识别α-突触核蛋白的人源化抗体的制作方法

识别α-突触核蛋白的人源化抗体的制作方法
【专利摘要】本申请公开了人源化9E4抗体。所述抗体结合人类α-突触核蛋白且可用于路易体病的免疫治疗。
PTA-8221
2007.02.26
【专利说明】识别α-突触核蛋白的人源化抗体 相关专利申请参照
[0001] 本申请主张美国临时专利申请号为61/553131，申请日为2011年10月28日的申 请的优先权，以及美国临时专利申请号61/711208，申请日为2012年10月8日的申请，两份 专利申请的整体均作为本申请的参照。 序列清单参考
[0002] 文件424859SEQLIST. txt中记录的序列清单的大小为34千字节，其生成于2012 年10月24日，在此并入参考。

【背景技术】
[0003] 突触核蛋白病也被称为路易体病（LBDs)，其特点是多巴胺能系统退化、 运动障碍、认知障碍，并形成路易体（LBs)和/或路易神经突的变性（McKeith et al.，Neur〇l〇gy(1996)47:1113-24)。共核蛋白病，包括帕金森氏病（包括特发性帕金森 病），弥漫性路易体病（DLBD)也被称为路易体痴呆（DLB)，路易体的变种阿尔茨海默病 (LBV)，组合阿尔茨海默氏症和帕金森氏病，纯自主神经功能衰竭和多系统萎缩（MSA ;例 如，橄榄体脑桥小脑萎缩，纹状体黑质变性和希-德二氏综合征）。几个非运动症状和 体征被认为是在共核蛋白病的前驱期（即症状前、亚临床、临床前或运动前期间）的先 兆。这样的早期迹象包括，例如，REM睡眠行为障碍（RBD)，嗅觉丧失和便秘（Mahowald et al.，Neurology (2010) 75:488-489)。路易体病仍然是一个运动障碍和人口老龄化的认知功 能减退的常见原因 （Galasko et al·，Arch. Neurol. (1994)51:888-95)
[0004] α-突触核蛋白是一个大蛋白质家族的一部分，包括β-和Y-突触核蛋白 和synoretin。α-突触核蛋白在正常状态与突触相关联，并且被认为在神经可塑性， 学习和记忆中发挥作用。一些研究已经表明α-突触核蛋白与帕金森病发病机制中 发挥中心作用。该蛋白可聚集形成在病理条件下的不溶性纤维。例如，突触核蛋白在 路易体中聚集（5口:111&111:;[1116七&1.，似1：11代（1997)388:839-40;1&1^(136七&1.，]\ Pathol. (1998) 152:367-72 ；ffakabayashi et al. , Neurosci. Lett. (1997)239:45-8)〇 α-突触核蛋白的基因突变共同隔离与罕见的家族性形式的帕金森综合征（Kruger et al. , Nature Gen. (1998) 18:106-8 ；Polymeropoulos, et al. , Science(1997)276:2045-7)〇 在转基因小鼠 （Masliah et al·, Science(2000)287:1265-9)和果蝇（Feany et al.，Nature(2000)404:394-8)的α-突触核蛋白变化研究中模拟了路易体病的几个病 理方面。此外，研究已经表明，突触核蛋白的可溶性低聚物可能具有神经毒性（Conway KA, et al.,Proc Natl Acad Sci USA(2000)97:571 576 ；VollesMJ, Lansbury PT,Jr Biochemistry (2003) 42:7871 7878)。a -突触核蛋白在相似的形态和神经系统的积累人 类，小鼠，和苍蝇这些不同物种和动物模型中的变化表明，这种分子利于路易体病的发展。


【发明内容】

[0005] 本发明提供一种抗体，包括具有序列SEQ ID NO: 11的三个Kabat互补决定区的 成熟重链可变区，所述成熟重链可变区至少90%与序列SEQ ID N0:11相同，以及具有序 列SEQ ID NO:4的三个Kabat互补决定区的轻链，所述轻链至少90%与序列SEQ ID NO:4 相同。在一些抗体中，重链成熟可变区显示了与SEQ ID NOs: 11至少有95%，96%，97%， 98%，或99%是相同的，轻链成熟可变区显示了与SEQ ID N0s:4至少有95%，96%，97%， 98%，或99%的序列是相同的。在某些位置的L36 (Kabat编号方式）可被Y或F占用、位 置L83 (Kabat编号）可被F或L占用、位置H73 (Kabat编号方式）可被N或D占用及位置 H93 (Kabat编号）可被由A或S占用。在一些此类抗体的成熟重链可变区的氨基酸序列与 SEQ ID NO :11不同和成熟的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO :4不同。
[0006] 在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID N0:8 :8和成熟 的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID N0:8:3。在一些抗体中，成熟的重链可变区 具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :8和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :4。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :8和成熟的轻 链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :5。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指 定的氨基酸序列SEQ ID NO :9和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :3。 在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :9和成熟的轻链可变 区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :4。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨 基酸序列SEQ ID NO :9和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :5。在一些 抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :10和成熟的轻链可变区具有 指定的氨基酸序列SEQ ID NO :3。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序 列SEQ ID NO :10和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :4。在一些抗体 中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :10和成熟的轻链可变区具有指定 的氨基酸序列SEQ ID NO :5。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :11和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :3。在一些抗体中，成熟 的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :11和成熟的轻链可变区具有指定的的氨 基酸序列SEQ ID NO :4。在一些抗体中，成熟的重链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :11和成熟的轻链可变区具有指定的氨基酸序列SEQ ID NO :5。
[0007] 本发明进一步提供了一种抗体，其包含3个SEQ ID NO: 11中的Kabat互补决定区 的人源化重链和一个包含三个SEQ ID N0:4中的互补决定区的人源化轻链，其中（provided that)位置L36 (Kabat编号）由F或Y占据和/或位置L83 (Kabat编号）是由L或F和/ 或位置H73 (Kabat编号）被占据为D或N，和/或位置H93 (Kabat编号）由S或A占据。在 一些这种抗体，位置L36 (Kabat编号）是由F占据和位置H73 (Kabat编号）由D占据，位置 H93(Kabat编号）是由S占据。在一些此类抗体，位置L36是由F占据。在一些此类抗体， 位置L83是由L占据。在一些此类抗体，位置L36由F占据和位置H73是由D占据。在一 些这样的抗体，位置L83被L占据，在一些此类抗体H73的位置是由D占据。在一些此类抗 体，位置H93是由A占据。在一些此类抗体，位置L36由F占据和位置L83是由L占据。在 一些此类抗体，位置L36由F占据和位置H73是由D占据。在一些此类抗体，位置L36由F 占据和位置H93是由A占据。在一些此类抗体，位置L36由F占据，位置L83由L占据和位 置H73由D占据。在一些此类抗体，位置L36由F占据，位置L83由L占据和位置H93由A 占据.有一些这样的抗体，位置L36为F被占据，位置L83由L占据，位置H73是由D占据和 位置H93由A占据。在一些这样的抗体，残留在位置L36, L83, H73和H93(Kabat编号）是 由氨基酸如表1所示由F占据和位置H73 (Kabat编号）由D占据，位置H93 (Kabat编号）是 由A占据。在一些这样的抗体，位置L36(Kabat编号）由F和位置H93(Kabat编号）是由S 占据。在一些此类抗体占据，位置H73(Kabat编号）是由D占据和位置H93占据（Kabat编 号）是由S。在一些这样的抗体，位置H73 (Kabat编号方式）是由D占据和位置H93 (Kabat 编号）由A占据。在一些这样的抗体，位置H93 (Kabat编号）是由S占据。在一些这样的 抗体，位置H73 (Kabat编号）是由N占据。在一些此类抗体，位置L36 (Kabat编号）由F占 据，位置L83 (Kabat编号）由L占据，位置H73 (Kabat编号）为D占据，位置H93 (Kabat编 号）是由S占据。在一些此类抗体，位置L36 (Kabat编号）由F占据，位置L83 (Kabat编 号）是由L占据和位置H93 (Kabat编号）由S占据。
[0008] 任何上述抗体，成熟重链可变区可以被融合到一个重链恒定区和成熟轻链恒定区 可以融合到一个轻链恒定区。
[0009] 上述任何抗体，重链恒定区可以是天然人类恒定区的突变形式，所述重链恒定区 与Fe Y受体的结合力低于所述天然人类恒定区与Fe Y受体的结合力。
[0010] 上述任何抗体中，重链恒定区可以是人类IgGl同种型。在一些抗体，同种异型为 Glm3。在一些抗体中，同种异型是Glml。 toon] 本发明进一步提供了一种对于任何上述的成熟重链可变区和/或任何上述的成 熟轻链可变区核酸编码，例如，SEQ ID NO: 15、17、18、19和20。
[0012] 本发明还提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞含有载体,所述载体包含有任何上 述核酸。
[0013] 本发明进一步提供了 一种治疗患有路易体病或具有得路易体病风险的患者的方 法，包括给患者施用的任何上述抗体的有效方案。在一些方法中，所述疾病是帕金森氏病。 在一些方法中，患者的认知功能下降受到抑制。在一些方法中，神经炎性和/或轴突α -突 触核蛋白聚集减少。在一些方法中，在患者神经炎营养不良降低。在一些方法中，突触和/ 或树突状密度得以保留。在一些方法中，该方法在患者中保留突触素和/或MAP2。
[0014] 本发明进一步提供了 一种治疗患有路易体病或具有得路易体病风险的患者的方 法，包括给患者施用的任何上述抗体的有效方案。在一些方法中，所述疾病是帕金森氏病。 在一些方法中，所述疾病是REM睡眠行为障碍（RBD)。在一些方法中，所述疾病是路易体痴 呆（DLB)或者多系统萎缩（MSA)。在一些方法中，患者的认知功能下降受到抑制。在一些方 法中，神经炎性和/或轴突α-突触核蛋白聚集减少。在一些方法中，在患者神经炎营养不 良降低。在一些方法中，突触和/或树突状密度得以保留。在一些方法中，该方法在患者中 保留突触素和/或MAP2。
[0015] 本发明进一步提供了在患有或在具有患路易体病风险的病人中检测路易体病的 方法，包括向所述患者施用有效量的任何上述抗体，其中结合到路易体病的所述抗体和联 胞抗体可以被检测。在一些方法中，所述疾病是帕金森氏病。在一些方法中，所述疾病是路 易体痴呆（DLB)或者多系统萎缩（MSA)。在一些方法中，抗体被标记。
[0016] 本发明进一步提供了一种降低在h有或在存在患有路易体疾病的风险的患者身 上形成路易体的方法，其包括给患者施用的任何有效量上述抗体的一种方法。在一些方法 中，所述疾病是帕金森氏病。在一些方法中，所述疾病是路易体痴呆（DLB)或者多系统萎缩 (MSA)。在一些方法中，患者的认知功能下降受到抑制。在一些方法中，神经炎性和/或轴 突α-突触核蛋白聚集减少。在一些方法中，在患者神经炎营养不良降低。在一些方法中， 突触和/或树突状密度得以保留。在一些方法中，该方法在患者中保留突触素和/或MAP2。
[0017] 本发明进一步提供了一种抑制突触核蛋白聚集或清除在患或有路易体疾病风险 的病人中的路易体或突触核蛋白的方法，其包括给患者施用的任何有效量的上述抗体的一 种方法。在一些方法中，所述疾病是帕金森氏病。在一些方法中，本病是路易体痴呆（DLB) 或者多系统萎缩（MSA)。在一些方法中，患者的认知功能下降受到抑制。在一些方法中，神 经炎性和/或轴突α-突触核蛋白聚集减少。在一些方法中，患者神经炎营养不良减小。在 一些方法中，突触和/或树突状密度得以保留。在一些方法中，该方法保留在患者中的突触 素和/或ΜΑΡ2。
[0018] 本发明进一步提供了包含任何上述抗体的一种药物组合物。
[0019] 本发明进一步提供了一种制备抗体的方法，包括通过核酸编码所述抗体的重链和 轻链转化培养细胞，使细胞分泌抗体；然后从细胞培养基中纯化所述抗体；其中所述抗体 是可以是以上描述的任何抗体。
[0020] 本发明进一步提供了一种制备细胞系产生抗体的方法，包括将编码抗体重链和轻 链的载体和选择性标记物引入细胞；在适合环境下繁殖细胞来选择具有增加的载体拷贝数 量的细胞，从所选择的细胞中分离单个细胞；将基于抗体产量选择的单细胞所克隆的细胞 建库（banking);其中所述抗体可以是以上描述的任何抗体。某些这样的方法还包括选择 性的条件下繁殖细胞和筛选细胞系,其自然表达和分泌至少100 mg/L/106CeHsGAri。

【专利附图】

【附图说明】 图1为携带人源化9E4重链成熟可变区的亲本鼠科mAb (被称为m9E4)的氨基酸序列 排列。1791009Hu9E4VHFr(SEQ ID N0:7)是人类受体 VH 序列。
[0022] 图2为携带人源化9E4轻链成熟可变区的亲本鼠科mAb (被称为m9E4)的氨基酸 序列排列。63102889Hu9E4VLFr(SEQ ID N0:2)是人类受体VL序列。根据Kabat定义的互 补决定区区域有下划线和粗体。
[0023] 图3为在莫里斯水迷宫测试的记忆表现上使用9E4被动免疫治疗的结果。
[0024] 图4为在圆梁测试的速度和差错上使用9E4被动免疫治疗的结果。
[0025] 图5为针对从染病组织传染的抗原的各种版本的人源化9E4抗体的免疫沉淀 反应。Ch9E4:嵌合体的 9E4 ;HlL3:Hu9E4VHvl-Hu9E4VLv3 ;H3L2:Hu9E4VHv3-Hu9E4VLv2 ; H3L3:Hu9E4VHv3-Hu9E4VLv3 ;N. S.=非特异性的。
[0026] 图6为具有小鼠、嵌入式生物体和人源化9E4抗体的重组人类突触核蛋白的免疫 印迹。 序列的简要说明 SEQ ID N0:1是m9E4VL可变区的氨基酸序列。 SEQ ID N0:2是63102889Hu9E4VLFr可变区的氨基酸序列。 SEQ ID N0:3是Hu9E4VLvl可变区的氨基酸序列。 SEQ ID N0:4是Hu9E4VLv2可变区的氨基酸序列。 SEQ ID N0:5是Hu9E4VLv3可变区的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 6是m9E4VH可变区的氨基酸序列。 SEQ ID N0:7是1791009Hu9E4VHFr可变区的氨基酸序列。 SEQ ID N0:8是Hu9E4VHvl可变区的氨基酸序列。 SEQ ID N0:9是Hu9E4VHv2可变区的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 10是Hu9E4VHv3可变区的氨基酸序列。 SEQ ID N0:11是Hu9E4VHv4可变区的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 12是天然的人类野生型α-突触核蛋白的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 13是人源化9Ε4轻链恒定区的氨基酸序列，以及在N端的精氨酸。 SEQ ID NO: 14是人源化9E4轻链恒定区的氨基酸序列。 SEQ ID N0:15是Hu9E4VLvl可变区的核苷酸序列。 SEQ ID NO: 16是Hu9E4VLv2可变区的核苷酸序列。 SEQ ID NO: 17是Hu9E4VLv3可变区的核苷酸序列。 SEQ ID N0:18是Hu9E4VHvl可变区的核苷酸序列。 SEQ ID NO: 19是Hu9E4VHv2可变区的核苷酸序列。 SEQ ID N0:20是Hu9E4VHv3可变区的核苷酸序列。 SEQ ID N0:21是Hu9E4VHv4可变区的核苷酸序列。 SEQ ID N0:22是Hu9E4VL信号肽的氨基酸序列。 SEQ ID N0:23是Hu9E4VL信号肽的核苷酸序列。 SEQ ID NO: 24是Hu9E4VH信号肽的氨基酸序列。 SEQ ID NO: 25是Hu9E4VH信号肽的核苷酸序列。
[0027] SEQ ID N0:26是Hu9E4VL共有区的氨基酸序列。
[0028] SEQ ID N0:27是Hu9E4VH共有区的氨基酸序列。
[0029] SEQ ID NO: 28是人源化9E4轻链恒定区的氨基酸序列，无在N端的精氨酸。
[0030] SEQ ID NO: 29是在版本3人源化9E4的包括（a) -个可变区和（b) -个恒定区的 轻链的氨基酸序列，以及在N端的精氨酸。
[0031] SEQ ID NO: 30是在版本3人源化9E4的包括（a) -个可变区和（b) -个恒定区的 轻链的氨基酸序列，不带在N端的精氨酸。
[0032] SEQ ID NO: 31是在版本3人源化9E4的包括一个可变区和一个恒定区的重链的氨 基酸序列。
[0033] SEQ ID NO: 32是在BIP版本人源化9E4的重链Glm3异型恒定区的氨基酸序列。
[0034] 单克隆抗体通常是以隔离形式提供的。这意味着一种抗体中蛋白质和由生产和净 化中产生的其他高分子通常至少有50%的w/w纯度，但是不排除单克隆抗体混合着过量药 物可接受的载体或其他促进它使用的载体的可能性。有些时候单克隆抗体重蛋白质和由生 产和净化中产生的其他高分子有至少60%、70%、80%、90%、95或者99%的w/w纯度。 单克隆抗体的特异性结合成靶抗原意味着至少106、107、108、109或者1010M-1的纯 化。特异性结合强度更高，且可区别于发生在至少一个不相关的目标上的非特异性结合。特 异性结合可以是特定功能群或者特定合适空间（例如锁和钥匙类型）之间化学键形成的结 果，而非特异性结合通常是范德华引力的结果。但是特异性结合不是必然意味着一种单克 隆抗体结合有且只有一个目标。 基本的抗体结构单元是一个具有若干子单元的四聚体。每一个四聚体包含两对完全相 同的多肽链，每一对有一个轻链（约25kDa)和一个重链（约50-70kDa)。每个链的氨基末 端部分包括约100到110或者更多主要负责抗原识别的氨基酸的可变区。这种可变区最初 的表达与可分裂的信号肽相关联。没有信号肽的可变区有时候作为一种成熟的可变区被提 及。所以，例如，一个轻链的成熟可变区意味着一个轻链的没有轻链信号肽的可变区。每个 链的羧基端部分界定主要负责效应功能的恒定区。 轻链被分类为kappa或者lambda。重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或者 epsilon,且抗体的同型性分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链之中，可变 区和恒定区中加入了一个约12个或者更多氨基酸的"J"形区域，且重链中还包含一个约10 个或者更多氨基酸的"D"形区域。（另参见，Fundamental Immunology (Paul, W.，ed·，2nd ed. Raven Press, N. Y. , 1989, Ch. 7, incorporated by reference in its entirety for all purposes).
[0035] 每一个轻/重链对的成熟的可变区形成抗体结合位置。这样，一个完整的抗体 有两个结合位置。除了双功能的或者双特异的抗体，两个结合位置是一样的。链都展示 出相同的由三个变异度高的区域构成的相对保守的框架区域（FR)的基本结构，也称为互 补决定区或者CDRs。每一对的两条链上的CDRs是按框架区域排列的，能够结合一个特 定的抗原决定基。从N端到C端，轻链和重链都是由域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和FR4组成的。氨基酸在每个域的排布与Kabat的定义、Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987andl991) 或者 Chothia&Lesk, J. Mol. Biol. 196 : 90 1-9 17 (1987) ;Chothia et al.，Nature342:878-883 (1989)是一致的。Kabat还提供一个广泛使用的编号规定（Kabat 编号），使得不同重链之间或不同的轻链之间的对应残基被赋予相同的编号（例如，Kabat 编号H83表示在成熟的重链可变区中position83 ;同样的，Kabat编号position L36表示 在轻链可变区中P〇sition36)。
[0036] 术语"抗体"包括完整的抗体及它的结合片段。通常来说，在为了特定的与包括单 独的重链、轻链 Fab、Fab'、F (ab，）2、F (ab) c、diabodies、Dabs、nanobodies 及 Fv 等目标的 结合，片段与完整的抗体在衍生的过程中相互竞争。片断能够由DNA重组技术产生，或者靠 酶或完整免疫球蛋白的化学分离。术语"抗体"还包含一个双特异性抗体和/或一个人源化 抗体。双特异性抗体或双功能抗体是有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位置（参 考例子Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol. , 79:315-321 (1990) ；Kostelny et al.，J. Immunol. 148:1547-53(1992))的人源化杂合抗体。在一些双特异性抗体中，两个不 同的重/轻链对包括一人源化9E4重链/轻链对和一特定不同抗原决定基的α -突触核蛋 白的不同于受9Ε4结合的重链/轻链对。人源化抗体在以下节IV B中概括地讨论。
[0037] 术语"抗原决定基"涉及抗原上与抗体结合的位置。一个抗原决定基可以由连续 的氨基酸或非连续的一种或多种蛋白质三次折叠排列的氨基酸形成。由连续的氨基酸形 成的抗原决定基通常暴露存放在变性溶剂中，而三次折叠形成的抗原决定基通常在处理 变性溶剂时丢失。一个抗原决定基在一个独特的空间构象中通常包括至少3种，经常会更 多，至少5个或8-10个氨基酸。决定抗原决定基的空间构象的方法包括，例如，X-射线晶 体和二维核磁共振。参见例子 Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)。
[0038] 识别到相同或者重叠的抗原决定基的抗体能够在一个简单的能显示一个抗体与 另一抗体结合一靶抗原相互竞争能力的免疫测定中被识别。一个抗体的抗原决定基也可以 由与其抗原相结合的抗体的X-射线晶体来定义以识别相接触的残基。备选地，如果降低或 消除一种抗体的结合的抗原中的所有氨基酸突变降低或消除另一种抗体的结合，那么这两 种抗体有相同的抗原决定基。如果一些降低或消除一种抗体的结合的氨基酸突变降低或消 除另一种抗体的结合，那么这两种抗体有重叠的抗原决定基。
[0039] 在抗体之间的竞争是由一种受测试的抗体抑制参考抗体与共同抗原特异性结合 的化验所决定的（参考例子Junghans et al.，Cancer Res. 50:1495, 1990)。如果一种测试 抗体的过量（例如，至少2X、5x、l〇X、2〇 X或者IOOx)对参考抗体结合的抑制在一个竞争性 结合试验中测量达到至少50%，但是优选75^^90%或99%，那么这种测试抗体与该参考 抗体相互竞争。竞争性试验中识别的抗体（竞争性抗体）包括与相同的抗原决定基结合的 抗体，正如参考抗体以及与相邻的抗原决定基相结合的抗体，所述抗原决定基足够靠近与 参考抗体相结合的抗原决定基以发生空间位阻效应。
[0040] "病人"包括人类或者其他接受预防性或治疗性治疗的哺乳动物对象。
[0041] 为了将氨基酸替代分类为保守的或者非保守的，氨基酸分组如下：第一组（疏水 性侧链）：met, ala, val, leu, ile ;第二组（中性亲水性侧链）：cys, ser, thr ;第三组（酸 性侧链）：asp, glu ;第四组（基本侧链）：asn, gin, his, lys, arg ;第五组（影响链取向的残 基）：gly,pro;和第六组（芳香族侧链）：trp,tyr,phe。保守置换牵涉同一类中氨基酸之 间的取代。非保守取代构成这些类别中其中一个类别的成员与另一类别的成员的交换。
[0042] 百分比序列特性是与Kabat编号规定的最大限度地排列的抗体序列一起确定的。 在排列后，如果一主体抗体区域（例如一个重链或者轻链的完整的成熟可变区）与一个参 考抗体的相同区域作比较，在主体和参考抗体区域之间的百分比序列特性是被既在主体又 在参考抗体中的相同的氨基酸所占据的位置的数目除以两个区域排列的位置的总数目，不 计间隙，再乘以100以转换为百分比。
[0043] "包含"一种或多种被列举的元素的成分或方法可能包括其他没有特别列举到的 元素。例如，一种包含抗体的成分可能含有单独的抗体或者混合着其他成分的抗体。
[0044] 值的范围的指定包含范围内或限定范围内所有整数，以及在范围内的整数定义的 所有子范围。
[0045] 除非上下文另有清楚地看出，术语"约"包括规定值的扫描电子显微镜中的值。
[0046] 如果主体具有至少一个已知的危险因素（例如遗传、生化、家族史、环境暴露），统 计学上讲该危险因素使带有该危险因素的个体相比于没有带危险因素的个体处于疾病发 展风险更显著的境地，那么个体处于疾病的风险就会增加。
[0047] 术语"症状"涉及疾病的主观证据，例如改变了的步态，正如病人所感知到的。"病 征"涉及疾病的客观证据，正如医生所观察到的。
[0048] 统计显著性表不p <0· 05。
[0049] "认知功能"涉及心理过程，例如注意力、记忆力、产生和理解语言、解决问题，并对 自身周围的事物和自我保护产生兴趣中的任意一个或全部。
[0050] "增强认知功能"或者"改善认知功能"涉及一种相对于基线的改善例如，诊断或初 始治疗。"认知功能的衰退"涉及一种相对于所述基线的功能下降。
[0051] 在动物模型系统中国，如大鼠或小鼠，认知功能可以通过使用迷宫的方法来测定， 在该迷宫中主体使用空间信息（例如Morris水迷宫，巴恩斯圆形迷宫，高架旋臂迷宫，T迷 宫等）、恐惧条件、主动回避、照亮的矿场、暗活度计，高架十字迷宫，双室探索性测试或强迫 性游泳测试。
[0052] 在人类中，认知功能可以由一个或好几个标准化测试来测量。测试例或者认知功 能测定已有描述（Ruoppila, I. and Suutama, T. Scand. J. Soc. Med. Suppl. 53, 44-65, 1997) 并且包括标准化心理测试（例如韦氏记忆量表，韦氏成人智力量表，瑞文标准推理， Schaie-瑟斯顿成人心理能力测试）、神经心理测验（例如Luria-Nebraska)、元认知自我评 价（例如元记忆问卷）、视觉空间检测（例如Poppelreuter的图，时钟识别，蜂窝绘图及取 消）、认知筛选测验（例如Folstein的简易精神状态测试）以及反应时间测试。其他认知 能力的标准测试包括阿尔茨海默病评估量表认知分量表（ADAS-cog);变更规模的临床总 体印象（CIBIC-plus scale);日常生活能力量表阿尔茨海默病合作研究活动（ADCS-ADL); 简易精神状态检查（MMSE);神经精神量表（NPI);临床痴呆评定量表（CDR);剑桥神经心理 测试自动电池（CANTAB)或者山德士的老年临床评估（SCAG)、斯特鲁测验、路径描绘测验、 韦氏数字广度测试和CogState计算机化认知测试。除此以外，认知功能可使用成像技术来 测量，例如正电子发射断层扫描（PET)，功能性磁共振成像（fMRI)，单光子发射计算机断层 扫描（SPECT)，或者任何其他允许测量大脑功能的成像技术。 详细说明 I. 基本内容
[0053] 本发明提供了人源化9E4抗体。所述抗体对路易体疾病的治疗和诊断有用。 II. 祀分子
[0054] 天然的人类野生型α -突触核蛋白是一种140种氨基酸的有如下氨基酸序列的 肽： MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYVGSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQKTVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDPDNEAYEMPSE EGYQDYEPEA(SEQ ID NO:12) (Ueda et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993)90:11282-6) ；GenBank accession number:P37840)。所述蛋白有三个公认的域，一个涵盖氨基酸1-61的KTKE重复域，一个跨 越氨基酸60-95的NAC (非淀粉样蛋白成分）域，以及一个跨越约氨基酸98到140的C端 酸性结构域。
[0055] 除非本文另有明显说明，参考α-突触核蛋白或其片段包括上述指示的人类的 天然野生型氨基酸序列，以及其人类等位基因变体，特别是那些与路易体病相关的（例如 E46K、A30P和A53T，具有指示SEQIDN0:12中的氨基酸的首字母，在SEQIDN0:12中表示 密码子位置的数字，以及表示等位变体中氨基酸的第二个字母）。此类变体能够可选地单独 存在或以任何下面描述的本发明的任何一个方面中的任何组合形式存在。提高α-突触核 蛋白聚合的诱发突变E83Q、A90V、A76T，也可以单独存在或者以与其他和/或人类等位基因 变异体E46K、A30P和A53T结合形式存在。 III. 路易体病
[0056] 路易体病（LBD)的特点是多巴胺能系统、运动机的改变、认知障碍，以及路易体 (LBs)形成的退化。（McKeith et al·，Neurology (1996) 47:1113-24)。路易体是在神经细 胞中发现的球状蛋白质沉淀。其在大脑中的存在扰乱大脑的正常功能，即中断包括乙酰胆 碱和多巴胺的化学信使的反应。路易体病包括帕金森氏病（包括特发性帕金森病），又名路 易体痴呆（DLB)的弥漫性路易体病（DLBD)，阿尔茨海默病的路易体变种（LBV)，阿尔茨海默 氏症和帕金森病，以及如多系统萎缩（MSA ;例如橄榄体脑桥小脑萎缩，纹状体黑质变性和 Shy-Drager综合征）。DLBD共有阿尔茨海默氏症和帕金森氏病的症状。DLBD不同于帕金 森氏症主要表现在路易体的位置。在DLBD中路易体主要在皮层中形成。在帕金森氏病中， 它们主要在黑质中形成。其他路易体病包括单纯性自主神经衰竭，路易体吞咽困难，偶然性 路易体病，以及遗传路易体病（例如，α -突触核蛋白基因的突变，PARK3和PARK4)。 IV. 本发明的抗体 Α.结合特异性和功能特性 本发明人源化抗体具体结合人类α-突触核蛋白。若干人源化抗体（即Ka抗体）的 亲和力最好是鼠抗体9Ε4的五倍或者二倍。若干人源化抗体有一种与鼠9Ε4抗体相同或更 强的亲和力。优选的人源化抗体结合相同的抗原决定基和/或与鼠抗体9Ε4竞争结合人类 α-突触核蛋白。 在若干抗体中，人源化9Ε4 -端连接双特异抗体，另一端连接血脑屏障表现的与 受体结合的一种抗体，例如胰岛素受体，胰岛素生长因子（IGF)受体，瘦素受体，脂蛋 白受体，或优选转铁蛋白受体（Friden et al.，PNAS88:4771-4775, 1991 ;Friden et al.，Science259:373-377, 1993)。受体中介的转运可以穿过血脑屏障转移这种双特异抗 体。通过构建所述双特异抗体降低与血脑屏障受体的亲和力，从而进一步增强大脑对双特 异抗体的吸收，对受体亲和力的降低使双特异抗体在大脑中分布更广（参见，例如，Atwal. et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011 ;Yu et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011)。 实施例的双特异抗体也可以是（I)双重可变结构域抗体（DVD-Ig)，其中每 条轻链和重链包含通过短肽连接串联的两个可变结构域（Wu et al.，Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig ) Molecule, In:Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg(2010)) ； (2)Tandab, 这是两种单链双抗体的融合体，其产生四价的双特异性抗体，其具有两个针对每一种目标 抗原的结合位点；（3) f Iexibody,这是scFv与双抗体的组合,产生多价分子；(4)基于蛋白 激酶A中"二聚化和锚结构域"的所谓的"锚和锁（dock and lock)"分子，当应用于Fabs时， 其可以产生由两个相同的Fab片段和与之连接的不同的Fab片段组成的三价双特异性结合 蛋白；（5)所谓的蝎子分子（Scorpion molecule),其包含，例如，融合于人类Fc区的两个末 端的两个scFv。用于制备所述双特异性抗体平台的例子包括但是不限于BiTE(Micromet)， DART (MacroGenics)，Fcab 和 Mab2 (F-star)，Fc-工程 IgGl (Xencor)或 DuoBody (基于 Fab 臂交换，Genmab). B.人源化抗体 人源化抗体是一种基因工程抗体，其中来自于互补决定区从非人类"供体"抗体移植 到人类"受体"抗体序列中的（参见，例如，Queen et al.，US5,530，101and5,585,089; Winter et al. , US5, 225, 539, Carter, US6, 407, 213, Adair, US5, 859, 2056, 881, 557, Fo ote, US6, 881, 557)。所述受体抗体序列可以是，例如，一个成熟人类抗体可变区序列，这 种序列的组合物，人类抗体序列的共有序列（例如，light and heavy chain variable region consensus sequences of Kabat, 1991，supra)，或一个种系可变区序列。重链 的更优序列是有NCBI登录号AAC50998 (GI :1791009)的人类成熟重链可变区或由种系 IGHV3-7' 01或IGHV3-7' 02(克隆名V3-7或VH3-11)衍生出的其他成熟重链可变区（Glas et al.，Clin Exp Immunol. 107:372-80, 1997)或并入其中一种种系序列的成熟重链可变 区。对于轻链，更优的受体序列是有NCBI登录号AAY33350 (GI :63102889)的人类成熟轻 链可变区或由种系IGKV1D-39或IGKVl-39(克隆名02或012)衍生出的其他成熟轻链可 变区（Kramer et al.，Eur J Immunol. 35:2131-45, 2005)或并入其中一种种系序列的成 熟轻链可变区。因此，本发明人源化抗体是有三条轻链和三条重链互补决定区的一种抗 体，其中互补决定区是由Kabat定义的来自于供体9E4抗体，成熟可变区框架序列和恒定 区序列，如果存在，则完全或者实质上是源自于人类抗体序列。同样地，人源化的重链是 具有三个互补决定区的重链，其中互补决定区是由Kabat定义的来自于所述9E4抗体，及 成熟可变区框架序列和恒定区序列的重链，如果存在，则完全或者实质上是源自于人类抗 体重链序列。同样地，人源化的轻链是具有三个互补决定区的轻链，其中互补决定区是由 Kabat定义的来自于所述9E4抗体，及成熟可变区框架序列和恒定区序列的轻链，如果存 在，则完全或者实质上是源自于人类抗体轻链序列。当相应的残基由Kabat定义的至少有 85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或100%是相同时，抗体链成熟可变区框架序列 或抗体链恒定区序列实质上是分别来自于人类成熟可变区框架序列或恒定区序列。 源自人类成熟可变区框架残基的某些氨基酸可被选择以用于替换，该替换是基于它们 对互补决定区构象和/或对抗原的结合的可能的影响。检测这种可能的影响可以通过如下 方法进行：建模，检测特定位置的氨基酸的特征，或经验观测替换带来的影响、或诱变特定 的氨基酸。 例如，当鼠的成熟可变区框架残基和一个选定的人类的成熟可变区框架残基之间的氨 基酸不同，人框架氨基酸可以被源自鼠抗体的等效框架氨基酸取代，当氨基酸被合理的取 代： (1) 与抗原非共价结合， (2) 毗邻互补决定区区域， (3) 否则，与互补决定区相互作用（例如在一个互补决定区区域内约6 Λ )， (4) 介导重链和轻链的相互作用。 本发明提供了鼠9Ε4抗体的人源化形式，包括三个实施例的人源化轻链成熟可变区 (Hu9E4VLvl-v3 ;SEQ ID N0s:3-5)和四个实施例的人源化重链成熟可变区（Hu9E4VHvl-v4 ; SEQ ID NOs :8-11)。SEQ ID NO: 4包括鼠9E4轻链的三个Kabat互补决定区和AAY33350的 成熟可变区框架。如表2所示，SEQ ID N0S. 3和5包括回复突变。SEQ ID NO. 11包括鼠9E4 的三个Kabat互补决定区和AAC50998的成熟可变区框架。如表3所示，SEQ ID N0s:8-10 包括回复突变。 本发明提供了人源化9E4抗体的突变，其中人源化重链成熟可变区显示了与SEQ ID N0s:8-ll至少有90% ,95%或99%是相同的，人源化轻链成熟可变区显示了与SEQ ID N0s:3-5至少有90% ,95%或99%的序列是相同的，然而，任何来自于特定的SEQ ID NO.突 变发生在成熟可变区域框架，而不是在Kabat互补决定区。在某些所述抗体中，位置L36被 Y或F占据，和/或位置L83被F或L占据，和/或位置H73被N或D占据和/或位置H93 被A或S占据（这里所说的所有的位置，和其他所述的一样，在这个应用中是来自于Kabat 号）在某些所述抗体中，Hu9E4VLvl-v3和Hu9E4VHvl-v4中的某些或者全部回复突变被保 留。换句话说，重链位置H73和H93的一个或两个被D和A分别占据。同样地，在某些所述 抗体中，轻链位置L36和L83的一个或两个被F和L分别占据。在某些所述抗体中，1，2, 3 或所有四个位置H73，H93，L36和L83被D，A，F和L分别占据。在某些所述抗体中，0, 1或2 位置在重链成熟可变区域框架相应的SEQ ID NO: 11处被改变或0，1或2位置在轻链成熟 可变区域框架相应的SEQ ID N0:4处被改变。 一些抗体具有包括三个SEQ ID NO: 11序列中Kabat互补决定区的人源化重链和 三个SEQ ID N0:4序列中Kabat互补决定区的人源化轻链，其中（provided that)位置 L36 (Kabat编号）被F或Y占据，和/或位置L83 (Kabat编号）被L或F占据，和/或位置 H73 (Kabat编号）被D或N占据，和/或位置H93 (Kabat编号）被S或A占据。在一些这 样的实施例中，位置L36 (Kabat编号）被F占据。在一些这样的实施例中，位置L36 (Kabat 编号）被F占据并且位置L83(Kabat编号）被L占据。在一些这样的实施例中，位置 L36(Kabat编号）被F占据并且位置H73(Kabat编号）被D占据。在一些这样的实施例中， 位置L36 (Kabat编号）被F占据并且位置H93 (Kabat编号）被S占据。在一些这样的实 施例中，位置L36 (Kabat编号）被F占据并且位置H93 (Kabat编号）被A占据。在一些这 样的实施例中，位置L36 (Kabat编号）被F占据，位置L83 (Kabat编号）被L占据，且位置 H73(Kabat编号）被D占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编号）被F占据，位 置L83 (Kabat编号）被L占据，位置H93 (Kabat编号）被S占据。在一些这样的实施例中， 位置L36 (Kabat编号）被F占据，位置L83 (Kabat编号）被L占据，位置H93 (Kabat编号） 被A占据。在一些这样的实施例中，位置L36 (Kabat编号）被F占据，位置H73 (Kabat编 号）被D占据，位置H93 (Kabat编号）被S占据。在一些这样的实施例中，位置L36 (Kabat 编号）被F占据，位置L83 (Kabat编号）被F占据，位置H73 (Kabat编号）被D占据，且位置 H93 (Kabat编号）被S占据。在一些这样的实施例中，位置L36 (Kabat编号）被F占据，位 置H73(Kabat编号）被D占据，位置H93(Kabat编号）被A占据。在一些这样的实施例中， 位置L36 (Kabat编号）被F占据，位置L83 (Kabat编号）被L占据，位置H73 (Kabat编号） 被D占据，且位置H93(Kabat编号）被S占据。在一些这样的实施例中，位置L36(Kabat编 号）被F占据，位置L83 (Kabat编号）被L占据，位置H73 (Kabat编号）被D占据，且位置 H93 (Kabat编号）被A占据。在一些这样的实施例中，位置L83 (Kabat编号）被L占据。在 一些这样的实施例中，位置L83 (Kabat编号）被L占据，且位置H73 (Kabat编号）被D占据。 在一些这样的实施例中，位置L83 (Kabat编号）被L占据，位置H93 (Kabat编号）被S占据。 在一些这样的实施例中，位置L83 (Kabat编号）被L占据，且位置H93 (Kabat编号）被A占 据。在一些这样的实施例中，位置L83 (Kabat编号）被L占据，位置H73 (Kabat编号）被D 占据，位置H93(Kabat编号）被S占据。在一些这样的实施例中，位置L83(Kabat编号）被L 占据，位置H73 (Kabat编号）被D占据，位置H93 (Kabat编号）被A占据。在一些这样的实 施例中，位置H73 (Kabat编号）被D占据。在一些这样的实施例中，位置H73 (Kabat编号） 被D占据，位置H93(Kabat编号）被S占据。在一些这样的实施例中，位置H73(Kabat编号） 被D占据，位置H93 (Kabat编号）被A占据。在一些这样的实施例中，位置H93 (Kabat编号） 被S占据。在一些这样的实施例中，位置H93 (Kabat编号）被A占据。在一些这样的实施 例中，位置L36 (Kabat编号）被Y占据，位置L83 (Kabat编号）被F占据，位置H73 (Kabat 编号）被N占据，且位置H93 (Kabat编号）被S占据。因此在表1中列出了一些典型的实 施例，这些实施例中在位置L36、L83、H73和H93上具有满足要求的残基以及它们的结合。 表1 :在位置L36、L83、H73和H93 (Kabat编号）上具有满足要求的残基的典型的实施 例。

【权利要求】
1. 一种抗体，包括具有序列SEQ ID NO: 11的三个Kabat互补决定区的成熟重链可变 区，所述成熟重链可变区至少90%与序列SEQ ID NO: 11相同，以及具有序列SEQ ID NO:4 的三个Kabat互补决定区的轻链，所述轻链至少90%与序列SEQ ID N0:4相同。
2. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个指定SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
3. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个指定SEQ ID NO:10的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
4. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个指定SEQ ID NO:8的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
5. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个指定SEQ ID NO:8的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
6. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个指定SEQ ID NO:8的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
7. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个指定SEQ ID NO:9的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
8. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个指定SEQ ID NO:9的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
9. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个指定SEQ ID N0:9的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID N0:5的氨基酸序列。
10. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个指定SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
11. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个指定SEQ ID NO: 11的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
12. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个指定SEQ ID NO: 11的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
13. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个指定SEQ ID NO: 11的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID N0:5的氨基酸序列。
14. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，至少95%的成熟重链可变区与SEQ ID NO: 11相同，并且至少95%的成熟轻链可变区与SEQ ID NO:4相同。
15. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个与SEQ ID NO: 11至少98%相同的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个与SEQ ID N0:4至 少95 %相同的氨基酸序列。
16. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个与SEQ ID NO: 11至少99%相同的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个与SEQ ID N0:4至 少95 %相同的氨基酸序列。
17. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有SEQ ID NO: 11的 氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个与SEQ ID N0:4至少95%相同的氨基酸序 列。
18. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个与SEQ ID NO: 11至少95%相同的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个与SEQ ID N0:4至 少98 %相同的氨基酸序列。
19. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个与SEQ ID NO: 11至少95%相同的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个与SEQ ID N0:4至 少99 %相同的氨基酸序列。
20. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个与SEQ ID NO: 11至少95%相同的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个指定SEQ ID N0:4 的氨基酸序列。
21. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个与SEQ ID NO: 11至少98%相同的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个与SEQ ID N0:4至 少98 %相同的氨基酸序列。
22. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区具有一个与SEQ ID NO: 11至少99%相同的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有一个与SEQ ID N0:4至 少99 %相同的氨基酸序列。
23. 如权利要求1所述的抗体，规定位置L36 (Kabat编号）是由F占用。
24. 如权利要求1所述的抗体，规定位置L83 (Kabat编号）是由L占用。
25. 如权利要求1所述的抗体，规定位置H73 (Kabat编号）是由D占用。
26. 如权利要求1所述的抗体，规定位置H93 (Kabat编号）是由S占用。
27. 如权利要求1所述的抗体，规定位置H93 (Kabat编号）是由A占用。
28. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO: 11，以及成熟轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID N0:4,除非规定位置L36 (Kabat编 号）可被Y或F占用，位置L83 (Kabat编号）可被F或L占用，位置H73 (Kabat编号）可被 N或D占用，位置H93 (Kabat编号）可被A或S占用。
29. -种抗体，包括具有序列SEQ ID NO: 11的三个Kabat互补决定区（⑶Rs)的人源 化成熟重链以及具有序列SEQ ID NO:4的三个Kabat互补决定区（⑶Rs)的人源化轻链，规 定位置L36 (Kabat编号）被F占用，和/或位置L83 (Kabat编号）被L占用，和/或位置 H73 (Kabat编号）被D占用，和/或位置H93 (Kabat编号）被S占用。
30. 如权利要求29所述的抗体，其特征在于，位置L36 (Kabat编号）被F占用，位置 H73 (Kabat编号）被D占用，以及位置H93 (Kabat编号）被S占用。
31. 如权利要求29所述的抗体，其特征在于，所述位置L36 (Kabat编号）被F占用，所 述位置H93 (Kabat编号）被S占用。
32. 如权利要求29所述的抗体，其特征在于，所述位置L36 (Kabat编号）被F占用，所 述位置H73 (Kabat编号）被D占用。
33. 如权利要求29所述的抗体，其特征在于，所述位置H73 (Kabat编号）被D占用，所 述位置H93 (Kabat编号）被S占用。
34. 如权利要求29所述的抗体，其特征在于，所述位置H93 (Kabat编号）被S占用。
35. 如权利要求29所述的抗体，其特征在于，所述位置H73 (Kabat编号）被D占用。
36. 如权利要求29所述的抗体，其特征在于，所述位置L36 (Kabat编号）被F占用，所述 位置L83 (Kabat编号）被L占用，所述位置H73 (Kabat编号）被D占用，所述位置H93 (Kabat 编号）被s占用。
37. 如权利要求29所述的抗体，其特征在于，所述位置L36 (Kabat编号）被F占用，所 述位置L83 (Kabat编号）被L占用，所述位置H93 (Kabat编号）被S占用。
38. 如权利要求29所述的抗体，其特征在于，所述位置L36 (Kabat编号）被F占用，所 述位置L83 (Kabat编号）被L占用，所述位置H73 (Kabat编号）被D占用。
39. 如前述任一权利要求所述的抗体，其特征在于，所述成熟重链可变区融合到重链恒 定区，所述成熟轻链恒定区融合到轻链恒定区。
40. 如权利要求39所述的抗体，其特征在于，所述重链恒定区具有指定的氨基酸序列 SEQ ID N0:14,其中C-末端赖氨酸残基可以被省略。
41. 如权利要求39所述的抗体，其特征在于，所述轻链恒定区具有指定的氨基酸序列 SEQ ID NO:13〇
42. 如权利要求39所述的抗体，其特征在于，所述轻链具有指定SEQ ID NO:28的恒定 区。
43. 如前述任一权利要求所述的抗体，其特征在于，所述重链恒定区是天然人类恒定区 的突变形式，所述重链恒定区与Fcy受体的结合力低于所述天然人类恒定区与Fcy受体 的结合力。
44. 如前述任一权利要求所述的抗体，其特征在于，所述重链恒定区是人IgGl同种型。
45. -种核酸，所述核酸编码由前述任一权利要求定义的成熟重链可变区和/或成熟 轻链可变区。
46. 如权利要求45所述的核酸，所述核酸具有包含SEQ ID NO: 15、17、18、19和20中任 意一种的序列。
47. -种宿主细胞，所述宿主细胞含有载体，所述载体包括权利要求45或46所述的核 酸。
48. -种对患有突触核蛋白病或具有患突触核蛋白病风险的患者进行治疗的方法，包 括对所述患者施用有效机制的如权利要求1-40中任一项所定义的抗体。
49. 如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述患者具有REM睡眠行为障碍（RBD)。 5 0. -种在患有路易病或具有患路易病风险的患者中检测路易体的方法，包括对所述 患者施用有效量的如权利要求1-44中任一项所定义的抗体，其中所述抗体结合到路易体； 并检测患者体内的结合的抗体。
51. 如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述抗体被标记。
52. -种减少在患有路易病或具有患路易病风险的患者体内形成路易体的方法，包括 给所述患者施用有效量的如权利要求1-44中任一项所定义的抗体。
53. 一种在患有路易病或具有患路易病风险的患者中抑制突触核蛋白聚集或降低路易 体或突触核蛋白聚集的方法，包括给所述患者施用有效量的如权利要求1-44中任一项所 定义的抗体。
54. 如权利要求48-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述疾病是帕金森氏病。
55. 如权利要求48-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述疾病为多系统萎缩 (MSA)或路易体痴呆（DLB)。
56. -种药物组合，包含权利要求1-44中任一项所定义的抗体。
57. -种制备抗体的方法，包括培养转化了编码所述抗体重链和轻链的核酸的细胞，以 便所述细胞分泌所述抗体；从细胞培养基中纯化所述抗体；其中所述抗体由权利要求1-44 中任一项定义。
58. -种制备产生抗体的细胞系的方法，包括将编码抗体重链和轻链的载体和选择 性标记物引入细胞；在适合环境下繁殖细胞来选择具有增加的载体拷贝数量的细胞；从所 选择的细胞中分离单个细胞；将基于抗体产量选择的单细胞所克隆的细胞建库；其特征在 于，所述抗体为权利要求1-44中任一项所定义的抗体。
59. 如权利要求58所述的方法，所述方法进一步包括在选择条件下繁殖的细胞和筛选 的细胞系自然的表达和分泌至少l〇〇mg/L/106cells/24h。
60. 如权利要求48, 52-53任一所述的方法，其特征在于，患者的认知功能衰退受到抑 制。
61. 如权利要求48, 52-53任一所述的方法，其特征在于，神经突和/或轴突a -突触核 蛋白聚集减少。
62. 如权利要求48, 52-53任一所述的方法，其特征在于，患者的神经突营养不良降低。
63. 如权利要求48, 52-53任一所述的方法，其特征在于，突触和/或树突状密度得到保 留。
64. 如权利要求48, 52-53任一所述的方法，其特征在于，所述方法在患者体内保留了 突触素和/或MAP2。
【文档编号】C07K16/00GK104334184SQ201280053194
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2012年10月26日 优先权日:2011年10月28日
【发明者】约瑟·萨尔丹哈, 塔洛陈·S.·尼扎 申请人:尼奥托普生物科学有限公司