新的抗cxcr4抗体及其用于检测和诊断癌症的用途
【专利摘要】本发明提供用于癌症诊断的新的、分离的抗CXCR4抗体。特别地，本发明的抗体识别单体和同源二聚体的CXCR4，而不识别异源二聚体的CXCR4。
【专利说明】新的抗CXCR4抗体及其用于检测和诊断癌症的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及在患者中预后和/或诊断和/或治疗监测(therapy monitoring)增殖性疾病的领域。更具体的，本发明涉及能够特异性结合CXCR4的抗体，以及编码所述抗体的氨基酸和核酸序列。本发明也包括所述抗体用于检测和诊断与CXCR4表达相关的病理性过度增殖性致癌疾病(pathological hyperproliferative oncogenic disorders)的用途、和相应的方法。在某些实施方案中，所述疾病是与CXCR4相对于正常而言升高的表达相关的致癌疾病，或任何其它与CXCR4过表达相关联的病理学。本发明最终包括至少含有这种抗体的产物和/或组合物或试剂盒，以用于某些癌症的预后或诊断或治疗监测。
【背景技术】
[0002]趋化因子是小的分泌肽，特别是免疫反应期间其控制着白细胞沿被称为趋化因子梯度的配体化学梯度的迁移(Zlotnick A.等人，2000)。基于其NH2-端半胱氨酸残基的位置、及与G蛋白偶联受体(其两个主要亚家族被命名为CCR和CXCR)的结合，趋化因子被分为两个主要的亚家族，CC和CXC。到目前为止人们已发现了超过50个人趋化因子和18个趋化因子受体。
[0003]许多癌症具有复杂的趋化因子网络，其影响肿瘤的免疫细胞浸润以及肿瘤细胞生长、存活、迁移和血管生成。免疫细胞、内皮细胞和肿瘤细胞自身表达趋化因子受体，并可以响应趋化因子梯度。人类癌症活检样本和小鼠癌症模型的研究表明癌细胞趋化因子受体的表达与转移能力的增加相关。来自不同癌症类型的恶性细胞具有不同的趋化因子受体表达谱，但是趋化因子受体4 (CXCR4)是最常发现的。来自至少23种不同类型的上皮起源、间充质起源和造血起源的`人类癌症的细胞表达CXCR4受体(Balkwill F.等人，2004)。
[0004]趋化因子受体4 (也称为融合素、⑶184、LESTR或HUMSTR)作为包含352个或360个氨基酸的两种同种型存在。同种型a具有Genbank登录号NP_001008540所述的氨基酸序列，而同种型b具有Genbank登录号NP_003458所述的氨基酸序列。残基Asnll是糖基化的，残基Tyr21是通过添加硫酸基团修饰的，以及Cysl09和186通过二硫桥在受体的细胞外部分进行结合(Juarez J.等人,2004)。
[0005]该受体由不同类型的正常组织、初始(nSive)、非记忆T细胞、调节性T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、初级单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、CD34+造血干细胞表达，且在心脏、结肠、肝、肾和脑中以低水平表达。CXCR4在白细胞转运(trafficking)、B细胞淋巴细胞生成和髓细胞生成中起关键作用。
[0006]CXCR4受体在大量癌症中过表达，所述癌症包括但不限于淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、结肠癌(Ottaiano A.等人，2004)、乳癌(Kato M.等人，2003)、前列腺癌(SunY.X.等人，2003)、肺癌(小细胞癌和非小细胞癌(Phillips R.J.等人，2003))、卵巢癌(Scotton C.J.等人,2002)、胰腺癌(Koshiba T.等人,2000)、肾癌、脑癌(Barbero S 等人，2002),成胶质细胞瘤和淋巴瘤。
[0007]迄今描述的CXCR4受体的唯一配体是间质细胞衍生因子-1 (SDF-1)或CXCL12。SDF-1在淋巴结、骨髓、肝、肺中大量分泌，肾、脑和皮肤分泌程度更少。CXCR4也被拮抗趋化因子识别，该拮抗趋化因子是III型人疱疹病毒编码的病毒巨噬细胞炎症蛋白II(vMIP-1I)。
[0008]CXCR4/SDF-1轴在癌症中起关键作用，直接参与导致转移的迁移、侵入。实际上，癌细胞表达CXCR4受体，它们迁移并进入系统循环。然后，癌细胞被滞留(arrested)在产生高水平SDF-1的器官中的血管床中，在那里其增殖、诱导血管生成和形成转移性肿瘤(MurphyPM.,2001 )0该轴也通过激活细胞外信号调节的激酶(ERK)途径(Barbero S.等人，2003)和血管生成(Romagnani P.，2004)参与细胞增殖。实际上，CXCR4受体及其配体SDF-1通过刺激VEGF-A表达显然地促进了血管生成，其转而增加了 CXCR4/SDF-1的表达(BachelderR.E.等人，2002)。还已知与肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)聚集在肿瘤的缺氧区域，经刺激后与肿瘤细胞合作并促进血管生成。据观察缺氧选择性地上调包括TAM的各种细胞类型中CXCR4的表达(Mantovani A.等人，2004)。最近证实CXCR4/SDF-1轴调节CXCR4+造血干细胞/祖细胞(HSC)的转运/归巢，可在新生血管形成中起作用。证据显示除了 HSC之外，功能性CXCR4也在来自其它组织(组织定向干细胞=TCSC)的干细胞上表达，因此SDF-1可在器官/组织再生所需的化学引诱(chemottracting) CXCR4+TCSC中起关键作用，但是这些TCSC也可以是癌症发展的细胞起源(癌症干细胞理论)。对于人类白血病，和最近对于几种实体肿瘤，比如脑和乳房，证实了癌症的干细胞起源。存在几个可以衍生自正常CXCR4+组织/器官特异性干细胞的CXCR4+的肿瘤实例，比如白血病、脑肿瘤、小细胞肺癌、乳癌、肝胚细胞瘤、卵巢癌和宫颈癌(Kucia M.等人，2005)。
[0009]使用针对CXCR4受体的单克隆抗体在体内证实了通过干扰CXCR4受体可以靶向癌症转移(Muller A.等人，2001)。简而言之，已表明针对CXCR4受体(单抗173R&D系统)的单克隆抗体显著地减少了 SCID小鼠中常位(orthotopic)乳癌模型(MDA-MB231)中淋巴结转移的数量。另一个研究(Phillips R.J等人，2003)使用抗SDF-1的多克隆抗体也显示SDF-1/CXCR4轴在常位肺癌模型(A549)的转移中起决定性作用，但是在该研究中，其对于肿瘤生长和血管生成都没有作用。几个其它研究也描述了使用CXCR4的SiRNA双链体(Liang Z.等人，2005)生物稳定的CXCR4肽拮抗剂(Tamamura H.等人，2003)对体内转移的抑制，或使用CXCR4的小分子拮抗剂如AMD3100(Rubin J.B.等人，2003 ；De Falco V.等人，2007)或单抗(专利W02004/059285A2)对体内肿瘤生长的抑制。因此，CXCR4是经验证的用于癌症的治疗靶。
[0010]趋化因子受体2(CXCR2)是另一种趋化因子受体，也被描述为肿瘤学中感兴趣的靶。实际上，CXCR2在几种肿瘤细胞类型中传递自分泌细胞生长信号，也可以通过促进血管生成间接地影响肿瘤生长(Tanaka T.等人2005)。
[0011]CXCR2趋化因子受体包含360个氨基酸。其主要在内皮细胞中表达，尤其是在新生血管形成期间。几种趋化因子结合CXCR2受体:CXCL5、-6、-7、IL-8、GR0-a、-β和gamma，其属于ERL+促血管生成趋化因子。所述CXCR2受体与CXCR4受体共享序列同源性:37%的序列同一性和48%的序列同源性。CXCR2/配体轴参与几种肿瘤生长机制，比如转移(Singh RK.等人，1994)、细胞增殖(Owen J.D.等人，1997)和ERL+趋化因子介导的血管生成(StrieterR.M.等人，2004 ;Romagnani等人，2004)。最后，与肿瘤相关的巨噬细胞和嗜中性粒细胞是炎症诱导的肿瘤生长的关键元素，趋化因子比如CXCL5、IL-8和GRO-α启动嗜中性粒细胞的募集。
[0012]二聚化作为调节G蛋白偶联受体功能的通用机制出现，所述G蛋白偶联受体是趋化因子受体(Wang J.和Norcross M，2008)。已经表明响应趋化因子结合的同源二聚化和异源二聚化是启动和改变许多趋化因子受体的信号传导所需要的。不断有证据支持所述受体二聚体或寡聚体可能是趋化因子受体的基本功能单元的概念。在没有配体的情况下，发现了趋化因子受体二聚体，并且趋化因子诱导受体二聚体的构象变化。已知CXCR4与例如δ 阿片类受体(DOR) (Hereld D., 2008)或 CCR2 (Percherancier Y.等人，2005)形成同源二聚体，也形成异源二聚体。在后一个实例中，源自CXCR4的跨膜结构域的肽通过阻断配体诱导的所述二聚体的构象转换而抑制活化(Percherancier Y.等人,2005)。另一个研究表明CXCR4-TM4肽(CXCR4的跨膜区的合成肽)降低了 CXCR4同源二聚体的原体(protomer)之间的能量转移，并且抑制了恶性细胞中SDF-1诱导的迁移和肌动蛋白聚合(Wang J.等人，2006)。最近，也描述了 CXCR7与CXCR4形成功能性异源二聚体，并且增强了 SDF-1诱导的信号传导(Sierro F.等人，2007)。组成型异源二聚体的其它实例包括显示CXCRl和CXCR2相互作用以及形成各自同源二聚体的研究。对于它们中任一个与另一 GPCR(a (IA)肾上腺素受体)都没有记录到相互作用，表明CXCRl和CXCR2相互作用的特异性(Wilson S.等人，2005)。
[0013]如前所述，CXCR4和CXCR2受体是令人感兴趣的肿瘤靶点。干扰那些受体将通过减少肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤细胞迁移和侵入、肿瘤对嗜中性粒细胞和巨噬细胞的募集和通过抑制CXCR4癌症干细胞，以非常有效的方式抑制肿瘤生长和转移。
[0014] 申请人:已经公开了单克隆抗体，称为515H7和414H5，其结合CXCR4/CXCR4同源二聚体和CXCR4/CXCR2异源二聚体两者，并诱导两者的构象变化，其具有强的抗肿瘤活性(参见 W02010/037831)。
【发明内容】
[0015]本发明旨在提供至少一种可用作检测和/或监测致癌疾病的诊断或预后工具的试剂，特别是特征在于CXCR4表达、或者由异常CXCR4表达所介导的那些。
[0016]特别地，本发明提供可用于诊断或预后目的的能够结合CXCR4的新的分离的抗体。
[0017]出人意料地以及与现有技术中的抗体对比， 申请人:已经生成能够特异性地结合CXCR4的存在抗体，所述抗体以CXCR4单体或CXCR4/CXCR4同源二聚体的形式表达。在另一方面，本发明的抗体并不显著地结合任何已知的CXCR4/X异源二聚体，以及更具体地并不结合包括CXCR4/CXCR2异源二聚体。将在本说明书下文中讨论，这种性质关于诊断领域的极大兴趣。
[0018]本发明的其它特点和优点将从下列详述和实例中显明。
[0019]在第一方面，本发明涉及分离的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，其以高亲和力结合CXCR4，优选结合人类CXCR4，并因此可用于诊断由CXCR4表达所介导的病理性过度增殖性致癌疾病。`
[0020]本发明的其它特点和优点将从下列详述和实例中显明。
[0021]优选地，本发明包括根据本发明的的抗体、其衍生的化合物或其功能片段，其通过遗传重组或化学合成而获得。
[0022]在第一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。
[0023]应理解，“单克隆抗体”意思是来源于几乎同质的抗体群的抗体。更特别地，除了可以以最小比例发现的很少可能天然出现的突变之外，群中的单个抗体是相同的。换句话说，单克隆抗体是由来源于单个细胞克隆(例如杂交瘤、用编码同质性抗体的DNA分子转染的真核宿主细胞、用编码同质性抗体的DNA分子转染的原核宿主细胞等)生长的同质性抗体组成，其特征通常是一个且仅一个种类和亚类的重链，和仅一种类型的轻链。单克隆抗体是高度特异性且针对单一抗原的。另外，与通常包括针对各种决定簇或表位的各种抗体的多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原的单一表位。
[0024]典型的IgG抗体包含通过二硫键结合的两条相同重链和两条相同轻链。每个重链和轻链都包含恒定区和可变区。每个可变区包含三个被称为“互补决定区”(“⑶R”)或“超变区”的段，其主要负责与抗原的表位相结合。其通常按照从N端的顺序编号被称作CDR1、CDR2和CDR3。可变区中较为高度保守的部分被称作“框架区”。
[0025]存在三个重链⑶R和三个轻链⑶R。本文所用术语⑶R或⑶Rs表示，根据情况，包含负责抗体与其识别的抗原或表位通过亲和性结合的大多数氨基酸残基的这些区中的一个或几个、或者甚至全部这些区。
[0026]根据本发明，抗体的⑶R将根据IMGT编号系统来定义。从根据IMGT的⑶R推导出根据Kabat的⑶R，对本领域技术人员是显而易见的。根据Kabat的⑶R必须视作本发明范围的一部分。
[0027]无论抗原受体、链类型或物种如何，都将MGT唯一的编号定义为比较可变结构域[Lefranc M.-P., Immunology Todayl8, 509(1997)/Lefranc Μ.-P., TheImmunologist,7, 132-136 (1999) /Le`franc, Μ.-P., Pommie, C., Ruiz, Μ., Giudicelli, V., Foulquier, Ε.,Truong, L., Thouvenin-Contet, V.和 Lefranc, Dev.Comp.Tmmunol., 27,55-77 (2003)]。在IMGT唯一编号中，保守性氨基酸总是具有相同位置，例如半胱氨酸23(第I个CYS)、色氨酸41 (保守性TRP)、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104(第2个CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118 (J-PHE或J-TRP)。所述MGT唯一编号提供了框架区(FR1-MGT:位置I至26，FR2-1MGT:39 至 55，FR3-1MGT:66 至 104 和 FR4-1MGT:118 至 128)和互补决定区CDRHMGT:27 至 38，CDR2-1MGT:56 至 65 和 CDR3-1MGT:105 至 117 的标准化定界。由于空位(gap)代表未占用的位置，CDR-MGT长度(在括号之间显示，并用点分开，例如[8.8.13])成为关键信息。在2D图解中使用MGT唯一编号，命名为MGT Colliers dePerles [Ruiz, Μ.和 Lefranc, Μ.-P.，Immunogenetics, 53，857-883 (2002)/Kaas, Q.和Lefranc, Μ.-P.，Current Bioinformatics, 2，21-30 (2007)]，并在 IMGT/3D 结构 DB 中的 3D结构中使用[Kaas, Q.，Ruiz, M.和 Lefranc, M.-P.，T cell receptor and MHC structuraldata.Nucl.Acids.Res., 32, D208-D210 (2004)]。
[0028]在一个优选的实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物包含至少一个互补决定区(⑶R)，其氨基酸序列选自氨基酸序列SEQ ID N0.1至6、或者至少一个⑶R其序列与序列SEQ ID N0.1至6经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性。
[0029]在更优选的实施方案中，本发明的抗体包括i)重链，根据MGT编号系统所定义的，其含有下列CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3中的至少一个，其中CDR-Hl含有序列SEQ IDN0.1、CDR-H2 含有序列 SEQ ID N0.2 以及 CDR-H3 含有序列 SEQ ID N0.3 ;和 / 或 ii)轻链，根据頂GT编号系统所定义的，其含有下列⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3中至少一个，其中CDR-Ll含有序列SEQ ID N0.4、CDR-L2含有序列SEQ ID N0.5以及CDR-L3含有序列SEQID N0.6。
[0030]在另一优选的实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物包含重链，所述重链含有根据頂GT所定义的下列三个⑶R，分别为⑶R-Hl、⑶R-H2和⑶R-H3，其中CDR-Hl含有序列SEQ ID N0.1、CDR-H2含有序列SEQ ID N0.2以及CDR-H3含有序列SEQID N0.3。
[0031]根据再一优选的实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物包含轻链，所述轻链含有根据頂GT所定义的下列三个⑶R，分别为⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中CDR-Ll含有序列SEQ ID N0.4、CDR_L2含有序列SEQID N0.5以及CDR-L3含有序列SEQ ID
N0.6o
[0032]在一个优选的实施方案中，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物包含重链，所述重链含有下列三个⑶R，分别为⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，其中:
[0033]-⑶R-Hl含有序列SEQID N0.1、或者与序列SEQ ID N0.1经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
[0034]-⑶R-H2含有序列SE QID N0.2、或者与序列SEQ ID N0.2经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
[0035]-⑶R-H3含有序列SEQID N0.3、或者与序列SEQ ID N0.3经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0036]在另一优选的实施方案中，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物包含轻链，所述轻链含有下列三个⑶R，分别为⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中:
[0037]-CDR-Ll含有序列SEQ ID N0.4、或者与序列SEQ ID N0.4经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
[0038]-CDR-L2含有序列SEQ ID N0.5、或者与序列SEQ ID N0.5经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
[0039]-CDR-L3含有序列SEQ ID N0.6、或者与序列SEQ ID N0.6经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0040]在又一个实施方案中，抗体、或其功能片段或衍生物包括:
[0041]-重链，所述重链含有根据MGT所定义的下列三个⑶R，分别为具有序列SEQIDN0.1 的 CDR-H1、具有序歹Ij SEQ ID N0.2 的 CDR-H2 和具有序列 SEQ IDN0.3 的 CDR-H3，或者与序列SEQ ID N0.1、2或3分别经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
[0042]-轻链，所述轻链含有根据MGT所定义的下列三个⑶R，分别为具有序列SEQIDN0.4的CDR-Ll、具有序列SEQ ID N0.5的CDR-L2和具有序列SEQ ID N0.6的CDR-L3，或者与序列SEQ ID N0.4、5或6分别经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0043]在本发明的意义上，两条核酸或氨基酸序列之间的“百分比同一性”指两条进行比较的序列之间在最佳比对后获得的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比是纯粹统计学上的，并且两条序列之间的差异沿其长度随机分布。两条核酸或氨基酸序列之间的比较通常在已对其进行最佳比对后通过比较序列而进行，所述比较能够分段进行或使用“比对窗口”进行。用于比较的序列的最佳比对，除手工比较之外，还可以通过Smith和Waterman 的局部同源性算法(1981) (Ad.App.Math.2:482)、通过 Neddleman 和 Wunsch 的局部同源性算法(1970) (J.Mol.Biol.48:443)、通过Pearson和Lipman的相似性搜索法(1988) (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444)或通过使用这些算法的计算机软件(威斯康星遗传学软件包，遗传学计算机组，575Science Dr.，Madison, WI的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,或通过比较软件BLAST NR或BLAST P)进行。
[0044]通过比较两条最佳比对的序列确定两条核酸或氨基酸序列之间的百分比同一性，其中与用于两条序列之间最佳比对的参考序列相比，待比较的核酸或氨基酸序列可具有添加或删除。通过如下方法计算百分比同一性:确定两条序列之间相同氨基酸或核苷酸残基的位置数目，将相同位置的数目除以在比对窗口中的位置总数，并将结果乘以100以获得两条序列之间的百分比同一性。
[0045]例如，从网站http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 上可获得的 BLAST程序“BLAST2 序列”(Tatusova 等人，“Blast2sequences_a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences”，FEMS Microbiol, 1999, Lett.174:247_250)，可以与缺省参数一起使用(特别是参数“开放空位罚分”:5，和“延伸空位罚分”:2;所选的矩阵是例如程序建议的“BL0SUM62”矩阵)；直接通过所述程序计算两条待比较序列之间的百分比同一I"生。
[0046]对于表现出与参考氨基酸序列具有至少80%,优选85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列而言，优选的实例包括包含参考序列，某些修饰，特别是至少一个氨基酸的删除、添加或取代，截短或延伸的那些。在取代一个或更多个连续或不连续氨基酸的情况下，优选其中被取代的氨基酸被“等同的”氨基酸所取代的取代。在此，表述“等同的氨基酸”指可能被结构性氨基酸之一所取代的，然而并未改变相应抗体的生物活性的任何氨基酸和以下限定的那些具体实例。
[0047]等同氨基酸可根据其与被取代`氨基酸的结构同源性或根据可能产生的各种抗体之间生物活性的比较性测试结果而确定。
[0048]作为非限制性实例，下表1概述可进行却没有引起相应改变的抗体的生物活性发生显著改变的可能取代；在相同条件下，反向取代自然是可能的。
[0049]表1
[0050]
原始残基 [M
Ala(A)Val, Gly, Pro
Arg(R)Lys, His
Asn (N)Gln
【权利要求】
1.一种抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其包含:i)含有下列3个⑶R的重链，所述CDR分别为具有序列SEQ ID N0.1的CDR-H1、具有序列SEQ ID N0.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID N0.3的CDR-H3 ;和ii)含有下列3个CDR的轻链，所述CDR分别为具有序列SEQ IDN0.4 的 CDR-Ll、具有序列 SEQ ID N0.5 的 CDR-L2 和具有序列 SEQ ID N0.6 的 CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其中所述抗体选自: a.抗体，其具有含有下列3个⑶R的重链，所述⑶R分别为具有序列SEQIDN0.1的⑶R-Hl、具有序列SEQ ID N0.2的⑶R-H2和具有序列SEQ ID N0.3的⑶R-H3 ;以及含有序列SEQ ID N0.8的轻链可变结构域； b.抗体，其具有含有序列SEQID N0.7的重链可变结构域；以及含有下列3个⑶R的轻链，所述CDR分别为具有序列SEQ ID N0.4的CDR-L1、具有序列SEQ ID N0.5的CDR-L2和具有序列SEQ ID N0.6的CDR-L3 ;或 c.抗体，其具有含有序列SEQID N0.7的重链可变结构域；和含有序列SEQID N0.8的轻链可变结构域。
3.根据权利要求1或2任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其中所述抗体427aBl 包含: a)重链，所述重链包含: ?下列3个CDR，所述CDR分别为具有序列SEQ ID N0.1的CDR-HU 具有序列SEQ ID N0.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID N0.3的CDR-H3 ； 以及含有序列SEQ ID N0.8的轻链可变结构域；和 ?重链可变结构域，所述重链可变结构域具有序列SEQ ID N0.7 ;以及 b)轻链，所述轻链包含: ?下列3个CDR，所述CDR分别为具有序列SEQ ID N0.4的CDR-LU 具有序列SEQ ID N0.5的CDR-L2和具有序列SEQ ID N0.6的CDR-L3 ； 和 ?轻链可变结构域，所述轻链可变结构域具有序列SEQ ID N0.8。
4.根据权利要求1至3任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其中所述抗体能够结合作为单体和/或同源二聚体的CXCR4。
5.根据权利要求1至4任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其用于体外或离体诊断与CXCR4表达相关的致癌疾病，或者用于体外或离体确定与CXCR4表达相关的致癌疾病的发展的预后。
6.根据权利要求5所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其特征在于所述致癌疾病由与作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的表达相关的致癌疾病所组成。
7.根据权利要求1至6任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其特征在于所述抗体是鼠抗体。
8.根据权利要求1至7任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其特征在于所述抗体不阻断抗体515H7结合CXCR4。
9.根据权利要求1至8任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其特征在于所述抗体没有体内抗肿瘤活性。
10.一种鼠杂交瘤，其能够分泌根据权利要求1至9任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物。
11.根据权利要求10所述的鼠杂交瘤，其中所述的杂交瘤在2008年6月25日以编号1-4018保藏在法国巴黎巴斯德研究所的CNCM。
12.—种分离的核酸，其特征在于其选自下列核酸: a)核酸、DNA或RNA，其编码根据权利要求1至8任一项所述的抗体、或其衍生化合物或功能片段； b)核酸，其包含的DNA序列含有选自序列SEQID N0.9至14的序列、或者与序列SEQID N0.9至14经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列； c)核酸，其包含的DNA序列含有序列SEQID N0.15或16，或者与序列SEQID N0.15或16经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列； d)从如a)、b)或c)定义的核酸翻译而来的RNA； e)如a)、b)和c)定义的核酸的互补核酸；以及 f)至少18个核苷酸的核酸，其能够在高度严谨的条件下与序列SEQID N0.15或16、或者与序列SEQ ID15或16经最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列、或者其互补序列进行杂交。
13.—种载体，其包含如权利要求12所述的核酸。
14.一种宿主细胞，其转化有或包含如权利要求13所述的载体。
15.一种产生抗体、或其抗`原结合片段或衍生物的方法，其特征在于所述方法包括步骤:a)在培养介质中并且在适当的培养条件下培养如权利要求14所述的宿主细胞；和b)从所述培养介质或所述培养细胞中回收所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物。
16.一种用于体外或离体检测表达单体/同源二聚体的CXCR4的肿瘤存在的方法，其中所述方法包括步骤: (a)使来自所述受试者的生物样本接触根据权利要求1至9任一项所述的、或通过权利要求15所述的方法所获得的、或通过根据权利要求10或11所述的杂交瘤所产生的抗体、或其抗原结合片段或衍生物；以及 (b)检测所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与生物样本的结合。
17.一种用于体外或离体确定在来自受试者的肿瘤中表达作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的细胞的百分比的方法，所述方法包括步骤: (a)使来自受试者的样本接触根据权利要求1至9任一项所述的、或通过权利要求15所述的方法所获得的、或通过根据权利要求10或11所述的杂交瘤所产生的抗体、或其抗原结合片段或衍生物；以及 (b)定量在样本中表达作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的细胞的百分比。
18.一种用于体外或离体确定在来自受试者的肿瘤中作为单体和/或同源二聚体的单体/同源二聚体的CXCR4的表达水平的方法，所述方法包括步骤: (a)使来自受试者的生物样本接触根据权利要求1至9任一项所述的、或通过权利要求15所述的方法所获得的、或通过根据权利要求10或11所述的杂交瘤所产生的抗体、或其抗原结合片段或衍生物；以及 (b)定量所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与在生物样本中的单体/同源二聚体的CXCR4的结合水平。
19.根据权利要求18所述的方法，其中通过免疫组织化学(IHC)或FACS，优选通过IHC测量所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与单体/同源二聚体的CXCR4的结合水平。
20.一种用于体外或离体确定来自受试者的肿瘤评分的方法，所述方法包括步骤: (a)使来自受试者的生物样本接触根据权利要求1至9任一项所述的、或通过权利要求15所述的方法所获得的、或通过根据权利要求10或11所述的杂交瘤所产生的抗体、或其抗原结合片段或衍生物； (b)定量所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与在所述生物样本中作为单体和/或同源二聚体的单体/同源二聚体的CXCR4的结合水平；以及 (c)通过将来自受试者的所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物的结合的量化水平与适当等级进行比较，为肿瘤评分。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述的适当等级基于两个参数，其是染色强度和阳性细胞的百分比。
22.根据权利要求20或21任一项所述的方法，其中所述的适当等级是O至8的等级，其中“无反应性”评分为0，在“67-100%反应比例”的比例中的强反应性评分为8。
23.一种用于体外或离体确定来自受试者的肿瘤状态的方法，所述方法包括步骤: (a)根据权利要求20、21或22任一项为来自受试者的肿瘤评分；和 b)确定肿瘤状态是评分3至8的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)];或 (c)确定肿瘤状态是评分O至2的[单体/同源二聚体的CXCR4 (-)]。
24.根据权利要求20或21任一项所述的方法，其中所述的适当等级是O至3+的等级，其中无肿瘤细胞膜反应性评分为0，以及在10%以上肿瘤细胞中的强烈完全的反应性评分为3+。
25.一种用于体外或离体确定来自受试者的肿瘤状态的方法，所述方法包括步骤: (a)根据权利要求20、21或24任一项为来自受试者的肿瘤评分；和 (b)确定肿瘤状态是2+或3+评分的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)];或 (c)确定肿瘤状态是O或1+评分的[单体/同源二聚体的CXCR4(-)]。
26.一种用于确定致癌疾病是否对使用CXCR4拮抗剂的治疗易感的方法，所述方法包括步骤: (a)根据权利要求23或25体外或离体确定受试者的肿瘤状态，和 (b)如果状态是[单体/同源二聚体的CXCR4( + )],则确定致癌疾病对使用CXCR4拮抗剂的治疗易感。
27.一种用于体外或离体确定治疗方案效果的方法，所述治疗方案设计用于在患有单体/同源二聚体的CXCR4相关致癌疾病的受试者中缓解所述疾病，所述方法包括步骤: (a)在第一时间点提取自所述受试者的生物样本中根据权利要求18或19确定单体/同源二聚体的CXCR4的第一表达水平； (b)在第二较后的时间点提取自所述受试者的生物样本中根据权利要求18或19确定单体/同源二聚体的CXCR4的第二表达水平； (c)确定获自(a)的水平与获自(b)的水平之比；以及 (d)当步骤(c)之比大于I时，确定所述治疗方案的效果为高；或者 (e)当步骤(C)之比小于或等于I时，确定所述治疗方案的效果为低。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述治疗方案设计用于在患有单体/同源二聚体的CXCR4相关致癌疾病的受试者中缓解所述疾病，其包括向所述受试者施用CXCR4抑制剂。
29.一种用于选择癌症患者的体外或离体方法，所述癌症患者经预测能够或不能从施用治疗量的CXCR4抑制剂中获益，所述方法包括步骤: (a)根据权利要求18或19所述的方法，确定在所述患者中单体/同源二聚体的CXCR4的表达水平； (b)根据权利要求18或19所述的方法，确定来自健康个体的单体/同源二聚体的CXCR4的参考表达水平；和 (c)确定获自步骤(a)的水平与获自步骤(b)的水平之比；和 (d)如果步骤(c)之比大于1，则选择经预测从施用治疗量的CXCR4抑制剂中获益的患者；或者 (e)如果步骤(c)之比小于或等于1，则选择经预测不能从施用治疗量的CXCR4抑制剂中获益的患者。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述的CXCR4抑制剂是单克隆抗体515H7。
31.一种试剂盒，其至少包含根据权利要求1至9任一项所述的、或通过权利要求15所述的方法所获得的、或通过根据权利要求10或11所述的杂交瘤所产生的抗体、或其抗原结合片段或衍生物。
32.根据权利要·求31所述的试剂盒，其特征在于所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物被标记。
33.根据权利要求31或32任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于检测在所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与单体/同源二聚体的CXCR4之间结合程度的试剂。
34.根据权利要求31至33任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于定量在所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与单体/同源二聚体的CXCR4之间结合水平的试剂。
35.根据权利要求31至34任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于为单体/同源二聚体的CXCR4表达水平评分的阳性和阴性对照样本。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其进一步包含特异性识别鼠抗体的多克隆抗体，优选所述多克隆抗体被标记。
【文档编号】C07K16/28GK103827144SQ201280047593
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年7月30日 优先权日:2011年7月29日
【发明者】C·克林格-哈默, A·茹阿诺, M-C·贾宁-比萨 申请人:皮埃尔法布雷医药公司