巨噬细胞活化的调节的制作方法
【专利摘要】本发明一般涉及通过施用调节巨噬细胞活化的化合物促进M1型(巨噬细胞M1极化)免疫反应。本发明涉及能够结合CSF-1R的抗体用于调节巨噬细胞活化的用途。本发明也涉及通过评估巨噬细胞的体内或体外活化，评估能够结合CSF-1R的抗体在患者中的剂量疗效的方法。本发明还涉及用于评估能够结合CSF-1R的抗体对治疗中的受试者的作用的治疗后的伴随试验和测定。
【专利说明】巨噬细胞活化的调节
[0001]发明概述
[0002]本发明一般涉及通过施用调节巨噬细胞活化的化合物促进Ml型(巨噬细胞Ml极化)免疫反应，又称巨噬细胞极化。本发明涉及能够结合CSF-1R的抗体用于调节巨噬细胞活化/极化的用途。本发明也涉及通过评估巨噬细胞的体内或体外极化，评估能够结合CSF-1R的抗体在患者中的剂量疗效(dose efficacy)的方法。本发明还涉及用于评估能够结合CSF-1R的抗体对治疗中的受试者的作用的治疗后的伴随试验(companion test)和测定。
[0003]在炎症反应期间，循环单核细胞被募集到炎症位点，在那里它们采用由存在的特定细胞因子和生长因子决定的巨噬细胞表型。成熟的巨噬细胞分为2个群体，Ml极化的或称“经典活化的”，和M2极化的或称“替代活化的”。巨噬细胞是重要的肿瘤浸润细胞并在肿瘤生长和转移中起关键作用。在大多数实体瘤中，巨噬细胞的存在对肿瘤生长和转移有利。最近的研究显示，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)显示M2表型。这些肿瘤相关巨噬细胞(TAM)产生白介素IL-10和转化生长因子(TGF) β以抑制一般的抗肿瘤免疫反应。同时，TAM通过分泌促血管生成因子促进肿瘤血管新生，并定义侵略性微环境以帮助肿瘤转移和播散。因此，选择性消耗Μ2ΤΑΜ被认为是抗癌治疗的新方法(Sica等人，2006，European Journal ofCancer, 42，717-727)。
[0004]巨噬细胞以极化方式参与针对肿瘤的免疫反应。Ml分化由GM-CSF触发，由干扰素Y (IFN-GAMMA)、细菌脂多糖(LPS)或肿瘤坏死因子a (TNF α )进一步刺激，并通过若干信号转导通路介导，这些通路包括信号传导子及转录激活子(STAT)、活化B细胞核因子K -轻链增强子(NFkB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)。这些事件增加了例如活性氧族和一氧化氮(NO)这类物质的产生，并通过增加抗原呈递能力和引起Thl免疫(通过细胞因子例如IL12的产生)促进随后的炎性免疫反应。相反地，M2巨噬细胞活化用于描述以与Ml活化不同的方式活化的巨噬细胞，包括IL4/IL13刺激的巨噬细胞、ILlO诱导的巨噬细胞和免疫复合物触发的巨噬细胞。在Ml和M2活化间的许多分子差异中，IL12与ILlO产生的比例是区分Ml和M2巨噬细胞的关键。引人注目地是，TAM与M2巨噬细胞共有许多性能。
[0005]TAM展示了 M2谱，不仅通过IL-12ffiIL-1Os表型表征，而且通过与调控功能相关的FcR 介导的高嗜菌能力表征(Schmieder 等人 2012，SeminCancer Biol.，22，289-297)。已将血红素清除受体(⑶163)鉴定为M2极化的巨噬细胞的标记物，其由TAM表达(Ambarus等人2012，375，196-206)。TAM可代表在肿瘤微环境中最大的免疫抑制细胞群，由CSF-1和CCL-2 (MCP-1)募集(Sica 等人 2006，Eur J Cancer.，42，717-727)。
[0006]类似地，替代活化的M2巨噬细胞涉及若干病症，其中最突出的是变态反应和哮喘(Duff ield, 2003, Clin.Sc1.104, 27; Gordon, 2003, Nat.Rev.Tmmunol., 3, 23; Dagupta 和Keegan, J.1nnate Tmmun., 2012, 4, 478)。
[0007]发明人现在显示，特定单克隆抗体能够将M2巨噬细胞朝Ml巨噬细胞转换(即诱导Ml而不是M2巨噬细胞的分化)。他们已显示，所述单克隆抗体能够下调表面Fe Y RI (⑶64)和Fe Y RIII (⑶16)，从而下调MCP-1 (巨噬细胞趋化蛋白1，又称CCL-2)，IL-6, MMP9和/或IL-1O的产生，并促进IL-12，IL-1 □，TNF- α的产生。他们还进一步显示，所述单克隆抗体抑制从人单核细胞至⑶163+Μ2型巨噬细胞的分化并增加Μ1/Μ2巨噬细胞比例。
[0008]发明公开
[0009]本发明广泛地涉及通过调节巨噬细胞活化用于免疫调节的方法。 [0010]除非文中清楚地另有说明，本申请通篇使用的术语“一个”和“该”以这样的含义使用，它们意指“至少一个”、“至少第一个”、“一个或多个”或“多个”所提到的成分或步骤。例如，术语“该细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
[0011]无论在本文中的什么地方使用，术语“和/或”包括“和”、“或”及“通过该术语连接的元件的全部或任意其他组合”的含义。
[0012]本文所用的术语“约”或“大约”意指给定的值或范围的20%之内，优选10%之内，且更优选5%之内。术语“约X”还包括数值X。
[0013]本文所用的术语“包含”和“包括”旨在意指部分、产品、组合物和方法的组合包括所提到的成分或步骤，但不排除其他成分或步骤。例如，“包含X和I的组合物”包括包含X和I的任意组合物，无论在组合物中还存在什么其他成分。同样地，“包括步骤X的方法”包括其中实施X的任意方法，无论X是否是方法中的唯一步骤或其只是步骤之一，无论还有多少其他步骤和无论X相比其他步骤有多简单或复杂。
[0014]在用来定义产品、组合物和方法时，“基本上由…组成”将意指排除具有任何必须意义的其他成分或步骤。因此，组合物基本上由所引述的成分组成将不排除痕量污染物和可药用载体。“由…组成”将意指排除其他成分超出痕量元素的部分，或步骤。
[0015]根据第一个实施方案，本发明涉及通过在患有与不期望的M2巨噬细胞极化相关的病症的患者中调节M2巨噬细胞活化的免疫调节方法，其中所述方法包括对所述患者施用有效量的能够结合CSF-1R的抗体的步骤。本发明更具体地涉及这样的用于免疫调节的方法，其中所述患者还患有与CSF-1R活性相关的病症。
[0016]根据一个特定的实施方案，本发明涉及能够结合人CSF-1R的抗体用于调节M2巨噬细胞极化的用途，特别是在患有与不期望的M2巨噬细胞极化相关的病症的患者中。根据一个特定的实施方案，所述患者还患有与CSF-1R活性相关的病症。
[0017]本申请涉及“调节巨噬细胞极化/活化”。此术语表示本发明的调节抗体导致M2巨噬细胞活化库的减少和/或Ml巨噬细胞库的增加，优选地M2巨噬细胞活化库的减少和Ml巨噬细胞库的增加。因此，Μ1/Μ2的比例增加。如本文公开的，这可以通过与Ml和M2巨噬细胞相关的因子水平的变化得到指示。这样的因子的例子是膜标记物例如CD64或CD163，细胞因子例如IL6，IL10或IL12，干扰素，MCP-1，MMP9，等等。例如，可通过在对患者施用本发明的能够结合CSF-1R的抗体后测量IL12/IL10比例，MCP-1或IL-6水平，或⑶163_/⑶163+巨噬细胞比例的增加，来鉴定在患者中的此“调节巨噬细胞活化”。
[0018]根据另一个实施方案，本发明涉及在患有与不期望的M2极化相关的病症的患者中增加Ml巨噬细胞库的方法，其中所述方法包括对所述患者施用有效量的能够结合CSF-1R的抗体的步骤。本发明更具体地涉及这样的用于免疫调节的方法，其中所述患者还患有与CSF-1R活性相关的病症。
[0019]根据特定的实施方案，所述在患有与不期望的M2极化相关的病症的患者中增加Ml巨噬细胞库的方法还减少M2巨噬细胞库。
[0020]“患者”表示脊椎动物,例如哺乳动物,例如人。哺乳动物包括但不限于人、狗、猫、马、牛和猪。根据本发明，“患者”患有与不期望的M2活化相关的病症，根据特定的实施方案，其还患有与CSF-1R活性相关的病症。
[0021]本发明也更具体地涉及一种在患者中，特别是在患有与不期望的M2极化相关的病症和/或与CSF-1R活性相关的病症的患者中减少巨噬细胞的促肿瘤功能(即致瘤性)和/或增加巨噬细胞的肿瘤抑制活性的方法，其中所述方法包括对所述患者施用有效量的能够结合CSF-1R的抗体的步骤。
[0022]根据特定的实施方案，本发明的方法抑制选自肿瘤侵袭、转移、肿瘤细胞增殖、肿瘤生长、肿瘤存活、血管新生、先天或获得性免疫抑制和细胞外基质重塑的至少一种巨噬细胞促肿瘤功能。
[0023]因此，对于本发明，“调节巨噬细胞活化/极化”可还表示本发明的调节抗体减少选自肿瘤侵袭、转移、肿瘤细胞增殖、肿瘤生长、肿瘤存活、血管新生、先天或获得性免疫抑制和细胞外基质重塑的至少一种巨噬细胞促肿瘤功能(即致瘤性)。
[0024]根据特定的实施方案，本发明的方法抑制巨噬细胞，特别是人巨噬细胞产生MCP-l,MMP-9 和 IL-6。
[0025]根据特定的实施方案，本发明的方法下调巨噬细胞，特别是人巨噬细胞上的表面Fe Y RI (CD64)和 Fe Y RIII (CD16)的表达。
[0026]根据特定的实施方案，本发明的方法促进巨噬细胞，特别是人巨噬细胞的IL-12(更具体地IL-12P70形式)产生和/或上调IL-12/IL-10比例。
[0027]根据特定的实施方案，本发明的方法通过分泌的因子调节巨噬细胞的活化状态。
[0028]根据特定的实施方案，本发明的方法在患者中，特别是在患有与不期望的M2巨噬细胞极化相关的病症的患者中减少下述至少一项:
[0029].将TAM募集至肿瘤；
[0030]?至少一种巨噬细胞促肿瘤功能；
[0031]?肿瘤血管生成；
[0032].肿瘤侵袭和转移；
[0033].肿瘤生长；
[0034].肿瘤细胞增殖。
[0035]根据特定的实施方案，所述患者还患有与CSF-1R活性相关的病症。
[0036]本发明也涉及在患者中，特别是在患有与不期望的M2巨噬细胞极化相关的病症的患者中，或在患有与CSF-1R活性相关的病症的患者中驱动巨噬细胞朝向Ml型(巨噬细胞Ml极化)免疫反应和/或远离M2型(巨噬细胞M2极化)免疫反应的方法，其中所述方法包括对所述患者 施用有效量的能够结合CSF-1R的抗体的步骤。
[0037]本发明也涉及在患者中，特别是在患有与不期望的M2巨噬细胞极化相关的病症的患者中，或在患有与CSF-1R活性相关的病症的患者中驱动巨噬细胞朝向Thl免疫反应或远离Th2免疫反应的方法，其中所述方法包括对所述患者施用有效量的能够结合CSF-1R的抗体的步骤。
[0038]本发明也涉及能够结合CSF-1R的抗体用于调节巨噬细胞极化的用途。本发明也涉及能够结合CSF-1R的抗体用于驱动巨噬细胞朝向Ml型(巨噬细胞Ml极化)免疫反应的用途。本发明也涉及能够结合CSF-1R的抗体用于诱导巨噬细胞刺激Thl型免疫反应的用途。本发明也涉及包含能够结合CSF-1R的抗体的组合物，例如药物组合物用于调节巨噬细胞活化，驱动巨噬细胞朝向Ml型(巨噬细胞Ml极化)免疫反应和/或诱导巨噬细胞刺激Thl型免疫反应的用途。
[0039] 本文所用的术语“能够结合”指决定靶蛋白在蛋白质和其他生物制品的异源群体的存在下存在的结合反应。因此，在指定的测定条件下，本发明的抗体优先与CSF-1R的至少部分结合，优选地不以显著的量与存在于测试样品中的其他成分结合。本发明的抗体和CSF-1R靶标之间的特异性结合意指结合亲和力为至少ΙΟΙ1，且优选IO5M-1UO6M' IO7M'IO8Jr1UO9Ir1 或 110Ir1。
[0040]本文所用的术语“CSF-1R”指人CSFl受体。
[0041]本文所用的“抗体”或“Ab”以最广泛的含义使用。因此，“抗体”或“Ab”可以是天然存在的或人造的，如通过常规杂交瘤技术、重组技术产生的单克隆抗体(mAb)和/或其功能片段。本发明的抗体优选地是单克隆抗体(HiAb)。
[0042]本文所用的术语“可变区”指轻链(VL)或重链(VH)的可变区或结构域，其包含用于结合识别特异性的决定子。可变结构域涉及抗原识别，并形成抗原结合部位。重链和轻链的可变区都分为包含被如Kabat数据库中所定义的三段高变区序列或称互补决定区(CDR)打断的四个构架亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)的区段，CDRl位于FRl和FR2之间，CDR2在FR2和FR3之间，CDR3在FR3和FR4之间。不将具体的亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，通过其他方式提到的构架区代表单条天然存在的免疫球蛋白链可变区内组合的FR。本文所用的单数形式的FR代表四个亚区之一，复数形式的FR代表构成构架区的四个亚区中的两个或多个。抗体的构架区是组成的轻链和重链的组合构架区，且用来定位和排列CDR。CDR主要负责形成赋予对抗原表位的结合特异性和亲和力的抗体结合部位。提供抗原结合区的H或L链的可变区内是由于其在不同特异性的抗体之间的极端变异性而称为“高变”的更小序列。这类高变区还称为“互补决定区”或“⑶R”区。这些⑶R区负责抗体对具体的抗原决定簇结构的基本特异性。所有抗体的可变重链和轻链各具有3个CDR区，对于各轻(L)链和重(H)链，每个CDR区与其他CDR区不连续(称为L1、L2、L3、H1、H2、H3)。
[0043]“共同施用”表示与另一种试剂一起同等地共同施用，包括2种或多种试剂的同时或相继施用。
[0044]“有效量”一般表示提供期望的局部或全身性作用的量，例如有效减轻炎症的不良效应，包括调节巨噬细胞的活化等。例如，有效量是足以实现有益或期望的临床效果的量。可在单次施用中立即提供全部有效量，或在若干次施用中提供部分量的有效量。有效量应为多少的精确确定可基于每位受试者的个体因素，包括其体型、年龄、损伤、和/或治疗中的疾病或损伤，和自损伤出现后的时间或自疾病开始后的时间。本领域技术人员将能够基于这些本领域例行考虑确定对给定受试者的有效量。本文中使用的“有效剂量”与“有效量”含义相同。
[0045]根据另一个实施方案，本发明涉及能够结合人CSF-1R的抗体用于在患者中，特别是在患有与不期望的M2活化相关的病症的患者中，以及根据特定的实施方案在还患有与CSF-1R活性相关的病症的患者中，减少选自肿瘤侵袭、转移、肿瘤生长、肿瘤存活、血管新生、先天或获得性免疫抑制和基质重塑的至少一种巨噬细胞促肿瘤功能(即致瘤性)和/或增加巨噬细胞肿瘤抑制活性的用途。
[0046]根据另一个实施方案，本发明涉及能够结合人CSF-1R的抗体用于抑制巨噬细胞，特别是人巨噬细胞的MCP-1，MMP-9和IL-6产生的用途。
[0047]根据另一个实施方案，本发明涉及能够结合人CSF-1R的抗体用于下调巨噬细胞，特别是人巨噬细胞上的表面Fe Y RI (⑶64)和/或Fe Y RIII (CD16)表达的用途。
[0048]根据另一个实施方案，本发明涉及能够结合人CSF-1R的抗体用于促进巨噬细胞，特别是人巨噬细胞的IL-12 (更具体地IL-12P70形式)产生和/或上调IL-12/IL-10比例的用途。
[0049]根据另一个实施方案，本发明涉及能够结合人CSF-1R的抗体用于通过分泌的因子调节巨噬细胞的活化状态的用途。
[0050]根据另一个实施方案，本发明涉及能够结合人CSF-1R的抗体用于在患者中，特别是在患有与不期望的M2巨噬细胞极化相关的病症的患者中，根据特定的实施方案在还患有与CSF-1R活性相关的病症的患者中减少TAM募集和/或肿瘤血管生成的用途。
[0051]本发明也更具体地涉及能够结合人CSF-1R的抗体用于在患者中，特别是在患有与不期望的M2巨噬细胞极化相关的病症的患者中，根据特定的实施方案在还患有与CSF-1R活性相关的病症的患者中减少TAM募集和/或肿瘤侵袭和转移的用途。
[0052]本发明也更具体地涉及能够结合人CSF-1R的抗体用于在患者中，特别是在患有与不期望的M2巨噬细胞极化相关的病症的患者中，根据特定的实施方案在还患有与CSF-1R活性相关的病症的患者中减少TAM募集和/或肿瘤生长的用途。
[0053]根据另一个实施方案，本发明涉及能够结合人CSF-1R的抗体用于在患者中，特别是在患有与不期望的M2巨噬细胞极化相关的病症的患者中，根据特定的实施方案在还患有与CSF-1R活性相关的病症的患者中驱动巨噬细胞朝向Ml型(巨噬细胞Ml极化)免疫反应和/或远离M2型(巨噬细胞M2极化)免疫反应的用途。
[0054]根据另一个实施方案，本发明涉及能够结合人CSF-1R的抗体用于在患者中，特别是在患有与不期望的M2巨噬细胞极化相关的病症的患者中，根据特定的实施方案在还患有与CSF-1R活性相关的病症的患者中驱动巨噬细胞朝向Thl免疫反应和/或远离Th2免疫反应的用途。
[0055]根据优选 的实施方案，所述能够结合人CSF-1R的抗体是结合位于SEQ ID NO:23的氨基酸位置20至41之间(即人结构域Dl的N-端部分)的至少一个表位的抗体。在优选的实施方案中，根据本发明的抗体结合SEQ ID NO:23的氨基酸位置20至39之间(即人结构域Dl的N-端部分)的一个表位，结合SEQ ID N0:23的氨基酸Asn72，Ser94-Ala95-Ala96, Lysl02, Aspl31-Prol32-Vall33 和 Trp159?
[0056]在另一个实施方案中，根据本发明的抗体结合位于SEQ ID NO: 23的氨基酸位置20至41之间(即人结构域Dl的N-端部分)的表位，但不结合位于SEQ ID NO:23的氨基酸位置42至90之间，和/或氨基酸位置91至104之间，和/或氨基酸位置105至199之间，和/或氨基酸位置200至298之间的任意表位。根据优选的实施方案，本发明的抗体能够识别位于SEQ ID NO:23的氨基酸位置20至41之间(即人结构域Dl的N-端部分)的最小表位，优选SEQ ID NO:23的氨基酸位置20至39之间的表位。[0057]在优选的实施方案中，所述能够结合人CSF-1R的抗体是不与IL-34配体竞争结合CSF-1R受体的抗体。本文中使用的术语“不与IL-34配体竞争”指不抑制IL34配体与其受体CSF-1R结合。
[0058]在优选的实施方案中，所述能够结合人CSF-1R的抗体是与CSF-1配体部分竞争结合CSF-1R受体的抗体。本文中使用的术语“与CSF-1配体部分竞争”指对CSF-1配体与其受体CSF-1R结合的抑制低于100%，优选地低于50%，甚至更优选地低于20%，和有利地低于10%。此部分抑制剂仅减少但不完全排除配体结合，所述抑制被称为部分抑制。在优选的实施方案中，所述能够结合CSF-1R的抗体是能够部分阻止CSFl与其受体CSF-1R结合，但不能完全抑制所述结合的抗体。更具体地，根据本发明的抗体能够降少约5至10%的CSF-1与CSF-1R的结合。
[0059]根据一个实施方案，所述能够结合人CSF-1R的抗体是包含下述项的抗体:
[0060](i)至少一个⑶R，其中该⑶R包含SEQ ID NO:1中起始于45位并结束于54位的序列、SEQ ID NO:1中起始于66位并结束于87位的序列或SEQ ID NO:1中起始于117位并结束于126位的序列中的至少五个连续氨基酸；
[0061]或
[0062](ii)至少一个CDR，其中该CDR包含SEQ ID NO: 2中起始于44位并结束于56位的序列、SEQ ID NO: 2中起始于66位并结束于76位的序列或SEQ ID NO: 2中起始于109位并结束于117位的序列中的至少五个连续氨基酸。
[0063]根据优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含以下⑶R，所述⑶R包含如下至少五个连续氨基酸:
[0064]-SEQ ID NO:1中起始于45位并结束于54位的序列；
[0065]-SEQ ID NO:1中起始于66位并结束于87位的序列；
[0066]-SEQ ID NO:1中起始于117位并结束于126位的序列；
[0067]-SEQ ID NO: 2中起始于44位并结束于56位的序列；
[0068]-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于76位的序列；
[0069]-SEQ ID N0:2中起始于109位并结束于117位的序列。
[0070]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含至少一个⑶R，所述⑶R相互独立地选自下述⑶R:
[0071]-SEQ ID NO:1中起始于45位并结束于54位的序列；
[0072]-SEQ ID NO:1中起始于66位并结束于87位的序列；
[0073]-SEQ ID NO:1中起始于117位并结束于126位的序列；
[0074]-SEQ ID NO: 2中起始于44位并结束于56位的序列；
[0075]-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于76位的序列；
[0076]-SEQ ID NO:2中起始于109位并结束于117位的序列。
[0077]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含下述⑶R:
[0078]-SEQ ID NO:1中起始于45位并结束于54位的序列； [0079]-SEQ ID NO:1中起始于66位并结束于87位的序列；
[0080]-SEQ ID NO:1中起始于117位并结束于126位的序列；[0081]-SEQ ID NO: 2中起始于44位并结束于56位的序列；
[0082]-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于76位的序列；
[0083]-SEQ ID NO:2中起始于109位并结束于117位的序列。
[0084]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含至少一个含有SEQ ID NO:5, 6，7，8，9或10中任一个所示的氨基酸序列的⑶R。
[0085]根据优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含含有SEQ ID NO:5, 6，7，8，9或10中所示的氨基酸序列的⑶R。
[0086]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含:(i)至少一个含有SEQ ID NO: 11、12或13中任一个所示的氨基酸序列的⑶R ;或(ii)至少一个含有SEQ ID NO: 14,15或16中任一个所示的氨基酸序列的CDR。[0087]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含含有SEQ ID NO: 11、12、13、14、15或16中所示的氨基酸序列的CDR。
[0088]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含(i)至少一个含有SEQ ID NO: 17、18或19中任一个所示的氨基酸序列的⑶R ;或
(ii)至少一个含有SEQ ID N0:20、21或22中任一个所示的氨基酸序列的CDR。
[0089]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含至少一个含有SEQ ID勵:17、18、19、20、21或22中任一个所示的氨基酸序列的0?。
[0090]根据一个优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含含有SEQ ID勵:17、18、19、20、21或22中所示的氨基酸序列的0?。
[0091]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID N0:5、6和7所示的三个⑶R。
[0092]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID N0:8、9和10所示的三个⑶R。
[0093]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID N0:ll、12和13所示的三个⑶R。
[0094]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID N0:14、15和16所示的三个⑶R。
[0095]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID N0:17、18和19所示的三个⑶R。
[0096]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID NO: 20、21和22所示的三个⑶R。
[0097]根据一个优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
[0098]在更优选的实施方案中，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含可变区，其中该可变区如SEQ ID NO: 3所示。
[0099]在另一个优选实施方案中，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含可变区，其中该可变区含有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
[0100]在另一个更优选的实施方案中，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含可变区，其中该可变区如SEQ ID NO:4所示。[0101]根据优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含:
[0102]-含有SEQID NO:5、6和7所示的三个⑶R的可变区。
[0103]-含有SEQID N0:8、9和10所示的三个CDR的可变区。
[0104]根据优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含:
[0105]-含有SEQID NO: 11、12和13所示的三个CDR的可变区。
[0106]-含有SEQID NO: 14、15和16所示的三个CDR的可变区。
[0107]根据优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含:
[0108]-含有SEQID NO: 17、18和19所示的三个CDR的可变区。
[0109]-含有SEQID NO: 20、21和22所示的三个CDR的可变区。
[0110]根据优选实施 方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含:
[0111]-如SEQID NO:3所示的可变区和
[0112]-如SEQID NO:4所示的可变区。
[0113]根据优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含:
[0114](i)含有以下的重链可变区:
[0115]-SEQ ID NO:1中起始于45位并结束于54位的序列所示的CDR ；
[0116]-SEQ ID NO:1中起始于66位并结束于87位的序列所示的CDR ;和
[0117]-SEQ ID NO:1中起始于117位并结束于126位的序列所示的⑶R ；
[0118]和
[0119](ii)含有以下的轻链可变区:
[0120]-SEQ ID NO: 2中起始于44位并结束于56位的序列所示的CDR ；
[0121]-SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于76位的序列所示的CDR ;和
[0122]-SEQ ID NO:2中起始于109位并结束于117位的序列所示的CDR。
[0123]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含(i)含有SEQ ID NO:5、6和7所示的三个⑶R的重链可变区；和(ii)含有SEQ IDN0:8、9和10所示的三个⑶R的轻链可变区。
[0124]根据另一实施方案，本发明的抗体特异性结合CSF-1R，且包含(i)含有SEQ IDNO: 11、12和13所示的三个CDR的重链可变区jP(ii)含有SEQ ID N0:14、15和16所示的三个⑶R的轻链可变区。
[0125]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含(i)含有SEQ ID NO: 17、18和19所示的三个⑶R的重链可变区；和(ii)含有SEQID NO:20、21和22所示的三个CDR的轻链可变区。
[0126]根据优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含(i)如SEQ ID N0:3所示的重链可变区；和(ii)如SEQ ID N0:4所示的轻链可变区。
[0127]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含:
[0128] (a)通过下式定义的第一可变区
[0129]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0130]其中:
[0131]FR1、FR2、FR3 和 FR4 各为构架区；
[0132]CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
[0133]其中:
[0134]⑶Rl具有SEQ ID NO:1中起始于45位并结束于54位的序列中的至少五个连续氨
基酸；
[0135]⑶R2具有SEQ ID NO:1中起始于66位并结束于87位的序列中的至少五个连续氨
基酸；和
[0136]⑶R3具有SEQ ID NO:1中起始于117位并结束于126位的序列中的至少五个连续氨基酸；
[0137]和
[0138](b)通过下式定义的第二可变区
[0139]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0140]其中:
[0141]FR1、FR2、FR3 和 FR4 各为构架区；
[0142]CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
[0143]其中:
[0144]⑶Rl具有SEQ ID NO: 2中起始于44位并结束于56位的序列中的至少五个连续氨
基酸；
[0145]⑶R2具有SEQ ID NO: 2中起始于66位并结束于76位的序列中的至少五个连续氨
基酸；和
[0146]⑶R3具有SEQ ID NO: 2中起始于109位并结束于117位的序列中的至少五个连续
氨基酸。
[0147]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，且包含:
[0148](a)通过下式定义的第一可变区
[0149]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0150]其中:
[0151]FR1、FR2、FR3 和 FR4 各为构架区；
[0152]CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
[0153]其中:
[0154]CDRl具有选自SEQ ID NO:5、11和17的氨基酸序列；
[0155]CDR2具有选自SEQ ID N0:6、12和18的氨基酸序列；和
[0156]CDR3具有选自SEQ ID NO:7、13和19的氨基酸序列；
[0157]和
[0158](b)通过下式定义的第二可变区[0159]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0160]其中:
[0161]FR1、FR2、FR3 和 FR4 各为构架区；
[0162]CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
[0163]其中:
[0164]CDRl具有选自SEQ ID NO:8、14和20的氨基酸序列；
[0165]CDR2具有选自SEQ ID NO:9、15和21的氨基酸序列；和
[0166]CDR3具有选自SEQ ID NO: 10、16和22的氨基酸序列。
[0167]根据另一实施方 案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，其包含以下或(iii)中的任一个:
[0168](i)
[0169](a)通过下式定义的第一可变区
[0170]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0171]其中:
[0172]FR1、FR2、FR3 和 FR4 各为构架区；
[0173]CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
[0174]其中:
[0175]CDRl 如 SEQ ID NO:5 所示；
[0176]CDR2 如 SEQ ID NO:6 所示；和
[0177]CDR3 如 SEQ ID NO:7 所示；
[0178]和
[0179](b)通过下式定义的第二可变区
[0180]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0181]其中:
[0182]FR1、FR2、FR3 和 FR4 各为构架区；
[0183]CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
[0184]其中:
[0185]CDRl 如 SEQ ID NO:8 所示；
[0186]CDR2 如 SEQ ID NO:9 所示；和
[0187]CDR3 如 SEQ ID NO: 10 所示；
[0188]或
[0189](ii) (a)通过下式定义的第一可变区
[0190]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0191]其中:
[0192]FR1、FR2、FR3 和 FR4 各为构架区；
[0193]CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
[0194]其中:
[0195]CDRl 如 SEQ ID NO: 11 所示；
[0196]CDR2 如 SEQ ID NO: 12 所示；和[0197]CDR3 如 SEQ ID NO: 13 所示；
[0198]和
[0199](b)通过下式定义的第二可变区
[0200]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0201]其中:
[0202]FR1、FR2、FR3 和 FR4 各为构架区；
[0203]CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
[0204]其中:
[0205]CDRl 如 SEQ ID NO: 14 所示；
[0206]CDR2 如 SEQ ID NO: 15 所示；和
[0207]CDR3 如 SEQ ID NO: 16 所示；
[0208]或
[0209](iii) (a)通过下式定义的第一可变区
[0210]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0211]其中:
[0212]FR1、FR2、FR3 和 FR4 各为构架区；
[0213]CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
[0214]其中:
[0215]CDRl 如 SEQ ID NO: 17 所示；
[0216]CDR2 如 SEQ ID NO: 18 所示；和
[0217]CDR3 如 SEQ ID NO: 19 所示；
[0218]和
[0219](b)通过下式定义的第二可变区
[0220]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0221]其中:
[0222]FR1、FR2、FR3 和 FR4 各为构架区；
[0223]CDR1、CDR2和CDR3各为互补决定区；
[0224]其中:
[0225]CDRl 如 SEQ ID NO:20 所示；
[0226]CDR2 如 SEQ ID NO:21 所示；和
[0227]CDR3 如 SEQ ID NO:22 所示。
[0228]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，其包含:
[0229]-含有SEQID NO: 3的氨基酸序列的第一可变区；和
[0230]-含有SEQID NO:4的氨基酸序列的第二可变区。
[0231]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，其包含:
[0232]-含有SEQID NO:1的氨基酸序列的第一可变区；和
[0233]-含有SEQID NO:2的氨基酸序列的第二可变区。[0234]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，其包含:
[0235]-选自SEQ ID NO:24 和 SEQ ID NO:25 的重链；和
[0236]-选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:28 的轻链。
[0237]根据另一实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，其包含:
[0238]-选自SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:30 的第一可变区；和
[0239]-选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32 和 SEQ ID NO:33 的第二可变区。
[0240]根据一个优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，其包含(a)存在于SEQ ID NO: 24的重链和(b)存在于SEQ ID NO: 26的轻链。
[0241]根据另一优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，其包含(a)存在于SEQ ID NO: 25的重链和(b)存在于SEQ ID NO: 27的轻链。
[0242]根据一个有利的实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，其包含(a)存在于SEQ ID NO:24的重链和(b)存在于SEQ ID N0:28的轻链。所述单克隆抗体的例子是单克隆抗体H27K15。
[0243]根据一个优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，其包含(a)存在于SEQ ID NO: 29的第一可变区和(b)存在于SEQ ID NO: 31的第二可变区。
[0244]根据另一优选实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，其包含(a)存在于SEQ ID NO:30的第一可变区和(b)存在于SEQ ID N0:32的第二可变区。
[0245]根据一个有利的实施方案，所述能够结合CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，其包含(a)存在于SEQ ID NO:29的第一可变区和(b)存在于SEQ ID N0:33的第二可变区。所述单克隆抗体的例子是单克隆抗体H27K15。
[0246]本发明的抗体，更具体而言，本发明的人抗体可以属于不同的同种型，如IgG、IgA、IgM或IgE。在优选实施方案中，本发明的抗体，更具体而言，本发明的人抗体是IgG。
[0247]本发明的抗体可以是糖基化的或非糖基化的。
[0248]本文所用的术语“糖基化”指共价附着于抗体的糖类单位的存在。
[0249]本发明的方法可用于治疗与不期望的M2活化相关的和与CSF-1R相关的病症。本发明的方法可用于治疗涉及炎症和与CSF-1R相关的疾病。
[0250]根据本发明的“患有与不期望的M2巨噬细胞极化相关的病症的患者”指癌症，特别是转移癌，进行性纤维化疾病，例如特发性肺纤维化(IPF)、肝纤维化或或系统性硬化(Wynn和Barron, 2010, Semin.Liver Dis., 30, 245)、变态反应和哮喘、动脉粥样硬化和阿兹
海默病。
[0251]根据另一实施方案，本发明涉及在患有癌症的患者中驱动巨噬细胞朝向Ml型(巨噬细胞Ml极化)驱动的免疫反应和远离M2型(巨噬细胞M2极化)驱动的免疫反应的方 法。
[0252]根据另一实施方案，本发明涉及在患有进行性纤维化疾病的患者中驱动巨噬细胞朝向Ml型(巨噬细胞Ml极化)免疫反应和远离M2型(巨噬细胞M2极化)免疫反应的方法。
[0253]根据另一实施方案，本发明涉及在患有变态反应的患者中驱动巨噬细胞朝向Ml型(巨噬细胞Ml极化)驱动的免疫反应和远离M2型(巨噬细胞M2极化)驱动的免疫反应的方法。
[0254]根据另一实施方案，本发明涉及在患有哮喘的患者中驱动巨噬细胞朝向Ml型(巨噬细胞Ml极化)免疫反应和远离M2型(巨噬细胞M2极化)免疫反应的方法。[0255]本文所用的术语“癌症”指但不限于腺癌、腺泡细胞腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡细胞癌、退行性癌、基底细胞样癌、基底细胞癌、细支气管癌、支气管癌、renaladinolcarcinoma、胚胎癌、anometroid carcinoma、fibrolamolar 肝细胞癌、滤泡癌、巨细胞癌、肝细胞癌、表皮内癌、上皮内癌、leptomanigio carcinoma、髓样癌、黑素癌、menigualcarcinoma、mesometonephric carcinoma、燕麦细胞癌、鳞状细胞癌、汗腺癌、移行细胞癌、管状细胞癌、成釉质细胞肉瘤、血管结石性肉瘤、葡萄状肉瘤、子宫内膜基质肉瘤、尤因肉瘤、梭细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞性肉瘤、成免疫细胞性肉瘤、juxaccordialosteogenic sarcoma、coppices sarcoma、白血病性肉瘤(白血病)、淋巴性肉瘤(淋巴肉瘤)、髓样肉瘤、髓系肉瘤(granulocitic sarcoma)、austiogenci sarcoma、骨膜肉瘤、网状细胞肉瘤(组织细胞型淋巴瘤)、圆细胞肉瘤、梭形细胞肉瘤、滑膜肉瘤、telangiectaticaudiogenic sarcoma、伯基特淋巴瘤、NPDL> NML> NH和弥漫性淋巴瘤。根据优选实施方案，本发明的方法针对至骨骼的转移性癌症的治疗，其中该转移性癌症是乳腺癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、前列腺癌、腺癌、恶性血细胞癌，包括白血病和淋巴瘤；头颈癌；胃肠癌，包括食管癌、胃癌、结肠癌、肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、胆管或胆囊的癌症；雌性生殖道的恶性肿瘤，包括卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌和宫颈癌；膀胱癌；脑癌，包括成神经细胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；及皮肤癌，包括恶性黑色素瘤或鳞状细胞癌。
[0256]本发明还涉及用于改善正在用癌治疗剂进行化学疗法治疗的癌症患者的治疗的方法，其包括与上文公开的方法一起共同治疗该患者。
[0257]本发明还涉及用于改善正在用癌症治疗疫苗进行免疫疗法治疗的癌症患者的治疗的方法，其包括与上文公开的方法一起共同治疗该患者。根据优选的实施方案，所述癌症治疗疫苗是基于病毒的治疗疫苗。更优选地，所述基于病毒的治疗疫苗是基于MVA的治疗疫苗。甚至更优选地，所述基于MVA的治疗疫苗携带和表达人乳头瘤病毒16(HPV16)E6和E7癌蛋白(oncoprotein)和人白介素_2(例如TG4001产品)或表达Mucl抗原和人白介素-2(例如TG4010产品)。
[0258]本发明还包括在对患者施用能够结合CSF-1R的抗体后的治疗后监控测定，以评估所述治疗的效力，和/或评估所述治疗的临床效果。
[0259]所述监控测定包括但不限于，对活化的巨噬细胞Ml或M2极化巨噬细胞表达和/或分泌的循环因子的测定。
[0260]在巨噬细胞M2型活化状态中表达的因子包括但不限于IL-10，IL_6和MCP-1。也可测定在巨噬细胞Ml型活化状态中表达的因子，例如通过测量IL-12水平，更具体地IL-12P70形式的水平。可通过在对患者施用本发明的能够结合CSF-1R的抗体后测量IL12/ILlO比例的增加在患者中鉴定驱动巨噬细胞朝向Ml型(巨噬细胞Ml极化驱动的免疫反应和远离M2型(巨噬细胞M2极化驱动的免疫反应。[0261 ] 这些试验可来自患者的血清、血液、组织等。
[0262]本发明还包括在对患者施用了能够结合CSF-1R的抗体后的治疗后监控测定，以监控巨噬细胞活化和建立和/或维持合适的剂量方案。
[0263]在此情况下，可以通过直接测定或通过活化巨噬细胞表达和/或分泌的因子测定组织中巨噬细胞Ml和/或M2的存在得到基线水平，然后在治疗期间施用能够结合CSF-1R的抗体后监控I次或多次组织(肿瘤或正常组织)中Ml对M2巨噬细胞的存在。然后可测定导致将M2型巨噬细胞偏移至Ml型巨噬细胞反应的治疗的最佳剂量。
[0264]本发明提供了使用生物学标记物(生物标记物)评估涉及对患者施用能够结合CSF-1R的抗体的治疗效力的材料和方法，所述生物标记物已被确定是与期望的免疫反应相关的基本可/[目 的标志。生物标记物存在于获自患者的生物样品中。在治疗开始后不久预测其临床效果的能力将使临床医生和患者能够鉴定无效治疗，进行有关疗程的知情决定，包括是否放弃或允许实施替代疗法。
[0265]本发明提供了评估涉及对患者施用能够结合CSF-1R的抗体的治疗效力的离体方法。
[0266]根据本发明，术语“评估”应被理解为“监控、修饰或调整”涉及对患者施用能够结合CSF-1R的抗体的治疗。
[0267]在某些方面，所述方法包括评估能够结合CSF-1R的抗体的效力，基于在免疫疗法治疗后在患者中的干扰素Y水平。
[0268]监控测定包括但不限于，对Ml和/或M2型活化巨噬细胞表达和/或分泌的循环因子的测定。
[0269]在巨噬细胞M2型活化状态中表达的因子包括但不限于IL_6，MMP9和MCP-1。也可测定在巨噬细胞Ml型活化状态中表达的因子，例如通过测量IL-12水平，更具体地IL-12P70形式的水平，或IL-12/IL-10比例。
[0270]在某些方面，所述方法包括在对患者施用了能够结合CSF-1R的抗体后测量患者的白介素-6，白介素_12，MMP9和/或MCP-1水平；和基于白介素-6，白介素_12，MMP9和/或MCP-1的水平评估治疗效力。
[0271]在某些方面，所述方法包括在对患者施用了能够结合CSF-1R的抗体数周后至少测量一次患者的白介素-6，白介素_12，MMP9和/或MCP-1水平；和基于白介素-6，白介素-12，MMP9和/或MCP-1的水平评估免疫疗法治疗的效力。
[0272]在某些方面，所述方法还可包括在施用能够结合CSF-1R的抗体前测量患者的白介素-6，白介素-12，MMP9和/或MCP-1水平。根据优选的实施方案，在所述施用能够结合CSF-1R的抗体前测量的患者的白介素_6，白介素-12，MMP9和/或MCP-1水平值是根据本发明的“截止值”。
[0273]施用能够结合CSF-1R的抗体和测量白介素-6，白介素-12，MMP9和/或MCP-1水平之间的时间可为I天至约48周或更长(例如，从约I天至约I周，从约I周至约2周，从约2周至约4周，从约4周至约8周，从约8周至约12周，从约12周至约16周，从约16周至约24周，从约24周至约48周或更长)。在本发明的优选实施方案中，时间间隔为约5周。类似地，可在第二次测量后的类似时间间隔进行另外的测量(即，第3、第4、第5次等测量)。[0274]在相关方面，所述方法包括在对患者施用了能够结合CSF-1R的抗体后测量患者的白介素-6，白介素-12，MMP9和/或MCP-1水平；比较所述水平与截止值；和基于相比“截止值”的白介素_6，白介素-12，MMP9和/或MCP-1水平评估免疫疗法治疗的效力。
[0275]根据特定的实施方案，本发明涉及评估涉及对患者施用能够结合CSF-1R的抗体的治疗的效力的方法，其包括:
[0276](i)对所述受试者施用一个或多个剂量的所述能够结合CSF-1R的抗体；
[0277](ii)在至少一次所述施用后在所述受试者体内测量白介素_6，白介素_12，MMP9和/或MCP-1水平。
[0278]根据本发明的可选实施方案，本发明的方法还包括初始步骤，其包括在施用能够结合CSF-1R的抗体前在患者体内测量白介素_6，白介素-12，MMP9和/或MCP-1水平。
[0279]根据本发明，在从患者得到的生物样品中测量白介素-6，白介素_12，MMP9和/或MCP-1水平。生物样品包括但不限于血液、血清、组织，和生物来源的其他液体样品，实体组织样品，例如活检标本。在优选的实施方案中，生物样品是血液、血浆或血清，其中从患者得到样品是相对简单和非侵入的程序。得到血液或血清的方法是本领域熟知的，不是本发明的一部分。
[0280]此外，检测和定量多肽，包括瞬时生物标记物的多种方法是公知的。这样的方法包括但不限于，基于抗体的方法，更具体地，基于单克隆抗体的方法。检测和定量生物标记物的具体方法对本发明不重要。例如，可使用Luminex技术(LuminexCorporation, Austin, Tex.)或酶联免疫吸附测定(ELISA,多种ELISA试剂盒是市售的,例如由CliniScience, Diaclone, Biosource出售)使用本发明的材料与方法。
[0281]根据本发明的一个实施方案，使用抗体测定白介素-6，白介素_12，MMP9和/或MCP-1水平。
[0282]根据本发明的一个特定实施方案，所述抗体是白介素-6，白介素_12，MMP9或MCP-1特异性的。
[0283]根据本发明的一个特定实施方案，所述抗体是单克隆抗体。
[0284]根据本发明的一个特定实施方案，所述抗体被例如荧光、放射性标签、酶、生物素或任意其他旨在使被所述抗体标记的细胞可检测的方法标记。这些技术是本领域广泛使用和公知的。
[0285]当在施用了能够结合CSF-1R的抗体后在患者中测量的白介素_6，MMP9和/或MCP-1水平分别低于在所述施用前的白介素-6和/或MCP-1水平(即截止值)时，认为本发明的免疫疗法治疗是有效的。
[0286]可选地，当在施用了能够结合CSF-1R的抗体后在患者中测量的白介素-12水平高于在所述施用前的白介素-12水平(即截止值)时，认为本发明的免疫疗法治疗是有效的。
[0287]本发明还包括在对患者施用了能够结合CSF-1R的抗体后的治疗后监控方法以监控巨噬细胞活化和建立和/或维持合适的剂量方案。
[0288]在此情况下，可以通过直接测定或通过活化巨噬细胞表达和/或分泌的因子测定循环中巨噬细胞 Ml和/或M2的存在得到基线水平，然后在治疗期间施用能够结合CSF-1R的抗体后监控1次或多次循环中巨噬细胞的存在。
[0289]然后可测定导致将M2型巨噬细胞偏移至Ml型巨噬细胞反应的治疗的最佳剂量。[0290]本发明的方法可用于治疗包括炎症和与CSF-1R相关的疾病。
[0291]图注
[0292]图1:H27K15对分化中的巨噬细胞没有细胞毒性，而其他抗⑶115mAb引起大量细
胞死亡。
[0293]在存在或缺乏抗⑶115mAb或F(ab’)2，或存在GW2580的情况下，对在GM-CSF和CSF-1中培养6天后的单核细胞进行细胞计数。对照包括用利妥昔单抗或利妥昔单抗F(ab’)2处理的培养物，或不加任何化合物的培养物。显示了在每种培养条件下得到的在5个显微镜视野中的平均细胞计数土标准差。
[0294]图2:在存在单克隆抗体H27K15时分化的人巨噬细胞中⑶64 (Fe Y RI)表达的抑制。
[0295]通过IC/FC分析从与 GM-CSF和CSF-1 —起培养6天后的来自3位不同供血者的单核细胞得到的巨噬细胞表面的⑶64表达。上图:用单克隆抗体H27K15(左，粗线)或用GW2580(右，粗线)或其对应的阴性对照利妥昔单抗(左，细线)处理的或不处理(右，细线)的供体I的培养物中的CD64染色。下图:以10，I或0.1 μ g/ml*浓度的试验化合物处理的巨噬细胞培养物中的荧光强度的中位数与其对应阴性对照的比较:H27K15对利妥昔单抗，H27K15来源的F(ab’)2对利妥昔单抗来源的F(ab’)2，mAbs2-4A5或9-4D2对大鼠IgGl, GW2580对无处理。CD64表达减少的百分比计算如下:100-[100χ试验化合物的荧光强度中位数/对照的荧光强度中位数]。显示了 3位供血者中的CD64表达减少的平均百分比。*F(ab，)2例外，其以等摩尔浓度:6.6; 0.6;和0.06 μ g/ml使用。
[0296]图3:通过H27K15诱导CD86*SSC?巨噬细胞群。
[0297]上图:点图显示在存在H27K15(左)或阴性对照利妥昔单抗(右)时分化6天的供体3的巨噬细胞CD86染色(X-轴)和侧向散射(SSC，y-轴)。在H27K15诱导的CD86*SSC?细胞群上设置门限。下图:以10，I或0.1 μ g/ml*浓度的试验化合物处理的⑶86*SSC?细胞的百分比与其对应阴性对照的比较:H27K15对利妥昔单抗，H27K15来源的F(ab’ )2对利妥昔单抗来源的F(ab’)2，GW2580对无处理。⑶86*SSC?细胞群增加的百分比计算如下:IOOx试验化合物的⑶86* SSC?细胞百分比/对照的⑶86* SSC?细胞百分比。显示了 3位供血者的CD86*SSC?细胞群的平均增加百分比。*F(ab’)2例外:6.6;0.6;和0.06 μ g/ml ο
[0298]图4:H27K15诱导IL_12p70分泌和增加巨噬细胞IL-12/IL-10比例。
[0299]在存在mAb H27K15 (I μ g/ml)，GW2580 (I μ Μ)或其对应的阴性对照利妥昔单抗或无处理时分化6天的巨噬细胞培养上清中滴定IL-12p70和IL-10。左图:3位供血者的巨噬细胞培养物中的IL-12p70和IL-10水平(pg/ml)。右:对每位供血者和每种培养条件计算 IL-12p70(pg/ml)/IL-10(pg/ml)比例。在检测不到(低于 llpg/ml 的检测限度)IL_12p70的样品中，将其水平人为设定为lpg/ml以计算IL-12p70/IL-10比例。
[0300]图5:H27K15抑制巨噬细胞分泌MCP-1/CCL2和IL-6。
[0301]在存在mAb H27K15 (I μ g/ml)，GW2580 (I μ Μ)或其对应的阴性对照利妥昔单抗或无处理时分化6天的巨噬细胞培养上清中滴定MCP-1和IL-6。3位供血者的MCP-1 (上图)或IL-6产生(下图)减少的百分比计算如下:100-[100χ试验化合物的细胞因子浓度(pg/ml)/对照的细胞因子浓度(pg/ml)]。[0302]图6.在存在或缺乏mAb H27K15,利妥昔单抗或GW2580，和存在GM-CSF和CSF-1时分化从3位不同的供血者分离的单核细胞6天。对培养物加入MAb H27K15或利妥昔单抗(0.1, I或10 μ g/ml)或等摩尔浓度的来自两种mAb的F(ab)’ 2。在6天的培养上清中通过 ELISA (R&D Systems)滴定 MMP-9。
[0303] 图7收获在存在GM-CSF和CSF-1下培养6天得到的细胞，并与包含人IgG Fe片段的PBS在4°C孵育20分钟以饱和Fe受体。然后在4°C孵育荧光染料缀合的mAb (抗CD14-PerCP-Cy5.5，抗 CD163-PE,抗 CD206-APC,抗 CDla-FITC, BD Biosciences)和每种样品20分钟。使用FACSLSR-1I (BD biosciences)和DIVA软件进行FCM分析。显示了 3位不同供血者的数据。
[0304]图8在存在或缺乏I μ g/ml的抗⑶115mAb H27K5或对照IgG1利妥昔单抗，和存在GM-CSF和CSF-1下培养2位不同供体的单核细胞。在细胞分化6天后测定巨噬细胞群中Ml (CD14+CD1630和M2 (CD14+CD163+)型巨噬细胞的比例。
实施例
[0305]在研究全程中使用以下商业单克隆抗体:抗人⑶115mAb2-4A5_4(大鼠IgG1.κ, Santa Cruz)，9-4D2 (大鼠 IgGl, Biolegend)和同种型对照大鼠 IgG1 (R&D Systems)。mAbl.2SM是在专利申请W02009/026303中公开的序列1.2SM的抗⑶115mAb。利妥昔单抗来自Roche。F(ab’)2由Transgene生产,通过胃蛋白酶消化单克隆抗体,接着通过凝胶过滤纯化。
[0306]人巨噬细胞分化测定:方案
[0307]血沉掠黄色层由Etablissement FtanQEiS du Sang (EFS, Strasbourg)提供。通
过在聚蔗糖梯度上的离心得到外周血单核细胞(PBMC)。通过免疫磁珠细胞分选，使用CD14抗体包被的珠(Miltenyii)纯化单核细胞。富集的单核细胞悬浮物超过95%纯。在补充10%热失活的胎牛血清和1%三种抗生素混合物(青霉素、链霉素、新霉素)的RPM1-Glutamax?培养基中在48孔板(3xl05细胞/孔)中分化单核细胞6天。在第O天至第3天在细胞培养基中添加GM-CSF(10ng/ml)。在第O天添加H27K15、其他抗体或内部对照GW2580 (LCLabs)。在分离后第3天，用PBS洗单核细胞，并在存在或缺乏抗体或GW2580下，在补充CSF-1 (10ng/ml)和GM-CSF(2ng/ml)的培养基中进一步培养。在第6天，收集上清并储存在_20°C。将细胞从塑料表面分离，通过IC/FC (免疫细胞化学/流式细胞术)分析一式三份合并物的细胞大小和Fe Y R和CD86的表达。通过多倍仪(Bioplex，Bio-Rad)或通过ELISA定量培养上清中的细胞因子和趋化因子。
[0308]用于巨噬细胞培养物的IC/FC分析，以1500rpm离心一式三份合并物10分钟并与包含10%人AB血清的PBS在4°C孵育20分钟以饱和Fe受体。然后将荧光染料缀合的mAb抗CD64-APC 和抗 CD86-AI700,抗 CD64,抗 CD86,抗 CD163 和 / 或抗 CD14 (BD Biosciences)与每种样品在4°C孵育20分钟。用PBS洗细胞(5分钟，2000rpm，在4°C下)并用Cell-Fix (BDBiosciences, France)固定。使用 FACS LSR-1I (BD biosciences)进行流式细胞术分析，用DIVA软件采集，用Flow Jo软件分析。
[0309]结果
[0310]抗⑶115mAb H27K15对巨噬细胞没有细胞毒性，但使其分化偏向Ml型。[0311]为了研究mAb H27K15是否可影响巨噬细胞的分化，在存在GM-CSF和CSF-1下培养纯化的⑶14+单核细胞7天，已知GM-CSF和CSF-1分别诱导Ml和M2型巨噬细胞(AkagawaK.S., 2002; Verreck F.A.等人，2004)。在培养开始时和3天后再次对培养基加入3种不同剂量的mab H27K15或同种型对照利妥昔单抗(0.1; I或10 μ g/ml)。以等价摩尔浓度平行检测了从H27K15或从利妥昔单抗生成的F (ab’)2。检测了从mAb1.2SM (W02009/026303)生成的F(ab’)2以与来源于H27K15或利妥昔单抗的F(ab’)2比较。测定了已知的针对人CD115的阻断mAb，2-4A5，或非阻断mAb9_4D2 (Sherr C.J.等人，1989)并与同种型对照大鼠IgGl比较。对一些培养物加入I μ M的小分子⑶115酪氨酸激酶抑制剂GW2580作为另一个对照，此浓度以前显示在体外抑制人单核细胞的CSF-1依赖的增殖和鼠巨噬细胞的分化(Conway J.G.等人，2005; Paniagua R.T.等人，2010)。
[0312]对第6天的培养物的显微镜观察显示，相比未处理细胞，用H27K15，利妥昔单抗，mAb9-4D2，IgGl, H27K15F(ab’)2或利妥昔单抗F(ab’)2处理的孔之间没有明显差异，与供血者无关。对用mAb SM1.2F(ab’)2处理的孔，对所有供体在3种评估剂量(0.066,0.66和6.6 μ g/ml)上观察到完全的细胞毒性。对用mAb2-4A5处理的孔，对所有供体在2个最高检测剂量(I和10 μ g/ml)上观察到完全的细胞毒性。在最低剂量(0.1 μ g/ml)上，仅有部分细胞毒性。总之，这些结果没有显示除了 mAb SM1.2F(ab’)2和mAb2-4A5以外的任何抗体的任何毒性。对用I μ M的对照GW2580处理的细胞，取决于显微镜视野，观察到相对的细胞毒性，因为在所有供血者中观察到细胞碎片和较低的细胞密度。通过计数板上每个孔的5个显微镜视野(I个视野在孔中心，4个视野在孔中心和边的中间)在第6天分析细胞活力。基于上述观察，也对用显示部分或完全细胞毒性的化合物(mAb SM1.2F(ab’)2，mAb2-4A5和GW2580)处理的孔进行计数。图1显示了每个孔计数的5个视野的平均值土标准差。一些抗体显示了部分或全部的细胞毒性。因此，相比其对应的对照，来源于mAb SM1.2的F(ab’)2在所有浓度上引起大量细胞死亡，mAb2-4A5也显著减少了巨噬细胞数。在存在GW2580时，相比未处理的培养物在第6天仍然有约70%的巨噬细胞数。
[0313]通过IC/FC分析第6天培养物的活化Fe Y R⑶64 (Fe Y RI)和活化标记物⑶86的表面表达。如在图2中所示，在用H27K15或用GW2580处理后，⑶64的表面表达显著减少。H27K15在所有检测剂量上几乎完全抑制了⑶64表达。大鼠抗人⑶115mAb2_4A5也减少了表面⑶64表达，但以剂量依赖的方式。非⑶115阻断mAb9-4D2没有改变⑶64表达水平。有趣地是，来源于H27K15的F(ab’)2也下调了⑶64表达，但比完整mAb效力低，仅在以I或10 μ g/ml浓度检测时下调⑶64表达，显示H27K15的作用部分依赖于Fe。
[0314]当在第6天的巨噬细胞中分析活化标记物/共刺激分子CD86的表达时，我们发现在用mb H27K15或用GW2580处理的培养物中出现了⑶86*SSC?表型特征的细胞亚群(图3)。用H27K15来源的F(ab’)2诱导没有观察到此表达高水平⑶86的圆形细胞群，显示H27K15FC区在此现象中的作用。在此群上的门控显示⑶86*SSC?细胞主要是⑶64?至⑶64阴性的(数据未显示)。
[0315]在第6天的培养上清中滴定IL_12p70和IL-10。在存在人IgG1利妥昔单抗或不存在试剂时培养后，检测的3位供体的巨噬细胞没有产生任何可检测的IL-12p70。在存在mAb H27K15下的培养诱导3位供体中的2位的巨噬细胞分泌IL_12p70。相反，在用GW2580处理后没有检测到IL-12p70 (图4)。由所有供体的静息巨噬细胞产生的IL-10在供体I的巨噬细胞中被H27K15上调，但在供体2中未上调，在供体3中仅略微增加。因此，在检测的3位供血者中IL-12p70/IL-10比例上调(图4，右图)。小分子GW2580也增加了 IL_12p70/IL-1O比例，但原因是抑制IL-10产生。
[0316]这些结果显示在分化的巨噬细胞上用mAb H27K15靶向⑶115不仅显著下调⑶64/FcyRI的表达，而且诱导了表达高水平⑶86活化标记物的SSC?细胞群。此外，H27K15可在所有供体中诱导IL-12p70产生和上调IL-12p70/IL-10比例，显示巨噬细胞极化朝向Ml型。
[0317]令人惊讶地是，当在存在mAb H27K15或GW2580时分化巨噬细胞时，发现趋化因子MCP-1/CCL2的产生几乎完全被抑制(图5，上图)。H27K15对MCP-1分泌的抑制在3位检测供体中均有效，范围从74%至99%。小分子GW2580与H27K15 —样有效抑制MCP-1产生。H27K15或GW2580也在所有供体中降低了在第6天的巨噬细胞培养上清中的IL-6水平(图5，下图)。H27K15对IL-6产生的抑制(从27%至70%)没有GW2580显著(从75至96%)。H27K15介导的对涉及M2巨噬细胞极化的2种可溶性因子，即巨噬细胞MCP-1和IL-6产生的抑制(Roca H.等人，2009)是显示抗⑶115mAb使巨噬细胞朝向Ml再极化的另一个证据。
[0318]抗⑶115mAb H27K15抑制在存在GM-CSF和CSF-1下培养的单核细胞的MMP-9产生。
[0319]已知肿瘤相关的 巨噬细胞产生MMP_9(基质金属蛋白酶9)，其通过降解细胞外基质促进肿瘤细胞转移和通过诱导肿瘤微环境中的VEGF释放促进血管新生。巨噬细胞产生的MMP-9是肿瘤中血管生成开关的主要调控物。
[0320]允许3位不同供体的⑶14+单核细胞在存在GM-CSF和CSF-1 二者时分化，已知GM-CSF和CSF-1诱导巨噬细胞分别朝向Ml和M2型分化。以0.1，I或10 μ g/ml的浓度对培养物加入MAb H27K15或利妥昔单抗(用作阴性对照)。平行测定等摩尔浓度的来自两种mAb的F(ab)，2。在相同的测定中检测酪氨酸激酶抑制剂GW2580，其以前显示在体外抑制人单核细胞的CSF-1依赖的增殖和鼠巨噬细胞的分化。培养6天后，通过ELISA在上清中测量MMP-9浓度(图6)。在3位检测供体的2位中，当用mAb H27K15或用GW2580处理培养物时，在MMP-9产生中存在剂量依赖的减少。用来源于H27K15的F(ab) ’ 2处理在相同的2位供体中存在抑制作用。因此，mAb H27K15能够通过分化M2巨噬细胞减少MMP-9分泌。
[0321]在巨噬细胞培养物中的这些观察结果显示，对癌症患者施用H27K15可下调肿瘤微环境中的MMP-9浓度。
[0322]MAb H27K15抑制CD163阳性M2型巨噬细胞的分化
[0323]血红蛋白清除受体(⑶163)已被鉴定为M2极化的巨噬细胞的标记物，其由TAM表达，特别是在乳腺癌中。通过流式细胞术分析在存在GM-CSF和CSF-1下培养的人单核细胞来源的第6天的巨噬细胞中⑶163的表面表达。图7显示了在分化的培养物中的⑶163阳性细胞的百分比。在存在mAbH27K15下培养抑制了所有3位检测供体中的⑶163+巨噬细胞群的分化。在存在I μ g/ml H27K15时，⑶163阳性细胞的百分比相比用利妥昔单抗处理的培养物减少了 2.5至4倍。GW2580仅在2/3的供体中具有相同作用。来源于H27K15的F(ab) ’ 2对⑶163表达具有微弱影响或无影响，显示抗⑶115mAb的Fe区参与其作用模式。
[0324]通过表面⑶163表达中这些变化的证据且与以前的结果一致，用mAbH27K15靶向⑶115抑制M2型巨噬细胞的分化。[0325]MAb H27K15使单核细胞的分化从M2偏移至Ml巨噬细胞
[0326]在存在或缺乏mAb H27K15或利妥昔单抗时，在存在GM-CSF和CSF-1下培养的单核细胞来源的细胞中分析Ml和M2巨噬细胞之间的比例。在2位不同供血者的细胞的6天培养后，通过流式细胞术定量Ml (⑶14+CD163—)对M2(⑶14+⑶163+)巨噬细胞。图8显示了在每种培养条件下在CD14+巨噬细胞群中计算的M1/M2巨噬细胞比例。相比相同浓度的对照IgG1利妥昔单抗或未处理的培养物，I μ g/ml的MAb H27K15增加了 2位检测供体的巨噬细胞中的M1/M2比例。
[0327]Akagawa K.S."Functional heterogeneity of colony-stimulatingfactor-1nduced human monocyte-derived macrophages."International journal ofhematology.(2002) 76 (I): 27-34.[0328]Conway J.G.，McDonald B.，Parham J.，Keith B.，Rusnak D.W.，Shaw
E.，JansenM.，Lin P.，Payne A.，Crosby R.M.，Johnson J.H.，Frick L.，LinM.H., Depee S., Tadepalli S., Votta B., James 1., Fuller K., Chambers T.J., Kull
F.C.，ChamberlainS.D.and Hutchins J.T."Inhibition of colony-stimulating-factor-1signaling in vivo with the orally bioavailable cFMS kinase inhibitorGW2580."Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica.(2005) 102 (44): 16078-16083.[0329]Paniagua R.T.，Chang A., Mariano M.M.，Stein E.A., W ang Q., LindstromT.M., Sharpe 0., Roscow C., Ho P.P., Lee D.M.and Robinson W.H.〃c-Fms_mediateddifferentiation and priming of monocyte lineage cells play a central role inautoimmune arthritis."Arthritis research&therapy.(2010)12 (I):R32.[0330]Roca H., Varsos Z.S.，Sud S.，Craig M.J., Ying C.and Pienta K.J."CCL2andinterleukin_6promote survival of human CDllb+peripheral blood mononuclearcells and induce M2~type macrophage polarization.〃The Journal of biologicalchemistry.(2009)284(49):34342-34354.[0331]Sherr C.J.，Ashmun R.A.，Downing J.R.，Ohtsuka M.，Quan S.G.，Golde D.W.andRoussel M.F."Inhibition of colony-stimulating factor-lactivity by monoclonalantibodies to the human CSF-lreceptor."Blood.(1989)73(7):1786-1793.[0332]Verreck F.A.，de Boer T., Langenberg D.M.，Hoeve M.A., Kramer M., VaisbergE.,Kastelein R.,Kolk A.,de Waal-Malefyt R.and Ottenhoff T.H."HumanIL-23-producing typelmacrophages promote but IL-10-producing type2macrophagessubvert immunity to (myco)bacteria."Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America.(2004) 101 (13):4560-4565.
【权利要求】
1.在患有与不期望的M2活化相关的病症的患者中增加Ml巨噬细胞库的方法，其中所述方法包括对所述患者施用有效量的能够结合CSF-1R的抗体的步骤。
2.权利要求1的方法，其中所述患者还患有与CSF-1R活性相关的病症。
3.任一前述权利要求的方法，其中所述方法减少M2巨噬细胞库。
4.任一前述权利要求的方法，其中所述方法抑制巨噬细胞的MCP-1，ILlO和IL-6的产生。
5.任一前述权利要求的方法，其中所述方法下调巨噬细胞上的表面FcyRI(CD64)和Fe yRIII(CD16)表达。
6.任一前述权利要求的方法，其中所述方法促进巨噬细胞的IL-12产生。
7.任一前述权利要求的方法，其中所述方法减少下述至少一项: (i)将TAM募集至肿瘤； (?)至少一种巨噬细胞促肿瘤功能； (iii)肿瘤血管生成； (iv)肿瘤侵袭和转移； (V)肿瘤生长； (vi)肿瘤细胞增殖。
8.任一前述权利要求的方法，其中所述与不期望的M2活化相关的病症选自癌症、哮喘、变态反应和进行性纤维化疾病。
9.任一前述权利要求的方法，其中所述能够结合CSF-1R的抗体是结合位于SEQIDNO:23的氨基酸位置20至41之间的至少一个表位的抗体。
10.任一前述权利要求的方法，其中所述能够结合CSF-1R的抗体是结合SEQID NO: 23的氨基酸位置20至39之间的一个表位，结合SEQ ID NO: 23的氨基酸Asn72，Ser94_Ala95-Ala96, Lysl02, Aspl31-Prol32-Vall33 和 Trp159 的抗体。
11.任一前述权利要求的方法，其中所述能够结合人CSF-1R的抗体是不与IL-34配体竞争结合CSF-1R受体的抗体。
12.任一前述权利要求的方法，其中所述能够结合人CSF-1R的抗体是与CSF-1配体部分竞争结合CSF-1R受体的抗体。
13.任一前述权利要求的方法，其中所述能够结合人CSF-1R的抗体是特异性结合人CSF-1R的抗体，其包括: Ca)通过下式定义的第一可变区 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中: FR1、FR2、FR3和FR4各为构架区； ⑶R1、⑶R2和⑶R3各为互补决定区； 其中: ⑶Rl具有SEQ ID NO:1中起始于45位并结束于54位的序列中的至少五个连续氨基酸； ⑶R2具有SEQ ID NO:1中起始于66位并结束于87位的序列中的至少五个连续氨基酸；和⑶R3具有SEQ ID NO:1中起始于117位并结束于126位的序列中的至少五个连续氨基酸； 和 (b)通过下式定义的第二可变区 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中: FR1、FR2、FR3和FR4各为构架区； ⑶R1、⑶ R2和⑶R3各为互补决定区； 其中: ⑶Rl具有SEQ ID NO:2中起始于44位并结束于56位的序列中的至少五个连续氨基酸； ⑶R2具有SEQ ID NO:2中起始于66位并结束于76位的序列中的至少五个连续氨基酸；和 ⑶R3具有SEQ ID N0:2中起始于109位并结束于117位的序列中的至少五个连续氨基酸。
14.任一前述权利要求的方法，其中所述能够结合CSF-1R的抗体包含(a)存在于SEQID NO: 24中的重链和(b)存在于SEQ ID NO: 28中的轻链。
【文档编号】C07K16/28GK103958546SQ201280051686
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年10月19日 优先权日:2011年10月21日
【发明者】H·埃热尔, R·哈利特 申请人:特朗斯吉有限公司