蛋白质合成试剂盒以及使用自动纯化设备表达和纯化蛋白质的方法
【专利摘要】本发明提供了蛋白质合成方法。根据本发明的蛋白质合成方法使用自动生物材料纯化装置，所述自动生物材料纯化装置包含：孔板试剂盒、加热部件和磁场施加部件，使得与通过传统细胞培养表达／纯化蛋白质之现有方法获得的目标蛋白相比，可以更迅速和简单地获得多种目标蛋白，并且由于反应孔间没有偏差所以可以获得对同一蛋白的可重复合成效率。
【专利说明】蛋白质合成试剂盒以及使用自动纯化设备表达和纯化蛋白质的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于产生蛋白质的方法，并且更具体地，涉及这样的用于产生蛋白质的方法，其包括在使用自动生物材料纯化装置的自动系统中同时进行目标蛋白的表达和纯化，该自动生物材料纯化装置包含:加热部件和磁场施加部件。
【背景技术】
[0002]作为用于表达重组蛋白质的方法，已经被普遍使用的方法是，主要使用细胞例如大肠杆菌(Escherichia coli)和酵母,将重组蛋白质表达载体转化入细胞,并培养该经转化细胞以表达蛋白质。上述方法需要选择稳定地表达重组蛋白质的菌株的过程，并且难以在细胞中表达具有毒性的蛋白质，使得至少花费数天至数月来获得一种蛋白质。
[0003]近来，不使用细胞而在试管中合成蛋白质的无细胞蛋白质表达方法受到了关注，并且已经开发了多种与其相关的产品。该无细胞蛋白质表达方法为这样的蛋白质表达系统，其通过添加能够表达蛋白质的模板DNA例如表达载体、PCR产物，细胞溶解产物，表达溶液和焦碳酸二乙酯(DEPC)蒸馏的水进入管中并且在适当温度(30°C至40°C )持续适当的时间(I小时至3小时)来进行反应，所述无细胞蛋白质表达方法的优势为能够表达在细胞中有毒性的蛋白质，以及与以上提到的使用细胞表达蛋白质的方法相比可以显著减少所需要的时间。在这里，为了表达蛋白质，需要合适的温度和时间。原因是所有过程期间均应伴随酶的活性，包括在管中从DNA合成RNA和从RNA合成蛋白质，其中上述过程能够在将温度保持在多种酶显示活性的温度(即30°C至40°C )的情况下进行。
[0004]因为在已表达了重组蛋白质的样品中混合了多种蛋白质，所以为了从样品中容易地纯化经表达的重组蛋白质，该经表达的蛋白质应当具有与特异性物质的亲和力。最近，主要使用了通过表达偶联状态的重组蛋白质与组氨酸并且利用组氨酸和金属离子(镍离子、钴离子等)的亲和性的蛋白质纯化方法，并且与其相关的多种产品已经开始销售。在这些方法中，主要使用了利用磁颗粒的方法，其中磁颗粒表面的金属离子与目标蛋白的组氨酸偶联，使得只有目标蛋白能够从多种蛋白质中被提取出来。
[0005]然而，根据相关领域的现有技术，可能无法实现高产率和高纯度纯化，并且因非有效的细胞培养物而难以控制蛋白质的复杂表达，使得仍没有解决同一蛋白质的可重复产生这一基本问题。
[0006]因此，需要能够实现高产率和高纯度纯化并且对同一蛋白质具有可重复合成效率的蛋白质生产方法。
[0007]技术问题
[0008]本发明人在对有效和容易地`控制蛋白质表达之表达系统以及使用其生物合成蛋白质的方法的持续研究中发现了一种蛋白质合成方法，从而完成了本发明，所述蛋白质合成方法包括同时进行目标蛋白的表达和提取从而与相关领域相比更有效和容易进行。
[0009]本发明的一个目的是提供用于合成蛋白质的方法，其包括在使用自动生物材料纯化装置的自动系统中同时进行目标蛋白的表达和提取，该自动生物材料纯化装置包含:加热部件和磁场施加部件。
[0010]另外，本发明的一个目的是提供蛋白质合成试剂盒，其通过将表达无细胞蛋白质的方法与使用偶联亲和标签的磁颗粒的蛋白质纯化方法相组合来同时进行目标蛋白的表达和纯化。
[0011]技术方案
[0012]为了实现本发明的目的，提供了生产蛋白质的方法，其能够使用自动生物材料纯化装置在6小时内合成和产生多至16种目标蛋白，所述自动生物材料纯化装置包含加热部件和磁场施加部件，并且通过将表达无细胞蛋白质的方法与使用偶联亲和标签的磁颗粒的蛋白质纯化方法相组合而施用。
[0013]下文将详细描述本发明。
[0014]在一个一般性方面中，用于生产蛋白质的方法包括:
[0015](1)制备用于无细胞蛋白质合成的模板，
[0016](2)将模板添加至无细胞蛋白质表达溶液以表达蛋白质，
[0017](3)将偶联亲和标签的磁颗粒添加至经表达的蛋白质以将目标蛋白连接至所述磁颗粒，以及
[0018](4)从所述磁颗粒分离连接的目标蛋白，
[0019]其中在使用包含加热部件和磁场施加部件之自动生物材料纯化装置的自动系统中同时进行目标蛋白的表达和纯化。
[0020]可以使用第二多孔板试剂盒420'和第一多孔板试剂盒420，该第二多孔板试剂盒420'包含:
[0021](a)用于稀释无细胞蛋白质合成的模板的溶液，
[0022](b)用于从模板表达目标蛋白的无细胞蛋白质表达溶液，以及
[0023]第一多孔板试剂盒420包含:(C)用于将目标蛋白连接至磁颗粒的磁颗粒溶液，
[0024](d)用于目标蛋白的洗脱溶液，
[0025](e)用于将目标蛋白与磁颗粒偶联的磁颗粒反应溶液和洗涤溶液。
[0026]在另--般性方面中，用于生产蛋白质的方法包括:
[0027](I)制备用于无细胞蛋白质合成的模板，
[0028](2)将模板添加至无细胞蛋白质表达溶液以表达蛋白质，
[0029](3)将偶联亲和标签的磁颗粒添加至经表达的蛋白质以将目标蛋白连接至磁颗粒，以及
[0030](4)从磁颗粒分离连接的目标蛋白，
[0031]其中使用包含加热部件和磁场施加部件的自动生物材料纯化装置，
[0032]使用第二多孔板试剂盒42(V和第一多孔板试剂盒420，该第二多孔板试剂盒包含:(a)用于稀释无细胞蛋白质合成的模板的溶液，(b)用于从模板表达目标蛋白的无细胞蛋白质表达溶液，以及第一多孔板试剂盒包含(C)用于连接目标蛋白的磁颗粒溶液，(d)用于目标蛋白的洗脱溶液，(e)用于将目标蛋白与磁颗粒偶联的磁颗粒反应溶液和洗涤溶液，并且在自动系统中同时进行目标蛋白的表达和纯化。
[0033]无细胞蛋白质合成的模板可以是具有环状形式或线性形式的脱氧核糖核酸(DNA)。优选地，可以使用质粒DNA作为具有环状形式的DNA，可以使用PCR产物作为具有线性形式的DNA，但是本发明不限于此。
[0034]具体而言，可以通过以下来产生具有线性形式的DNA:使用制备的扩增目标基因并提供5'和3'端的重叠序列的引物组扩增样品中的目标基因以获得初始反应物，和PCR预混物(premix),以及
[0035]使用含有以下组合物A的PCR预混物(下文中称为“PCR试剂盒”)来再次扩增获得的初始反应物，
[0036][组合物A]
[0037](a)定位在目标基因的5'和3'两端的上游盒组和下游盒组，和
[0038](b)在所述盒组的5'和3'两端具有重叠序列的第二引物组。
[0039]PCR预混物是含有扩增反应所需之混合组分的混合物，其可以含有脱氧核苷酸三磷酸混合物(dNTP混合物)和缓冲剂，以及热稳定DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。此外，可以以液体或干燥形式制备PCR预混物。
[0040]在本发明中，用于产生具有线性形式的DNA的PCR试剂盒可以含有PCR预混物，0.1ng / μ I至0.5ng / μ I的用于在目标基因的5'和3'两端编码亲和标签的盒组和各0.1pmole / μ I至1.0pmole / μ I的在盒组的5'和3'端具有重叠序列的第二正向和反向引物。
[0041]在本发明中，术 语“盒”总体是指具有双链的寡核苷酸，其被短地合成以人工连接至DNA产物。由于在盒的5'端不具有磷酸基团，由双链组成的盒中仅单链可以连接至基因组 DNA。
[0042]在本发明中，术语“引物”是具有短和自由3'羟基的单链核酸序列，表示形成模板的短核酸序列和互补核酸的碱基对，其功能为核酸模板的链副本的起始点。引物可以在聚合反应试剂(即DNA聚合酶)和四种不同dNTP的存在下在恰当的缓冲剂和温度下起始DNA合成。本发明的PCR试剂盒包含对目标基因的核苷酸序列特异的引物和对盒序列特异的引物。
[0043]在本发明中，自动生物材料纯化装置包含加热部件和磁场施加部件，其可以包含移液器模块100，在移液器模块100上安装有多个可分离的移液器142和142并且将含有目标物质的生物样品移液至每个移液器141和142的每个中；支持移液器模块100的固定体200 ;安装在固定体200上并且垂直移动移液器模块100的移液器模块上下移动部件；水平移动固定体200以水平移动移液器模块100的移液器模块前后移动部件；位于固定体200的下部并且安装有多孔板试剂盒420'和420的基板400，多孔板试剂盒420'和420具有配置彼此相邻的两列孔的多个单元孔；磁场施加部件700，其位于多孔板试剂盒420'和420的特定单元孔的下部以对多孔板试剂盒42(V和420的特定单元孔施加磁场和从其移除磁场；以及加热多孔板试剂盒420'和420的特定单元孔的加热部件810。
[0044]此外，在根据本发明的包含加热部件和磁场施加部件的自动生物材料纯化装置中，其上安装磁体的磁安装部件和用于加热的加热部件垂直移动，使得可以在施加或移除磁场时控制温度，以及作为在磁安装部件中形成的多个列的孔插入槽覆盖多孔板试剂盒的单元孔下部，使得更好地提高反应效率。
[0045]具体而言，磁场施加部件700可以包含其上安装有磁体711的磁体安装部件710 ；起吊和放下磁体安装部件710的起吊部件760 ;其中磁体安装部件710具有在其上形成的单元孔插入槽713以插入多孔板试剂盒420'和420之特定单元孔的下部，并且基板400具有单元孔暴露口 400-3，以使得在磁体安装部件710起吊时，多孔板试剂盒42(V和420之特定单元孔的下部插入单元孔插入槽713，多孔板试剂盒420'和420之特定单元孔的下部与其邻近的多孔板试剂盒420'和420之单元孔的下部隔开预定的距离以插入单元孔插入槽713，并且磁体711围绕单元孔插入槽713插入和安装。
[0046]所述方法可以包括:注入步骤S10，将无细胞蛋白质合成的模板注入多孔板试剂盒420'的单元孔。
[0047]第一混合步骤S20，将注入多孔板试剂盒420'的单元孔以稀释模板的DEPC蒸馏水以与注入的模板混合；
[0048]第二混合步骤S30，将无细胞蛋白质表达溶液与第一混合步骤的混合物混合；
[0049]混合物制备步骤S40，通过将第二混合步骤的混合物与细胞破裂液(celldisrupted liquid)混合来制备蛋白质合成反应溶液；
[0050]加热步骤S50，通过使用加热单元720对具有混合物的多孔板试剂盒420'之特定单元孔的下部加热来对在特定单元孔中的蛋白质合成反应溶液施加热，
[0051]磁颗粒反应混合物的制备步骤S70 ;
[0052]蛋白质表达注入步骤S110，将注入多孔板试剂盒420'之单元孔的蛋白质表达注入到制备的磁颗粒反应混合物；
[0053]反应步骤S120，使注入多孔板试剂盒420'之单元孔的蛋白质表达与磁颗粒反应；
[0054]移除步骤S140，通过对含有蛋白质表达的混合物施加磁场来移除除磁颗粒和与磁颗粒偶联之蛋白质之外的混合物；
[0055]洗涤步骤S150，通过注入注入多孔板试剂盒420之单元孔的洗涤溶液来洗涤除来自磁颗粒之目标蛋白之外的杂质；
[0056]移除步骤S170，通过对包含含有混合物之洗涤溶液的混合物施加磁场来从包含含有洗涤溶液之混合物的洗涤溶液中移除除连接目标蛋白的磁颗粒之外的混合物；
[0057]目标蛋白分离步骤S180，通过将注入多孔板试剂盒420的单元孔的用于目标蛋白的洗脱溶液注入从移除步骤获得的混合物中来分离目标蛋白；以及
[0058]含有目标蛋白的溶液的获得步骤S200，通过对混合物施加磁场从含有从磁颗粒分离之目标蛋白的目标蛋白洗脱溶液中获得除磁颗粒之外的含有目标蛋白的溶液。
[0059]具体地，进行注入步骤S10，其使用安装在包含加热部件和磁场施加部件之自动生物材料纯化装置上的多个移液器141和142将无细胞蛋白质合成的模板注入多孔板试剂盒420/的单元孔L，并且在注入步骤SlO之后进行第一混合步骤S20。
[0060]进行第一混合步骤S20，其使用安装在包含加热部件`和磁场施加部件之自动生物材料纯化装置上的多个移液器141和142将注入到多孔板试剂盒420'之单元孔的用于稀释无细胞蛋白质合成的模板的DEPC蒸馏水H与注入到多孔板试剂盒420'之单元孔L的无细胞蛋白质合成的模板相混合，并且在第一混合步骤S20之后进行第二混合步骤S30。
[0061]进行第二混合步骤S30，其使用移液器141和142将注入多孔板试剂盒420'之特定单元孔G的无细胞蛋白质表达溶液与注入到多孔板试剂盒420'之单元孔的注入有与DEPC蒸馏水混合之无细胞蛋白质合成模板的单元孔L相混合，并且在第二混合步骤S30之后进行混合物制备步骤S40。
[0062]进行混合物制备步骤S40，其使用移液器141和142将注入细胞破裂液贮存管442-1的细胞破裂液与注入有与注入多孔板试剂盒420'之单元孔的DEPC蒸馏水混合之无细胞蛋白质合成模板的单元孔L相混合来制备蛋白质合成反应溶液，并且在混合物制备步骤S40之后进行加热步骤S50。
[0063]进行加热步骤S50，其是在通过吊起磁体安装部件710将多孔板试剂盒42(V之特定单元孔L的下部插入单元孔插入槽713的状态下，通过使用加热部件720加热多孔板试剂盒420'之特定单元孔L的下部来对特定单元孔L中的蛋白质合成反应溶液施加热的第一加热步骤，并且在加热步骤S50之后进行第一蛋白质表达注入步骤S60。
[0064]进行第一蛋白质表达注入步骤S60，其使用移液器141和142将在特定单元孔L中的蛋白质合成反应溶液中反应的第一蛋白质表达注入多孔板试剂盒420'的单元孔J，并且在第一蛋白质表达注入步骤S60之后进行磁颗粒反应混合物的制备步骤S70。
[0065]进行磁颗粒反应混合物的制备步骤S70，其使用移液器141和142将注入多孔板试剂盒420之单元孔A的磁颗粒反应溶液与注入多孔板试剂盒420的单元孔F的磁颗粒相混合，并且在磁颗粒反应混合物的制备步骤S70之后，可以进一步依次进行混合磁颗粒之反应溶液的注入步骤S80，第一磁场施加步骤S90以及第一移除步骤S100。
[0066]进行混合磁颗粒之反应溶液的注入步骤S80，其是在磁体安装部件710被放下的状态下，使用移液器141和142将与磁颗粒反应溶液混合的混合物注入多孔板试剂盒420'之特定单元孔L的第二注入步骤，并且在第二注入步骤S80之后进行第一磁场施加步骤S90。
`[0067]进行第一磁场施加步骤S90，其通过吊起磁体安装部件710以将多孔板试剂盒420/之特定单元孔L的下部插入单元孔插入槽713来从磁体安装部件710对多孔板试剂盒420'之特定单元孔的下部施加磁场，并且在第一磁场施加步骤S90之后进行第一移除步骤SlOO。
[0068]进行第一移除步骤S100，其在通过施加至多孔板试剂盒420'之特定单元孔L的下部的磁场将混合了磁颗粒反应溶液的混合物中的磁颗粒和连接至磁颗粒的物质附着至多孔板试剂盒420'之特定单元孔下部的内壁的状态下，使用移液器141和142从混合了磁颗粒反应溶液的混合物移除除了磁颗粒和连接至磁颗粒的物质之外的混合物，并且在第一移除步骤SlOO之后进行蛋白质表达注入步骤S110。
[0069]进行蛋白质表达注入步骤S110，其使用移液器141和142将注入多孔板试剂盒420'之单元孔J的第一蛋白质表达注入多孔板试剂盒420'之单元孔L，并且在第二蛋白质表达注入步骤SllO之后进行反应步骤S120。
[0070]进行反应步骤S120，其使用移液器141和142使注入多孔板试剂盒420'之特定单元孔L的第二蛋白质表达与注入多孔板试剂盒420，之特定单元孔L的磁颗粒反应，并且在反应步骤S120之后可以进一步进行第二磁场施加步骤S130。
[0071]进行进一步进行的第二磁场施加步骤S130，其通过吊起磁体安装部件710以将多孔板试剂盒420'之特定单元孔L的下部插入单元孔插入槽713来从磁体安装部件710对多孔板试剂盒420'之特定单元孔L的下部施加磁场，并且在第二磁场施加步骤S130之后进行移除步骤S140。
[0072]进行移除步骤S140，其是第二移除步骤，其在通过施加至多孔板试剂盒420'之特定单元孔L的下部的磁场将混合有第二蛋白质表达的混合物中连接了蛋白质的磁颗粒附着至多孔板试剂盒420，之特定单元孔L下部的内壁的状态下，使用移液器141和142移除除磁颗粒和偶联至磁颗粒的蛋白质之外的混合物，并且在第二移除步骤S140之后进行洗涤步骤S150。
[0073]进行洗涤步骤S150，其在磁体安装部件710被放下的状态下，使用移液器141和142通过将注入多孔板试剂盒420的单元孔的洗涤溶液注入多孔板试剂盒420'之特定单元孔L来分离除了来自磁颗粒的目标蛋白之外的杂质，并且在洗涤步骤S150之后进行移除步骤S170。
[0074]进行移除步骤S170，其是第三移除步骤，其在通过施加至多孔板试剂盒420'之特定单元孔的下部的磁场将混合有洗涤溶液的混合物中连接了目标蛋白质的磁颗粒附着至多孔板试剂盒420'之特定单元孔下部的内壁的状态下，使用移液器141和142移除混合了洗涤溶液的混合物中除连接了目标蛋白质的磁颗粒之外的混合物，并且在移除步骤S170之后进行目标蛋白质分离步骤S180。
[0075]洗涤除了目标蛋白之外的杂质的洗涤步骤S150以及移除除了连接至目标蛋白的磁颗粒之外的混合物的移除步骤S170可以顺序地进行一次或更多次，并且在洗涤步骤150之后，可以进一步进行第三磁场施加步骤S160。
[0076]进一步进行的第三磁场施加步骤S160通过吊起磁体安装部件710以将多孔板试剂盒420'之特定单元孔L的下部插入单元孔插入槽713来从磁体安装部件710对多孔板试剂盒420'之特定单元孔L的下部施加磁场。
[0077]移除步骤S170之后进行的目标蛋白分离步骤S180在磁体安装部件710被放下的状态下，通过使用移液器1 41和142将注入多孔板试剂盒420之单元孔的目标蛋白洗脱溶液注入多孔板试剂盒420，之特定单元孔L来分离目标蛋白，并且在目标蛋白分离步骤S180之后，可以进一步进行第四磁场施加步骤S190。
[0078]进一步进行的第四磁场施加步骤S190通过吊起磁体安装部件710以将多孔板试剂盒420'之特定单元孔L的下部插入单元孔插入槽713来从磁体安装部件710对多孔板试剂盒420'之特定单元孔的下部施加磁场，并且在第四磁场施加步骤S190之后进行含有目标蛋白之溶液的获得步骤S200。
[0079]含有目标蛋白之溶液的获得步骤S200可以获得含有目标蛋白的溶液，其是除了蛋白质洗脱溶液中的磁颗粒之外含有通过以下获得目标蛋白的混合物:在通过施加至多孔板试剂盒420,之特定单元孔L的下部的磁场将含有从磁颗粒分离的目标蛋白的目标蛋白洗脱溶液中的磁颗粒附着至多孔板试剂盒420'之特定单元孔L下部的内壁的状态下，使用移液器141和142从磁颗粒分离，以产生目标蛋白质。
[0080]在本发明中，含有目标蛋白之溶液的获得步骤S200可以包括使用移液器141和142将含有目标蛋白的溶液注入安装在基板400上的蛋白质贮存管442-3。
[0081]在本发明中，磁颗粒可以是与目标蛋白的亲和标签偶联的磁颗粒，以及更特别地，可以包含金属离子，优选地可以是与镍离子偶联的磁颗粒。
[0082]根据本发明，通过将使用磁颗粒纯化蛋白质的方法和表达无细胞蛋白质的方法相组合，并且将相组合的方法应用到包含加热部件和磁场施加部件的自动生物材料纯化装置，可以在6个小时内合成并生产多至16种目标蛋白。
[0083]有益效果
[0084]根据本发明的用于生产蛋白质的方法使用包含孔板试剂盒；加热部件和磁场施加部件的自动生物材料纯化装置，从而使得与通过传统细胞培养使用现有的蛋白质表达/纯化方法获得的目标蛋白质相比，可以更迅速且简单地获得多种目标蛋白质，并且由于反应孔之间没有偏差从而可以获得对同一蛋白质的可重复合成效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0085]图1示出根据本发明的包含加热部件和磁施加部件的自动生物材料纯化装置的基板插入外壳(casing)的状态；
[0086]图2示意性示出了根据本发明的包含加热部件和磁施加部件的自动生物材料纯化装置的移液器模块；
[0087]图3是根据本发明的包含加热部件和磁施加部件的自动生物材料纯化装置的移液器模块主要部分的截面；
[0088]图4是从根据本发明的包含加热部件和磁施加部件的自动生物材料纯化装置部分移除外壳的情况下的透视图；
[0089]图5示出根据 本发明的包含加热部件和磁施加部件的自动生物材料纯化装置之基板被使用的状态；
[0090]图6是根据本发明的包含加热部件和磁施加部件的自动生物材料纯化装置的磁体安装部件和起吊部件的透视图；
[0091]图7示出使用根据本发明的包含加热部件和磁施加部件的自动生物材料纯化装置制备生产蛋白质的模板PCR产物的图；
[0092]图8是使用根据本发明的包含加热部件和磁施加部件的自动生物材料纯化装置产生蛋白质的方法的图；
[0093]图9是使用根据本发明的包含加热部件和磁施加部件的自动生物材料纯化装置的实验的图；
[0094]图10示出在根据本发明的包含加热部件和磁施加部件的自动生物材料纯化装置中使用的第一多孔板试剂盒(A)和第二多孔板试剂盒(B)。
[0095](列G:具有无细胞蛋白质表达溶液的孔区域，列H:具有DEPC稀释水的孔区域，列L:具有无细胞蛋白质合成的模板的孔区域，列A至D:具有磁颗粒反应溶液和用于将目标蛋白与磁颗粒偶联的洗涤溶液的孔区域，列E:具有目标蛋白洗脱的孔区域，和列F:具有用于连接目标蛋白之磁颗粒的孔区域)
[0096]图11示出通过使用根据本发明产生蛋白质之方法产生的目标蛋白(GFP)的SDS-PAGE凝胶结果；并且
[0097](M:Bioneer Corporation 的 AccuLadder? 蛋白质大小标记(低)，E:表达的 GFP样品，P:经纯化的GFP样品，I至16:在每个单位孔中反应的GFP合成蛋白质)
[0098]图12示出通过使用根据本发明产生蛋白质之方法产生的多种模板DNA的目标蛋白的SDS-PAGE凝胶结果。[0099]主要元件的详细描述
[0100]100:移液器模块110:注射器栓支架(SYRINGE PIN HOLDER)
[0101]112:信息指引(INFORMATION ⑶IDE) 120:注射器栓
[0102]130:注射器栓引导模块131:注射器栓引导口
[0103]133:移液器安装部件 133-1:连通口(COMMUNICATING HOLE)
[0104]133-2:连接环(ADHESION RING) 134:移液器安装部件
[0105]134-1:连通口 134-2:连接环
[0106]141:移液器142:移液器
[0107]150:注射器栓引导模块支持板152:上下移动螺母
[0108]160:引导杆(⑶IDE ROD) 171:注射器栓控制马达支持板
[0109]172:注射器栓控制马达173:注射器栓控制螺杆
[0110]181:上解吸附板(DESORPTION PLATE) 182:解吸附板
[0111]183:连接杆184:伸出杆
[0112]185:弹簧200:固`定的主体
[0113]231:上下移动马达232:上下移动带
[0114]233:上下移动螺杆241:前后移动滑块
[0115]300:外壳310:前后移动支持杆
[0116]311:前后导轨350:门
[0117]320:前后移动马达330:前后移动带
[0118]340:紫外灯360:触屏
[0119]400:基板 401:门把手(D00RN0B)
[0120]420':多孔板(MULTI WELL PLATE)420:多孔板
[0121]430:移液器架440:蛋白质贮存管架
[0122]450:废物盘(WASTE tray) 442-1:细胞破裂液贮存管
[0123]442-3:蛋白质贮存管700:磁场施加部件
[0124]710:磁体安装部件711:磁体
[0125]713:单元孔插入槽720:磁体安装部件支持物
[0126]730:引导杆740:引导模块
[0127]750:拉簧(TENSION SPRING) 760:起吊部件(LIFTING PART)
[0128]761:起吊马达762:第一起吊轴
[0129]763:起吊凸轮(CAM) 764:第二起吊轴
[0130]780:高度传感器781:传感部件
[0131]782:传感靶向部件(SENSING TARGET PART)810:加热部件
[0132]812:加热部件固定板
[0133]最佳模式
[0134]尽管在下文中将会参考以下实施例详细描述本发明，但是公开实施例是用于说明性目的，对于领域的技术人员显而易见的是，可以不受以下实施例的限制的情况下进行修饰和改变。在本发明中的实施例中使用的材料和方法如下。
[0135]<实施例1>模板DNA的制备[0136](I)质粒DNA的制各
[0137]制备用于蛋白质合成的模板DNA-质粒DNA。每个基因通过基因合成方法合成(NBiochem.Biophys.Res.Commun.1998，248，200-203)，随后用限制酶处理，并且克隆入大肠杆菌(E.coli)的表达载体。
[0138]可以使用pBIVT(Bioneer Corporation,韩国)、pIVEX(Roche,德国)、pET(Novagen,德国)、pK7、pQE等作为大肠杆菌的表达载体,但本发明不限于此。
[0139]此外,用于大肠杆菌的表达载体,应当在表达载体中包含亲和标签。在本实施例中，使用了包含组蛋白标签的表达载体，但是本发明不限于此，并且因此表达载体可以包含
另一标签。
[0140]在本发明的实施例中，使用了 CalmL3、RNaseH, DUSP3、CAT、AcGFP、EF_Ts、VF、多聚A 聚合酶、MMLV RTase、BM3 基因。
[0141]更具体地，对于用限制酶处理基因合成物质，向每个管添加I μ I的BamHI (Bioneer Corporation,韩国)> Iul 的 NotI (Bioneer Corporation,韩国)、2μ I 的10 X AccuCut?缓冲剂(Bioneer Corporation,韩国)、10μ I的基因合成物质和6 μ I的灭菌蒸馏水，将它们混合在一起并放置于恒定温度(37°C)下3小时。对于用限制酶处理用于大肠杆菌的表达载体，向每个管添加I P I的BamHI (Bioneer Corporation,韩国)、1 μ I的NotI (Bioneer Corporation,韩国)、2 μ I 的 10 X AccuCut?缓冲剂(Bioneer Corporation,韩国)、10 μ I的用于大肠杆菌的表达载体和6μ I的灭菌蒸馏水，将它们混合在一起并放置于恒定温度(37°C )下3小时。使用Accuprep凝胶提取试剂盒(Bioneer Corporation,韩国)从用各限制酶处理的每个反应物中提取DNA。
[0142]向管中添加5 μ I的2 X快速连接缓冲剂(Promega Corporation,美国)、1 μ I的T4DNA连接酶(Promega Corporation,美国)、3μ I的限制酶处理基因合成物质、I μ I的限制酶处理载体，将它们混合在一起并`放置于恒定温度(16°C )下I小时。随后，将放置于恒定温度的10 μ I反应溶液放入100 μ I的大肠杆菌感受态细胞，将混合物放置于冰上30分钟并在42°C培养90秒，随后再次放置于冰上5分钟。将反应物接种在含有卡那霉素的LB板上并在37°C培养16小时。
[0143]获取白色菌落并在IOml的LB液体培养基中培养16小时之后，随后离心，移除这样获得的上清液并且使用AccuPrep质粒DNA制备试剂盒(AccuPrep plasmid DNA prepkit) (Bioneer Corporation,韩国)从沉淀中提取质粒DNA。通过测序确认提取的DNA是否是通过各基因合成方法合成的基因，并且对于待用于蛋白质合成的DNA，通过相同的方法培养对应的菌落以获得质粒DNA。通过UV分光光度计(Shimazu Corporation,日本)测量浓缩并纯化的质粒DNA，并且证实质粒DNA具有为1.8至2.0的纯度。
[0144](2) PCR产物的制各
[0145]制备用于蛋白质合成的模板DNA-PCR产物。已经开发了使用两步PCR原理的“用于PCR的试剂盒”用于制备PCR产物，并且在图7中显示了制备PCR产物的方法并在下表1中显示了试剂盒组分。
[0146][表1]用于PCR的试剂盒
【权利要求】
1.蛋白质合成方法，所述方法包括: (1)制备无细胞蛋白质合成的模板； (2)将所述模板添加至无细胞蛋白质表达溶液以表达蛋白质； (3)将与亲和标签偶联的磁颗粒添加至所述经表达的蛋白质，以将目标蛋白与所述磁颗粒连接；以及 (4)将所述连接的目标蛋白与所述磁颗粒分离； 其中在使用自动生物材料纯化装置的自动系统中同时进行所述目标蛋白的表达和纯化，所述自动生物材料纯化装置包含:加热部件；和磁场施加部件。
2.权利要求1所述的方法，其中使用第二多孔板试剂盒420'和第一多孔板试剂盒420，所述二多孔板试剂盒420'包含: (a)用于稀释所述无细胞蛋白质合成的模板的溶液； (b)用于从所述模板表达所述目标蛋白的无细胞蛋白质表达溶液；以及 所述第一多孔板试剂盒420包含: (c)用于将所述目标蛋白连接至所述磁颗粒的磁颗粒溶液； (d)用于所述目标蛋白的洗脱溶液，· (e)用于将所述目标蛋白与所述磁颗粒偶联的磁颗粒反应溶液和洗涤溶液。
3.权利要求1所述的方法，其中所述无细胞蛋白质合成的模板是具有环状形式或线性形式的脱氧核糖核酸(DNA)。
4.权利要求3所述的方法，其中通过以下产生所述具有线性形式的DNA:通过使用制备的用于扩增目标基因并提供5'和3'端之重叠序列的引物组在样品中扩增目标基因来获得初始反应物，以及 使用含有以下组合物A的PCR预混物再次扩增所获得的初始反应物， [组合物A] (a)定位在所述目标基因的5'和3'两端的上游盒组和下游盒组，以及 (b)在所述盒组的5'和3'两端具有重叠序列的第二引物组。
5.权利要求4所述的方法，其中所述组合物A含有0.1ng / μ?至0.5ng/ μ?的用于在所述目标基因之5'和3'两端编码亲和标签的盒组，以及各0.1pmole / μ?至1.0pmole / μ I的在所述盒组之Y和:V端具有重叠序列的第二正向引物和第二反向引物。
6.权利要求4所述的方法，其中所述亲和标签是组氨酸。
7.权利要求1所述的方法，其中所述磁颗粒含有金属离子。
8.权利要求7所述的方法，其中所述金属离子是镍离子。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其包括: 注入步骤S10，将所述无细胞蛋白质合成的模板注入多孔板试剂盒420'的单元孔。 第一混合步骤S20，将注入多孔板试剂盒420'的单元孔以稀释模板的DEPC蒸馏水与注入的模板混合； 第二混合步骤S30，将无细胞蛋白质表达溶液与所述第一混合步骤的混合物混合； 混合物制备步骤S40，通过将所述第二混合步骤的混合物与细胞破裂液混合来制备蛋白质合成反应溶液；加热步骤S50，通过使用加热部件720加热具有所述混合物的多孔板试剂盒4201之特定单元孔的下部来对在所述特定单元孔中的蛋白质合成反应溶液施加热， 磁颗粒反应混合物的制备步骤S70 ； 蛋白质表达物注入步骤S110，将注入多孔板试剂盒420'之单元孔的蛋白质表达物注入所制备的磁颗粒反应混合物中； 反应步骤S120，使注入多孔板试剂盒420'之单元孔的所述蛋白质表达物与所述磁颗粒反应； 移除步骤S140，通过对含有所述蛋白质表达物的混合物施加磁场来移除除磁颗粒和与磁颗粒偶联之蛋白质之外的混合物； 洗涤步骤S150，通过将注入多孔板试剂盒420之单元孔的洗涤溶液注入来洗涤除来自磁颗粒之目标蛋白之外的杂质； 移除步骤S170，通过对含有混合物的洗涤溶液施加磁场来从含混合物的洗涤溶液中移除除连接目标蛋白的磁颗粒之外的混合物； 目标蛋白分离步骤S180，通过将注入多孔板试剂盒420之单元孔的目标蛋白洗脱溶液注入从所述移除步骤获得的混合物中来分离所述目标蛋白；以及 含有目标蛋白的溶液的获得步骤S200，通过对混合物施加磁场来从含有自磁颗粒分离之目标蛋白的目标蛋白洗脱溶液中获得除磁颗粒之外的含有目标蛋白的溶液。
10.权利要求9所述的方法，其中洗涤除目标蛋白之外的杂质的所述洗涤步骤S150和移除除连接有目标蛋白之磁颗粒以外的混合物的所述移除步骤S170顺序地进行一次或更多次。
11.权利要求9所述的方法`，其中含有目标蛋白的溶液的所述获得步骤S200包括将含有目标蛋白的溶液注入蛋白质贮存管442-3。
12.权利要求9所述的方法，其中所述磁颗粒是与镍离子偶联的磁颗粒。
【文档编号】C07K1/14GK103827137SQ201280041689
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年8月23日 优先权日:2011年8月26日
【发明者】朴翰浯, 赵俞相, 郑俊镐, 韩指元, 金楠镒 申请人:株式会社百奥尼