修饰的抗原表面的结合状况的相似性对大量的指向同一个抗原的单克隆抗体(mAbs)进行分类的方法(美国专利2004/0101920)。每一类别均可反映与另一类所代表的表位截然不同或部分重叠的独特表位。这种技术可以迅速地过滤基因相同的mAbs,从而可使鉴定工作集中于基因不同的mAbs。当应用于杂交瘤筛选时，MAP有助于鉴定某些罕见杂交瘤克隆，后者能产生具有所需特性的mAbs。MAP可用于将本发明之抗ANGPTL3mAbs分成几组与不同表位结合的mAbs。
[0079]ANGPTL3含有一个氨基端螺旋卷曲结构域和一个羧基端纤维蛋白原样结构域(FD)，该ANGPTL3蛋白在缺乏分子间二硫键的情况下形成一种低聚物(Ge et al.，2005, JLipid Res46:1484-1490)。已有报导，N-端螺旋卷曲结构域在LPL活性的抑制过程中起重要作用(0no et al.,2003, J Biol Chem278:41804-41809)。因此，在某些实施方案中，抗hANGPTL3抗体或其抗体的抗原片段与hANGPTL3 (序列号161)的N-端螺旋卷曲区(残基17-209)内一个表位结合，并中和hANGPTL3的至少一种活性(例如抑制LPL活性)。在另一个实施方案中，该抗hANGPTL3抗体或其抗原结合片段与位于hANGPTL3的N-端螺旋卷曲区内的一个表位结合，并中和hANGPTL3的至少一种活性，但其前提是该抗体或其片段不与序列号为170的ANGPTL3肽结合。在一个实施方案中，该抗体或其片段可任选地与位于hANGPTL3(161 号序列)的 17 至 200,17 至 100,17 至 70,17 至 65,17 至 60,17 至 57,17 至 55,17 至50、17至45、17至40或17至35残基内一个表位特异性结合，其前提是该抗体或其片段不与序列号为170的ANGPTL3肽结合。在另一个实施方案中，该抗体或其片段可任选地与位于 hANGPTL3 (161 号序列)的 40 至 200、40 至 100、40 至 70、50 至 200、50 至 100、50 至 70、58至200、58至100、58至70、58至68或61至66残基(称为“肝素结合基序”)内一个表位特异性结合，其前提是该抗体或其片段不与序列号为170的ANGPTL3肽结合。在某些实施方案中，该抗体或其片段可任选地与一个可涉及hANGPTL3的N-端螺旋卷曲区内一个以上所列表位或残基的表位结合，其前提是该抗体或其片段不与序列号为170的ANGPTL3肽结
八
口 ο
[0080]在其它一些实施方案中，hANGPTL3抗体或其片段可任选地与一个或多个hANGPTL3的片段结合，例如与hANGPTL3 (序列号161)的一个含有至少5个残基、至少7个残基、至少10个残基、至少20个残基、至少30个残基、至少50个残基、至少70个残基、至少100个残基、至少150残基，或至少200残基的片段结合，其前提是该抗体或其片段不与序列号为170的ANGPTL3肽结合。
[0081]本发明包括如同本文所述的任何特定示范性抗体与同一表位结合的hANGPTL3抗体。类似地，本发明还包括与本文所述的任何特定示范性抗体在与hANGPTL3或hANGPTL3片段结合过程中竞争的抗hANGPTL3抗体。
[0082]使用本领域内已知的常规方法，可以容易地确定一种抗体是否与本发明之对照抗hANGPTL3抗体一样与同一表位结合,或在结合过程中竞争。例如,为了确定一种试验抗体是否与本发明之对照抗hANGPTL3抗体一样与同一表位结合，就让该对照抗体与hANGPTL3蛋白或肽在饱和条件下结合。然后，评估试验抗体与该hANGPTL3分子结合的能力。如果该试验抗体在与对照抗hANGPTL3抗体饱和`结合之后能够与hANGPTL3结合，就可得出结论，该试验抗体和对照抗hANGPTL3抗体与不同的表位结合。在另一方面，如果该试验抗体在与对照抗hANGPTL3抗体饱和结合之后不能与hANGPTL3分子结合，那么该试验抗体就可能与本发明之对照抗hANGPTL3抗体所结合的同一表位结合。
[0083]为了确定一种抗体是否与对照抗hANGPTL3抗体在结合过程中竞争，在两个方向实施上述结合方法:在第一个方向，让对照抗体与hANGPTL3分子在饱和条件下结合，然后评估试验抗体与该hANGPTL3分子的结合状况。在第二个方向，让试验抗体与hANGPTL3分子在饱和条件下结合，然后评估对照抗体与该hANGPTL3分子的结合状况。如果在这两个方向只有第一个(饱和)抗体能够与hANGPTL3分子结合，那就可以得出结论，该试验抗体与对照抗体在与hANGPTL3结合过程中互相竞争。如同本领域一般专业人员所能理解的，与对照抗体在结合过程中竞争的抗体未必与对照抗体所结合的同一表位结合，但可与一个重叠或邻近的表位结合而在空间上阻断该对照抗体的结合。
[0084]如果每个抗体竞争性地抑制(阻断)另一抗体与抗原的结合，这两个抗体就会与同一个或重叠的表位结合。换言之，一种过量I倍、5倍、10倍、20倍或100倍的抗体将抑制另一抗体的结合达至少50%，但较佳的是75%，90%或甚至99%，如在竞争结合分析中所测量(参阅例如 Junghans et al., Cancer Res, 1990:50:1495-1502)。或者，如果抗原中降低或消除一种抗体结合的几乎所有氨基酸突变都能降低或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果降低或消除一种抗体结合的某些氨基酸突变能降低或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠的表位。
[0085]然后可进行其它常规的实验(例如肽突变和结合分析)，以确定观察到的试验抗体的结合不足是否在实际上是由于与对照抗体所结合的同一表位结合，或是否空间阻断(或另一种现象)是所观察到的结合不足的原因。这类实验可采用ELISA、RIA、表面等离子共振技术、流式细胞计量法或本领域内所具备的任何其它定量或定性的抗体结合分析。
[0086]免疫偶联物
[0087]本发明包括一种与治疗基团(“免疫偶联物”)如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素等偶联的人抗ANGPTL3单克隆抗体。细胞毒素包括任何损害细胞的试剂。适宜于形成免疫偶联物的细胞毒素和化疗剂的实例是本领域内周知的。参阅如W005/103081。 [0088]双特异性
[0089]本发明之抗体可以是单特异性的、双特异性的，或多特异性的。多特异性mAbs抗体可以对同一目标多肽的不同表位具有特异性，或可含有对一个以上目标多肽具有特异性的抗原结合结构域。参阅，如Tutt et al.(1991) J.1mmunol.147:60-69)。人抗ANGPTL3mAbs抗体可与另一功能分子如另一个肽或蛋白连接，或与其共表达。例如，一种抗体或其片段可与一种或多种其它分子实体如另一种抗体或抗体片段实现功能性(例如以化学偶联、基因融合、非共价键连接或其它方式)连接，以产生具有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
[0090]可用于本发明的示范性双特异性抗体形式涉及使用第一个免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二个Ig Ch3结构域，其中第一个和第二个Ig Ch3结构域相互之间相差至少一个氨基酸，且与无氨基酸差别的双特异性抗体相比，其中至少一个氨基酸的差别减弱了双特异性抗体与蛋白A的结合力。在一个实施方案中，第一个Ig CH3结构域与蛋白A结合，第二个Ig Ch3结构域含有一个减弱或消除与蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(按照IMGT外显子编号法；按照欧盟编号法则为H435R)。第二个Ch3结构域可进一步包含Y96F修饰(按照MGT编号法；按照欧盟编号法则为Y436F)。可在第二个CH3结构域内找到的其它修饰包括:在IgGl抗体的情况下为D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I (按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I);在IgG2抗体的情况下为N44S、K52N和V82I (按照MGT编号法；按照欧盟编号法则为N384S、K392N和V422I);以及在 IgG4 抗体的情况下为 Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q 和 V82I (按照 IMGT 编号法；按照欧盟编号法则为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I )。上述双特异性抗体的各种变化形式均被认为属于本发明之范围。
[0091]生物等效物
[0092]本发明之抗hANGPTL3抗体和抗体片段包括某些蛋白，这些蛋白含有的氨基酸序列不同于所述mAbs抗体的氨基酸序列，但保留了与人ANGPTL3结合的能力。当与母体序列相比时，这类变异的mAbs抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代，但显示了与所述mAbs抗体的生物活性基本上相当的生物活性。类似地，当与所公开序列相比时，本发明之编码抗hANGPTL3抗体的DNA序列含有的序列包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或取代，但可编码与本发明之抗hANGPTL3抗体或抗体片段基本上生物等效的抗hANGPTL3抗体或抗体片段。这类变异氨基酸和DNA序列的实例已在上面讨论。
[0093]如果两种抗原结合蛋白或抗体是医药等效物或医药替换物，当在相似实验条件下无论以单剂或以多剂方式以相同摩尔剂量给药时，其吸收速率和程度均未显示显著差别，则它们被认为是生物等效的。某些抗体如果它们的吸收程度相当但吸收速率不相当，它们将被认为是等效物或医药替换物，并仍可被认为是生物等效的，因为这种吸收速率的差别是有意设计的并反映在标记上，这种差别对于达到有效的体内药物浓度是非关键性的(例如对于慢性用途)，并被认为对于所研究的具体医药产品在医学上是无关紧要的。在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和药效方面没有临床意义上的差别，则它们是生物等效的。
[0094]在一个实施方案中，如果一名患者可以在对照产品和生物产品之间转换一次或多次而不良影响的风险预期不会增加，包括与没有这种转换的连续治疗相比在免疫原性方面无显著的临床变化或有效性降低，则两种抗原结合蛋白就是生物等效的。
[0095]在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在使用条件下都以一种或多种共同的作用机制起作用，且这类机制是周知的，则它们就是生物等效的。
[0096]生物等效性可以体内和体外的方法演示。生物等效性的测量方法包括,例如，(a)一种在人类或其它哺乳类动物体内的试验，其中血液、血浆、血清或其它生物体液中抗体或其代谢物的浓度作为时间的函数测定；(b) —种体外试验，该试验已与人的体内试验生物利用率数据建立相关联系并可根据人的体内试验生物利用率数据合理预测；(C) 一种人类或其它哺乳类动物的体内试验，其中抗体(或其目标)适当的急性药理作用是作为时间的函数测定的；以及(d) —种有良好对照的临床试验，该试验确定抗体的安全性、有效性，或生物利用率或生物等效性。
[0097]可通过例如对无助于生物活性的残基或序列进行各种取代，或删除无助于生物活性的端部或内部残基或序列，而构建本发明的抗hANGPTL3抗体的生物等效变体。例如，对于生物活性无关紧要的半胱氨酸残基可被删除或被其它氨基酸取代，以防在复性时形成不必要或不正确的分子内二硫化物桥。
[0098]治疗给药和配方
[0099]本发明提供了一些含有本发明之抗hANGPTL3抗体或其抗原结合片段的治疗组合物以及使用该治疗组合物的治疗方法。本发明之治疗组合物将与适宜的载体、赋形剂以及其它加入配方中以改善转移、递送、耐受性等性质的试剂一起施用。在这本所有药剂化学师都知道的处方集里可以找到许多适宜的配方:雷明登药学大全(Remington’sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.)。这些配方包括，例如粉剂、糊剂、油膏、凝胶、蜡剂、油剂、脂类、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如LIPOFECTIN?)、DNA偶联物、无水吸收性糊剂、水包油或油包水乳剂、乳胶状碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体状凝胶以及含有碳蜡的半固体状混合物。还可参阅Powell etal.Compendium of excipients for parenteral formulations'PDA(1998)J Pharm SciTechnoI52:238-31I。
[0100]其剂量可根据即将受药的受试者的年龄和体形大小、目标疾病、治疗目的、病症、给药途径等因素而改变。当本发明之抗体用于治疗与ANGPTL3直接或间接相关的各种病症和疾病，包括高胆固醇血症、与LDL和载脂蛋白B相关的疾病，以及脂质代谢疾病等疾病时，对一名成年患者而言，按照约0.01至约20mg/kg体重，较佳的是按照约0.02至7、约0.03至约5，或约0.05至约3mg/kg体重的单一剂量，以静脉或皮下输入本发明之抗体是有利的。取决于病症的严重程度，治疗的频率和持续时间可以调整。在某些实施方案中，本发明之抗体或其抗原结合片段可作为一种初始剂量施用，其剂量为至少约0.1mg至约800mg、约I至约500mg、约5至约300mg、或约10至约200mg、至约lOOmg、或至约50mg。在某些实施方案中，在初始剂量之后可随后给予第二剂或多剂该抗体或其抗原结合片段，其剂量与初始剂量大致相同或较少，其中该随后的剂量可相隔至少I天至3天；至少一星期；至少2星期；至少3星期；至少4星期；至少5星期；至少6星期；至少7星期；至少8星期；至少9星期；至少10星期；至少12星期；或至少14星期。
[0101]各种给药系统是周知的并可用于本发明之医药组合物的给药，例如封装于脂质体、微粒、微胶囊中、能表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参阅例如Wu etal.(1987) J.Biol.Chem.262:4429-4432)。给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉、皮下、经鼻、硬膜外以及经口给药。该组合物可经由任何方便的途径给药，例如，输注或快速注射，经上皮或粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并可与其它生物活性剂一起给药。给药方式可为全身性或局部性。
[0102]该医药组合物也可以囊泡尤其是脂质体形式给药(参阅Langerl990Science249:1527-1533;Treat et al.(1989)in Liposomes in the Therapy of Infectious Diseaseand Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(eds.), Liss, New York, pp.353-365;Lopez-Berestein, ibid.，pp.317-327 ;一般参阅同上)。
[0103]在某些情况下，该医药组合物可用一种控制释放系统给药。在一个实施方案中，可使用一个泵(参阅 Langer,如上所述；Sefton (1987) CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方案中，可采用聚合物材料；参阅Medical Applications of ControlledRelease, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974) ? 在又一个实施方案中，可将一种控制释放系统置于该组合物目标的附近，从而只需要使用全身性剂量的一部分(参阅例如，Goodson, in Medical Applications of Controlled Release,出处同上，vol.2, pp.115-138，1984)。
[0104]注射用制剂可包括静脉注射、皮下、皮内和肌内注射、滴注输液等剂型。这些注射用制剂可以公知的方法制备。例如，可以将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在通常用于注射的无菌水性介质或油性介质中，以此方式制备该注射用制剂。作为注射用的水性介质包括，例如生理盐水、含葡萄糖和其它助剂的等渗溶液等，可结合使用适当的增溶剂，如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HC0-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(5 0摩尔)加合物)]等。作为油性介质，可采用例如芝麻油、豆油等，可结合使用增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。如此制备的注射液最好是装入一种适当的安瓿瓶中。本发明之医药组合物可用标准的针头和注射器经皮下或静脉注射。此外，对于皮下给药，一种笔型给药装置可方便地用于本发明之医药组合物的给药。这种笔型给药装置可以是重复使用型或一次性使用型。可重复使用的笔型给药装置一般采用一种可更换的含医药组合物的药筒。一旦药筒内所有医药组合物均已输出，药筒变空，则可方便地丢弃空药筒，并用一个含医药组合物的新药筒替换。然后，该笔型给药装置即可重复使用。在一次性使用的笔型给药装置中，没有可更换的药筒。而是，该一次性使用的笔型给药装置具有一个预先灌满医药组合物的贮液器。一旦该贮液器内医药组合物用完，整个装置则被丢弃。
[0105]许多可重复使用的笔型和自动注射给药装置已用于本发明之医药组合物的皮下给药。其实例包括但当然不限于AUTOPEN? (Owen Mumford, Inc.,Woodstock, UK)>DISETRONIC? 笔(Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland)、HUMALOGMIX75/25? 笔、HUMALOG? 笔、HUMALIN70/30? 笔(Eli Lilly and C0., Indianapolis, IN)、NOVOPENtmI, II 和 III 型(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR? (NovoNordisk, Copenhagen, Denmark)> BD? 笔(Becton Dickinson, Franklin Lakes,NJ)、OPTIPEN?、OPTIPEN PRO?、OPTIPEN STARLET?,以及 OPTICLIK? (sanof1-aventis，Frankfurt, Germany),此处仅举几例。用于本发明之医药组合物皮下给药的一次性使用的笔型给药装置的实例包括但当然不限于S0L0STAR?笔(sanof1-aventis)，FLEXPEN? (NovoNordisk)，以及 KWIKPEN? (Eli Lilly)。
[0106]有利的是，上述口服或注射用医药组合物是制备成单位剂量的剂型，以容纳一定剂量的活性成分。这种单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。单位剂量中的上述抗体含量一般为每剂约0.1至约SOOmg ;尤其是在注射剂型中，上述抗体含量为约I至约500mg、约5至300mg、约8至200mg ;在其他剂型中抗体含量为约10至IOOmg0
[0107]联合治疗
[0108]通过与一种或多种其它治疗剂结合，施用一种本发明的hANGPTL3抗体或其片段，本发明进一步提供了一些治疗与hANGPTL3直接或间接相关的疾病或失调的治疗方法。其它治疗剂可以是一种或多种与本发明之一种或多种抗体或其片段有利地结合的任何药剂，包括HMG-CoA还原酶抑制剂,例如西利维司汀(cerovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastin)、瑞舒伐它汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)等；烟酸；各种贝特类药物，如非诺贝特(fenofib`rate)、苯扎贝特(bezafibrate)、环丙贝特(ciprofibrate)、氯贝丁酯(clofibrate)、吉非贝齐(gemfibrozil)等；LXR转录因子活化剂等。此外,本发明之hANGPTL3抗体或其片段，可以与其它ANGPTL3抑制剂以及其它分子的抑制剂一起施用，如ANGPTL4、ANGPTL5、ANGPTL6以及前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (PCSK9)，它们参与脂质代谢，尤其是胆固醇和/或甘油三酯的动态平衡。这些分子的抑制剂包括与这些分子特异性结合并阻断其活性的小分子和抗体(参阅，例如U.S.2010/0166768A1公开的抗PCSK9抗体)。
[0109]此外，所述其它治疗剂可以是一种或多种抗癌剂，如化疗剂、抗血管生成剂、生长抑制剂、细胞毒剂、凋亡剂，以及本领域内众所周知的治疗癌症或其它增生性疾病或失调的其它治疗剂。抗癌剂的实例包括但不限于抗有丝分裂剂，如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇等；基于钼的化疗化合物、如顺钼、卡钼、异丙钼、奥沙利钼(oxaliplatin)等；或其它传统细胞毒性剂、如5_氟尿嘧卩定、卡培他滨(03口6(3；^313；[116)、伊立替康(；[1'；[11(^60311)、甲酰四氢叶酸钙(leucovorin)、吉西他滨(gemcitabine)等，以及抗血管生成剂,包括血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂，如抗VEGF抗体,如贝伐单抗(bevacizumab, Genentech的AVASTIN?)和基于受体的VEGF阻断剂，如美国专利7，070，959所述的“VEGF抑制剂”、δ -样配体4(D114)拮抗剂，如美国专利申请公开书2008/0181899所述的抗D114抗体，以及含有D114的胞外域的融合蛋白，如美国专利申请公开书2008/0107648中所述的D114_Fc。受体酪氨酸激酶和/或血管生成的抑制剂，包括索拉非尼(sorafenib，Bayer医药公司的NEXAVAR?)、舒尼替尼(sunitinib, Pfizer 的 SUTEMT?.)、帕唑帕尼(pazopanib, GlaxoSmithKline的 V0TRIENT?)、西地尼布(toceranib, Pfizer 的 PALLADIA?)、凡德他尼(vandetanib,AstraZeneca 的 ZACTIMA?)、西地尼布(cediranib, AstraZeneca 的 RECENTIN? )、瑞戈非尼(regorafenib, Bayer 的 BAY73-4506)、阿西替尼(axitinib, Pfizer 的 Α?υ?3736)、来他替尼(lestaurtinib, Cephalon 的 CEP-701 )、厄洛替尼(erlotinib, Genentech 的TARCEVA?)、吉非替尼(gefitinib, AstraZeneca 的 IRESSA?)、BIBW2992 (Boehringer Ingelheim 的TOVOK?)、拉帕替尼(lapatinib, GlaxoSmithKline 的 TYKERB?)、来那替尼(neratinib，Wyeth/Pfizer的HK1-272)等，以及药学上可接受的盐、酸或上述任何的衍生物。此外，其它治疗剂，如止痛药、抗炎药，包括非类固醇抗炎药(NSAIDS)jn Cox-2抑制剂等，也可以与本发明的hANGPTL3抗体或其片段一起施用，以便改善和/或减轻伴随潜在癌症/肿瘤的症状。 [0110]本发明的hANGPTL3抗体或其片段以及上述其它治疗剂可以一起施用或分别施用。在使用单独剂型的制剂时，本发明的抗体或其片段以及上述其它治疗剂可以一起施用，或以错开的时间单独施用，即以适当的顺序先后施用。
[0111]抗体的诊断用途
[0112]本发明之抗ANGPTL3抗体也可用于检测和/或测量样品中的ANGPTL3，例如用于诊断目的。例如，抗ANGPTL3抗体或其片段可用于诊断其特征为ANGPTL3异常表达(例如过度表达、表达不足、缺乏表达等)的症状或疾病。用于ANGPTL3的示范性诊断分析可包括，例如用一种本发明的抗ANGPTL3Ab与采自一名患者的样品接触，其中该抗ANGPTL3抗体用一种可检测的标记或报告分子标记，或用于从患者的样品中选择性地捕获和分离ANGPTL3蛋白。或者，在诊断应用中也可以将一种未标记的抗ANGPTL3抗体与本身具有可检测标记的第二种抗体结合使用。该可检测标记或报告基因分子可以是一种放射性同位素，如3h、14C、32P、35S、131I或125I ;—种荧光或化学发光基团，如异硫氰酸荧光素，或罗丹明；或一种酶如碱性磷酸酶、β_半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶，或荧光素酶。可用于检测或测量样品中ANGPTL3的测定法包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)，以及荧光激活细胞分选术(FACS)等。
实施例
[0113]举出以下实施例是为了向本发明所属【技术领域】的一般专业人员就如何利用本发明之方法和组合物提供一个完整的公开和说明，并非是为了限制发明人视为其发明的范围。业已作出许多努力以确保所用数字的准确性，但也应考虑到某些实验误差和偏差。除非另有说明，分子量是指平均分子量，温度是指摄氏度，压力是指大气压或接近大气压。
[0114]实施例1:抗人ANGPTL3的人抗体的产生
[0115]将VEL0CIMMUNE?小鼠用人ANGPTL3免疫，并以抗原特异免疫测定法用这些小鼠的血清以监测抗原免疫反应。从显示抗ANGPTL3抗体滴度升高的免疫小鼠的脾脏收获表达抗ANGPTL3抗体的B细胞,并与小鼠骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。使用如下所述的分析法筛选该杂交瘤以鉴定表达hANGPTL3特异性抗体的细胞系。这些分析法鉴定了几种产生嵌合抗hANGPTL3抗体如H1M896N的细胞系。
[0116]如美国专利2007/0280945A1所述，人hANGPTL3特异性抗体还可从经抗原免疫的B细胞直接分离而不与骨髓瘤细胞融合。重链和轻链可变区被克隆，以产生IgG4同型的完全人源化抗 hANGPTL3 抗体，被称为 H4H1248P、H4H1250P、H4H1263S、H4H1268S、H4H1276S、H4H1279P、H4H1282P、H4H1292P、H4H1295P 及 H4H1296P。稳定的表达抗体的重组 CHO 细胞
系得以建立。
[0117]实施例2:可变基因利用分析
[0118]为了分析所产生抗体的结构，对编码抗体可变区的核酸进行了克隆和测序。从核酸序列和预测的抗体氨基酸序列出发，为每个重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)抗体链鉴定了基因的用途。表1显示了针对某些本发明抗体的基因用途。
[0119]表1
【权利要求】
1.一种分离的人抗体或其抗原结合片段，其与序列号为161的人血管生成素样蛋白3(hANGPTL3)特异性结合，并中和、降低或干扰hANGPTL3的至少一种活性。
2.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征为该抗体或其片段与位于161号序列的第17至209残基的N-端螺旋卷曲区内的一个表位结合。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其片段，其特征为该抗体或其片段不与序列号为170的ANGPTL3肽结合。
4.如权利要求1至3中任何一项所述的抗体或其片段，其特征为该表位位于161号序列的 17 至 200、17 至 100、17 至 70、17 至 65、17 至 60、17 至 57、17 至 50、40 至 200、40 至100,40 至 70、50 至 200、50 至 100、50 至 70、58 至 200、58 至 100、58 至 70、58 至 68、或 61至66残基内。
5.如权利要求1至4中任何一项所述的抗体或其片段，其特征为该抗体或其片段是一种嵌合的或完全人源化抗体或抗体片段。
6.如权利要求1至5中任何一项所述的抗体或其片段，其包含一个选自下列一组序列的重链可变区(HCVR):序列2、18、34、50、66、82、98、114、130、146和180 ;及/或一个选自下列一组序列的轻链可变区(LCVR):序列 10、26、42、58、74、90、106、122、138、154 和 188。
7.如权利要求6所述的抗体或其片段，其特征为该抗体或其片段包含选自下列一组序列对的 HCVR 和 LCVR 序列对(HCVR 和 LCVR):序列对 2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154 和 180/188。
8.如权利要求1至5中任何一项所述的抗体或其片段，其特征为该抗体或其片段在重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)序列对(HCVR/LCVR)中包含重链互补决定区(⑶R)序列HCDRl、HCDR2和HCDR3、以及轻链CDR序列LCDRl、LCDR2和LCDR3，该序列对选自下列一组序列对:序列对 2/1 0、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154 和 180/188。
9.如权利要求8所述的抗体或其片段，其特征为该HCDR1/HCDR2/HCDR3序列组合选自下列一组序列组合:序列组合 4/6/8、20/22/24、36/38/40、52/54/56、68/70/72、84/86/88、100/102/104、116/118/120、132/134/136、148/150/152 和 182/184/186 ;及 / 或该 LCDRl/LCDR2/LCDR3序列组合选自下列一组序列组合:序列组合12/14/16、28/30/32、44/46/48、60/62/64、76/78/80、92/94/96、108/110/112、124/126/128、140/142/144、156/158/160 和190/192/194。
10.如权利要求8或9所述的抗体或其片段，其特征为该抗体或其片段包含选自下列一组序列组合的HCDR1/HCDR2/HCDR3/IXDR1/IXDR2/IXDR3序列组合:序列组合 4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、84/86/88/92/94/96、100/102/104/108/1 10/1 12、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160 和182/184/186/190/192/194。
11.一种抗体或其抗原结合片段，在与hANGPTL3结合时，其与包含重链和轻链互补决定区(CDR)序列组合的抗体或其抗原结合片段竞争、或结合hANGPTL3上的同一表位，该序列组合选自下列一组序列组合:序列组合4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48,52/54/56/60/62/64,68/70/72/76/78/80,84/86/88/92/94/96,100/102/104/108/110/112、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160 和 182/184/186/190/192/194。
12.如权利要求1至11中任何一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征为该抗体或其抗原结合片段与猕猴ANGPTL3交叉反应。
13.如权利要求1至12中任何一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征为该抗体或其抗原结合片段与小鼠或大鼠ANGPTL3交叉反应。
14.如权利要求1至13中任何一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征为该抗体或其抗原结合片段与猕猴ANGPTL3、小鼠ANGPTL3和大鼠ANGPTL3中任何一种交叉反应。
15.如权利要求1至14中任何一项所述的抗体或片段，其特征为该抗体或片段是一种单链抗体、一种Fab或一种F(ab’)2。
16.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至15中任何一项所述之抗体或其片段。
17.—种包含如权利要求16所述的核酸分子的表达载体。
18.—种包含如权利要求17所述表达载体的分离的宿主细胞。
19.一种生产抗hANGPTL3抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许生产该抗体或其片段的条件下，培养如权利要求18所述的宿主细胞，以及回收如此生产的抗体或其片段。
20.一种医药组合物，其含有如权利要求1至15中任何一项所述之一种或多种抗体或其片段以及一种药学上可接受的载体。
21.如权利要求20所述之医药组合物，其特征为该抗体或其片段包含序列号为68/70/72/76/78/80的重链和轻链互补决定区(⑶R)序列组合，或含有序列号为66/74的重链可变区和轻链可变区HCVR/LCVR对。
22.如权利要求20所述之医药组合物，其包含选自下列重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)序列对(HCVR/LCVR)的抗体或其片段的组合:
(i)序列对82/90 和 180/188 ；
(ii)序列对114/122 和 180/188 ； (iii)序列对82/90和18/26;以及 (iv)序列对114/122 和 18/26。
23.如权利要求20至22中任何一项所述之医药组合物，其进一步包含一种或多种其它治疗剂，该治疗剂选自=HMG-CoA还原酶抑制剂、胆固醇吸收或胆汁酸再吸收抑制剂，或其两者；增加脂蛋白分解代谢的药剂；减少非致命心脏病发作次数的药剂；以及LXR转录因子活化剂。
24.如权利要求20至22中任何一项所述之医药组合物，其进一步包含一种或多种选自他汀类药物、烟酸、贝特类药物(fibrates)、抗hANGPTL4抗体和抗PCSK9抗体的其它治疗剂。
25.一种预防或治疗通过降低或抑制ANGPTL3活性可得以防止、减轻、改善或抑制的疾病或失调的方法，其包括给需要治疗的受试者施用治疗有效量的如权利要求20至24中任何一项所述之医药组合物。
26.一种预防或治疗通过降低或抑制ANGPTL3活性可得以防止、减轻、改善或抑制的疾病或失调的方法，其包括给需要治疗的受试者施用治疗有效量的如权利要求1至15中任何一项所述之一种或多种抗体或其片段。
27.如权利要求26所述之方法，其进一步包括给受试者施用一种或多种其它治疗剂，该治疗剂选自=HMG-CoA还原酶抑制剂；胆固醇吸收或胆汁酸再吸收抑制剂，或其两者；增加脂蛋白分解代谢的药剂；减少非致命心脏病发作次数的药剂；以及LXR转录因子活化剂。
28.如权利要求26所述之方法，其进一步包括给受试者施用一种或多种选自他汀类药物、烟酸、贝特类药物、抗hANGPTL4抗体和抗PCSK9抗体的其它治疗剂。
29.如权利要求27或28所述之方法，其特征为一种或多种抗体或其片段和一种或多种其它治疗剂是同时或先后施用的。
30.如权利要求25至29中任何一项所述之方法，其特征为所述疾病或失调选自高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症、致动脉粥样硬化的血脂异常、心血管疾病或失调、急性胰腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
31.一个在需要治疗的受试者之循环系统中提高hANGPTL3清除率的方法，该方法包括给受试者施用至少两种在与hANGPTL3的结合过程中不相互竞争且不阻断hANGPTL3的至少一种活性的抗体或其抗原结合片段。
32.如权利要求31所述之方法，其特征为所述hANGPTL3的一种活性是抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)活性。
33.如权利要求31或32所述之方法，其特征为该两种抗体选自下列的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)序列对(HCVR/LCVR):
(i)序列对82/90 和 180/188 ；
(ii)序列对82/90 和 18/26 ； (iii)序列对114/122 和 180/188;以及 (iv)序列对114/122 和 18/26。
34.如权利要求20至24中任何一项所述之医药组合物，用于治疗通过降低或抑制ANGPTL3活性可得以防止、减轻、改善或抑制的疾病或失调的方法。
35.如权利要求34所述之医药組合物，其特征为所述疾病或失调选自高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症、致动脉粥样硬化的血脂异常、心血管疾病或失调、急性胰腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
【文档编号】C07K16/22GK103732624SQ201280038908
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年6月14日 优先权日:2011年6月17日
【发明者】M·W·斯利曼, V·谷萨洛娃, A·J·墨菲 申请人:瑞泽恩制药公司