抗体纯化方法

抗体纯化方法
【专利摘要】本发明涉及制备高纯度、高质量的抗体群的方法，所述方法相继采用阳离子交换柱、疏水相互作用柱和阴离子交换柱来去除抗体同种型和杂质，而不采用蛋白A柱；以及通过以上方法制备的抗体群。
【专利说明】抗体纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备高纯度、高质量抗体群的方法，该方法通过连续采用阳离子交换柱、疏水相互作用柱以及阴离子交换柱，而不使用蛋白A柱，从而除去抗体同种型和杂质；本发明还涉及通过上述方法制备的抗体群。
【背景技术】
[0002]蛋白A柱常在许多用于生产抗体药的纯化工艺中用到。利用蛋白A柱的优势在于在工艺初期就能获得高纯度产品。然而，蛋白A的成本比其他常用的离子交换树脂贵30倍，从而导致了抗体药生产的高成本。
[0003]根据之前的报道，蛋白A树脂在抗体药生产相关原料成本中占了 35%(Journal of Chromatography A, 1024 (2004) 79-85)，抗体样品中残留的微量蛋白 A 会在施用于人体时导致免疫或其他生理反应(单克隆抗体的纯化工具，经验证的生物系统，图森，AZ,1996 (Purification Tools for Monoclonal Antibodies, ValidatedBiosystems, Tucson, AZ, 1996))。因此，需要对采用蛋白A柱的纯化工艺进行持续监测，并需要在每个纯化步骤中去除残余的蛋白A。此外，由于蛋白A基于其与靶标的生物亲和性而起作用，其缺点在于化学稳定性较差。因此，为了维持蛋白A的活性，不得使用IM的NaOH，即使其对于柱子的清洗和后续的使用而言非常关键。而不使用IM的NaOH，就很难完全去除柱子上的杂质，因此柱子在后续使用中的再利用次数就会显著低于化学树脂允许使用次数。
[0004]尽管成本高昂，全球各大医药公司仍然倾向采用蛋白A来纯化抗体，因为其能在早期就获得高纯度的抗体。例如，Gentech生产的抗体药，即赫赛汀(Herceptin),其纯化工艺采用了蛋白A、阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、疏水相互作用树脂(HIC) (SvenSommerfeld a, Jochen Strube b,化学工程和工艺 44(2005) 1123-1137) (Sven Sommerfelda, Jochen Strube b, Chemical Engineering and Processing44 (2005) 1123-1137))。然而，鉴于蛋白A具有上述的缺点，仍需要开发更有效、更经济的抗体纯化方法。
[0005]为了开发一种在不使用蛋白A柱的情况下就能纯化抗体的方法，任何候选方法首要的是可以去除与蛋白A—样多或更多的杂质。尤其是当CHO细胞系用作宿主细胞产生抗体时，细胞培养液不仅含有所需的抗体，还含有大量的杂质，包括宿主细胞蛋白(HCP)，宿主细胞来源的DNA(HCD)，以及生长因子。因此，在任何不用蛋白A纯化抗体的情况下，由于存在大量杂质，早期成功去除杂质都是非常重要的要素。
[0006]为了解决这个问题，Warren Schwartza等开发了利用MEO HyperCel的抗体纯化方法，这是一种疏水性电荷诱导层析法(HCIC) (Journal of ChromatographyA，908 (2001) 251-263)。在该方法中，无需超滤，就可自含盐的细胞培养物中分离到高纯度的抗体。然而，HCIC仍然比使用离子交换树脂贵2-5倍。且也尚未发现通过HCIC是否就能比用离子交换树脂更有效地去除杂质。同时，Egisto Boschetti建议采用亲硫性层析法(thiophilic chromatography, T_gel),其基于树脂的化学亲和力而生产高纯度的抗体，而蛋白A层析法则基于其本身的生物亲和力(J.Biochem.Biophys.Methods49 (2001) 361-389)。然而，就制备高纯度抗体而言，T-gel并不如蛋白A的那样有效，且其成本比采用离子交换树脂的抗体制备方法仍要贵5倍。因此，其还未用于工业化生产。
[0007]同时，另一种纯化方法，离子交换树脂例如阳离子交换树脂可在吸附柱内使用。最近在产业中利用的阳离子交换树脂的例子包括:GE-医疗生产的快流速CM和快流速SP，默克(Merck)生产的 Fractogel SO3 和 Fractogel COCT(US2007029244)。然而，阳离子交换树脂的限制仍然在于在早期杂质去除不够。同样地，对纯化工艺的诸多条件进行优化是成功开发新纯化工艺的关键。
[0008]在抗体纯化工艺中，维持质量的恒定与去除杂质一样重要。抗体由二硫键连接的两条重链和两条轻链组成，而重链的Fe片段则被糖基化。然而，CHO细胞作为宿主细胞而产生的抗体含有多个同种型(Hongcheng Liu, Georgeen Gaza-Bulseco, Journal ofChromatography B, 837 (2006) 35-43)。大多数同种型有少许氨基酸修饰，例如脱酰氨化、氧化等等(Isamu Terashima, Akiko Koga,分析生物化学368 (2007) 49-60)。特别是，当作为抗原结合位点的互补决定区(CDR)通过脱酰氨基化修饰后形成抗体同种型，则抗原和抗体的结合亲和力下降，从而影响了抗体的生物活性(Reed J.Harrisa, Bruce Kabakoff, Journalof Chromatography B, 752 (2001) 233-245)。
[0009]所形成的抗体的同种型有很多种，例如，天冬酰胺经脱酰氨化生成天冬氨酸(BoxuYan, Sean Steen, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.98, N0.10, 0ctober2009),甲硫氨酸经氧化生产甲硫氨酸硫酸盐(methionine sulfate) (Chris Chumsae, GeorgeenGaza-Bulseco, Journal of Chromatography B, 850(2007)285-294)? 此外，重链 N-末端的谷氨酸可通过形成五元环结构而转化为焦谷氨酸盐(William E.Werner, SylviaWu, Analytical Biochemistry342 (2005) 120-125)。由于这些同种型影响抗体的生物活性，在抗体生产过程中需要控制抗体中同种型的比例。
[0010]为了调整抗体同种型的量，可采用阳离子交换层析法，因为其能够基于净电荷的不同，将吸附在柱子上的所需抗体通过解离而进行分离，但是，适当的纯化条件也需要具体确定。

【发明内容】

[0011]技术问题
[0012]为了尝试开发不使用昂贵的蛋白A柱而获得高质量和高纯度抗体群的制备方法，本发明人完成了本发明，其中，为了去除沉淀物，通过降低PH对不含细胞的细胞培养物上清液进行预处理。然后将预处理的样品相继通过阳离子交换柱、疏水相互作用柱、以及阴离子交换柱，从而有效去除杂质(例如宿主细胞蛋白(HCP))，并最终制备成具有所需比例的活性抗体和抗体同种型的高质量抗体群。
[0013]问题的解决方案
[0014]本发明的目的是 提供制备抗体群的方法，其中，群内65%以上为活性抗体，其包括:(a)将含有抗体混合物的样品上样至预平衡的阳离子交换柱，然后任选用洗涤缓冲液洗柱，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体，从而自样品中去除宿主细胞蛋白(HCP)和抗体同种型；(b)将盐和步骤(a)的洗脱物混合制得的样品上样至疏水相互作用柱(HIC)，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体，从而自步骤(a)的洗脱物中去除宿主细胞蛋白(HCP);和(C)将步骤(b)的洗脱物上样至阴离子交换柱并收集流出物。
[0015]本发明的另一目的是提供由以上方法制备的抗体群，其中，群内65%以上为活性抗体。
[0016]本发明的有益效果
[0017]通过采用本发明的制备方法，可自产生抗体的细胞培养液中有效去除杂质，而无需采用昂贵的蛋白A柱，从而生产出高纯度和高质量的所需抗体群。
[0018]附图简述
[0019]图1显示了 pH为5时，去除了培养基中的杂质后的SDS-PAGE结果，其中M:蛋白大小标记，1:培养基，2:深度过滤(去除细胞后)(方法I)，3:在将pH值降低至5并进行I小时的低速搅拌之后(方法I)，4:在深度无菌过滤之后(方法I)，5:pH值降低到5并进行了 I小时的低速搅拌之后的上清液(方法2)，6:深度过滤之后(方法2)，7:无菌过滤之后(方法2)； [0020]图2显示了从细胞培养物上清液、蛋白A柱、SP柱，或羧甲基(CM)柱收集的流出物和洗脱物之间的SD-PAGE比较结果。其中，M:蛋白大小标记，S:细胞培养物的上清液，I:蛋白A柱流出物，2:SP柱流出物，3:CM柱流出物，4:蛋白A柱洗脱物，5:SP柱洗脱物，6:CM柱洗脱物，7:参照药，赫赛汀；
[0021 ] 图3显示了 AKTA法的图，其采用了 CM柱进行纯化；
[0022]图4显示了 CEX HPLC的图，其采用了 CM柱进行纯化；
[0023]图5显示了 AKTA法的图，其采用了 Fractogel C00_(M)柱进行纯化；
[0024]图6显示了 CEX HPLC的图，其采用了 Fractogel COCT(M)柱进行纯化；
[0025]图7显示了培养物上清液、CM柱的洗脱物，以及Fractogel COO-(M)柱的洗脱物的CEX HPLC 图；
[0026]图8显示了培养物上清液、CM柱的洗脱物、Fractogel COO-(M)柱的洗脱物、以及参照药物赫赛汀的CEX HPLC图。
[0027]图9为AKTA法的图，其显示了采用Fractogel COCT(M)柱的纯化方法中，碱性抗体同种型的峰变化取决于4步洗涤过程中的柱体积。
[0028]图10为AKTA法的图，其显示了疏水相互作用层析柱中不同缓冲条件的影响(⑷缓冲液PH7.2，分步洗脱，(B)缓冲液ρΗ6.0，分步洗脱，(C)缓冲液ρΗ6.0，浓度-梯度洗脱)；
[0029]图11为本发明抗体纯化方法所有步骤的流程图；和
[0030]图12的图显示了在本发明抗体纯化方法各步中去除的宿主细胞蛋白(HCP)的量。
[0031]本发明的最佳实施方式
[0032]一方面，本发明提供制备抗体群的方法，其中，群内65%以上为活性抗体，其包括:(a)将含有抗体混合物的样品上样至预平衡的阳离子交换柱，然后任选采用洗涤缓冲液洗柱，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体，从而自样品中去除宿主细胞蛋白(HCP)和抗体同种型；(b)将通过将盐和步骤(a)的洗脱物混合制得的样品上样至疏水相互作用柱(HIC)，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体，从而自步骤(a)的洗脱物中去除宿主细胞蛋白(HCP);和(c)将步骤(b)的洗脱物上样至阴离子交换柱并收集流出物。
[0033]宿主细胞产生的抗体产物不仅含有活性抗体，还含有各种不同的抗体同种型、宿主细胞蛋白、宿主细胞来源的DNA，以及细胞的生长因子。抗体同种型是抗体的特定氨基酸经去酰氨基化或氧化而得的修饰形式，这些同种型具有不同的生物活性。宿主细胞表达的抗体产物中含有比例很高的抗体同种型。尤其是在生产抗体的生物仿制药(biosimilar)时，生产高质量的抗体作为参照药是非常重要的。因此，在宿主细胞产生抗体之后，纯化工艺对于控制抗体产品中抗体同种型的量很关键。
[0034]基于此，本发明提供了制备含有所需比例的酸性抗体同种型、活性抗体，以及碱性抗体同种型的抗体群的方法，所述方法去除宿主细胞蛋白以提高抗体纯度，并相比于原始培养物上清液中活性抗体的比例，增加活性抗体的比例。
[0035]如本文所用，术语“抗体群”指包括活性抗体和抗体同种型的一组抗体。出于本发明的目的，抗体群是指包含所需比例的活性抗体和抗体同种型的一组抗体。抗体群可仅含有一类抗体或同时含有活性抗体和抗体同种型。出于本发明的目的,抗体群较佳地指这样一组,其中通过自培养物上清液去除抗体同种型以及杂质,例如宿主细胞蛋白来提高活性抗体的比例。
[0036]具体地，当将本发明方法用于制备抗体生物仿制药时，抗体群是指这样一个群，其含有的活性抗体和抗体同种型比例与参照药的相同或相对应。
[0037]通过采用阳离子交换树脂的纯化工艺，可制备含有所需比例的抗体同种型和活性抗体的所需抗体群，优选地，活性抗体的比例大于65%，更优选地，碱性同种型的比例低于20%。具体地，抗体群可含有(但不限于)65-80%的活性抗体，15-30%的酸性抗体同种型，以及5-20的碱性抗体同种型。在本发明的一个实施例中，通过采用Fractogel C00_阳离子交换柱的抗体群含有23.8%的酸性抗体同种型、68.7%活性抗体，以及7.5%碱性抗体同种型，其与参照药(即赫赛汀)的比例相似(实施例2和图7)。
[0038]如本文所用，术语“抗体”是通过抗原刺激而在免疫系统中产生的物质，其在淋巴和血液循环中与特定抗原结合以诱发抗原-抗体反应。出于本发明的目的，抗体是经纯化的高质量目标蛋白，其可由本发明方法高效纯化。
[0039]由于抗体的等电点较其他蛋白高，其可首先通过将培养物上清液上样于阳离子交换树脂柱而基本纯化至较高纯度。等电点(Pi)是蛋白分子零净电荷时的PH值，意味着蛋白分子的双电子层上的电荷为零。当蛋白从其结合复合物上解离，阳离子数等于阴离子数，则其净电荷为零。本发明的待纯化抗体包括(但不限于):等电点优选为7-11的抗体，更优选地为8-10。此外，本发明的抗体包括(但不限于):优选本领域常用的所有具有治疗潜力的抗体，更优选地，HER_2(表皮生长因子受体2)-靶向抗体，即曲妥单抗或帕妥珠单抗，最优选地，为曲妥单抗。曲妥单抗由美国基因泰克公司(Genetech, USA)开发，或称为赫赛汀。这是靶向HER2的人源化抗体，并作为乳腺癌细胞中最常见的HER2/neu的治疗抗体。
[0040]如本文所用，术语“活性抗体”指的是通过本发明方法制备的抗体群中所含有的主要成分。其指这样一种抗体，该抗体不具有抗体中某些氨基酸修饰，例如去酰氨基化或氧化而可能造成的生物学活性降低。即，活性抗体是指非酸性或碱性抗体同种型的抗体。对于抗体群的质量，活性抗体是最重要的组成部分，并较抗体的其他组分具有最高的生物学活性。[0041 ] 如本文所用，术语“抗体同种型”是指活性抗体中某些氨基酸去酰氨基化或氧化而修饰的抗体，包括酸性抗体同种型和碱性抗体同种型。同种型的例子包括其中天冬酰胺经去酰氨基化成为天冬氨酸的抗体同种型，或其中甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸硫酸盐的抗体同种型。此外，重链N-末端的谷氨酸可形成五元环结构，转化为焦谷氨酸盐从而生成抗体同种型。若宿主细胞(如CHO细胞系)中产生了抗体同种型，则抗体产物在细胞培养物中含有闻比例的同种型。
[0042]因此，需要通过纯化工艺例如层析法来去除抗体同种型，使得抗体群含有所需比例的活性抗体和抗体同种型。同样地,为了自培养物上清液中获得高质量的抗体群,需将抗体同种型去除到可接受的范围从而使所述的抗体群含有所需比例的活性抗体。此外，为了生产高纯度的抗体，需将例如宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞来源的DNA(HCD)和生长因子等杂质从抗体群中去除。就此而言,本发明提供制备抗体群的方法,该方法调整抗体同种型数量并有效去除其他杂质，例如细胞蛋白。
[0043]在本发明中，步骤(a)是为了收集纯化形式样品的洗脱物，该样品含有宿主细胞蛋白(HCP)和抗体同种型含量降低的抗体混合物。更具体地，步骤(a)是为了去除样品中的宿主细胞蛋白(HCP)和抗体同种型，其通过(i)将含有抗体混合物的样品上样至预平衡的阳离子交换树脂，(ii)然后任选采用洗涤缓冲液洗柱，和(iii)采用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体。
[0044]如本文所用，术语“含有抗体混合物的样品”指的是部分纯化的培养物上清液或同时含有活性抗体和抗体同种型 的抗体生产细胞的提取物。当宿主细胞中产生了抗体，培养物上清液或细胞提取物中存在活性抗体和抗体同种型。术语“部分纯化的”是指即使在一次或多次的分离方法(如过滤)后，仍然留有除了所需抗体以外的蛋白。
[0045]含有抗体混合物的样品可通过以下方法制备，所述的方法包括:(a)培养宿主细胞从而产生抗体,并去除宿主细胞以制备培养物上清液；和(b)将培养物上清液的pH值调节至低于靶抗体的等电点，优选PH值为4-6，从而形成并去除沉淀物。
[0046]若在细胞培养液中的细胞去除之前就调整pH值，低pH值会促进细胞死亡，并增加培养物中的宿主细胞蛋白的量。因此，为了减少宿主细胞蛋白的量，需要在去除细胞后再调节细胞培养物的PH值。通过该方法制备的样品可更有效地用于抗体群的纯化。
[0047]去除细胞的方法可为本领域熟知的典型方法，也可优选地(但不限于)，采用过滤器进行，更优选地，为深度过滤器。在本发明的一个实施例中发现，与将含细胞肉汤培养基的PH值降至5后过滤制备的，供上样至阳离子交换柱的样品相比，将细胞初步过滤后收获的细胞上清液PH值降低到5，然后对细胞上清液进行再过滤，宿主细胞蛋白的含量显著降低(表2和图1)。
[0048]高等电点的抗体不会在pH值较低的酸性环境下形成凝聚物，而等电点低于抗体的宿主细胞蛋白(HCP)在pH值较低的酸性环境下无净电荷，因此能通过范德华力形成凝聚物，并产生大量沉淀物。因此，可将培养物上清液的PH值范围设定为低于所需抗体的等电点，但接近于宿主细胞蛋白的等电点，以增加宿主细胞的沉淀。即，PH值优选比所需抗体的等电点低1-6，更优选地2-5。因而上清液的pH值范围优选为3-7，更优选地为4_6，最优选地为4.5-5.5。可通过本领域常用的过滤器(如，无菌过滤器)来过滤调节上清液PH后获得的沉淀物。本发明的一个实施例中，发现当将PH降低到5形成沉淀物并将该沉淀物从上清液中去除后，接下来的纯化步骤可以更有效地产出更纯的产品。[0049]此外，在上样之前，还可将样品的条件调节至(但不限于)电导率为5-7mS/cm。
[0050]在本发明的制备方法中，步骤(a)包括将以上述方法制备的样品上样至预平衡的阳离子交换柱的步骤，任选用洗涤缓冲液洗柱，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体。
[0051]如本文所用，术语“阳离子交换柱”是指装载有阳离子交换树脂的柱。在上述步骤中，可通过阳离子交换层析法来去除活性抗体的抗体同种型以及杂质，优选为宿主细胞蛋白(HCP)。阳离子交换树脂是指可将自身阳离子与水性溶液中阳离子交换的合成树脂。因为抗体的等电点较高，其在PH值低于等电点的缓冲液中带正电荷。因此，利用能够吸附带正电荷抗体的阳离子交换树脂改进抗体群的质量。可以在本领域中典型的阳离子交换树脂进行选择，但不限于此，优选含C00_或SO3官能团的柱，更优选地，为羧甲基(CM) ,Fractogel,磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸根(P)或磺酸根(S)，更优选地，为羧甲基琼脂糖(CM琼脂糖)或 Fractogel C0CT。
[0052]步骤(a)的特点在于其可同时去除宿主细胞蛋白和活性抗体的抗体同种型。
[0053]就此而言，宿主细胞蛋白可以包括除所需抗体以外的所有不同形式的杂质。具体地，其可包括所有宿主细胞来源的DNA、细胞生长因子、宿主细胞蛋白本身等等。因此，若能有效地去除这些宿主细胞蛋白，可以更方便地纯化余下的所需抗体，从而得到高纯度的抗体产品。
[0054]上 述步骤之外，为了获得高质量的抗体群，还需要去除抗体同种型。抗体同种型可以是酸性抗体同种型和/或碱性抗体同种型。通常，宿主细胞表达的抗体产品中含有各种不同的抗体同种型。当生产仿制药抗体时，制备与参照药高度相似的产品对于产品质量是很重要的。由于抗体同种型因数个氨基酸的修饰而与活性抗体的电荷不同，可基于此电荷差异将它们与所需的抗体分离。然而，由于仅仅由几个氨基酸造成，电荷差异很小，因此需设定精确的纯化条件。为此，本发明采用阳离子交换树脂来去除酸性抗体同种型和/或碱性抗体同种型。
[0055]抗体同种型是指抗体中少许氨基酸经去酰氨基化或氧化修饰而获得的抗体。由于抗体同种型的生物活性不同，将抗体同种型维持在恒定水平对于质量控制非常重要。通常，与活性抗体相比，培养物上清液含有高比例的酸性和碱性抗体同种型。因此，应该降低抗体同种型的量来调整三种不同类型抗体的比例。抗体群中活性抗体的比例优选为65%或更高，而碱性抗体同种型的比例则优选为20%或更低。在步骤(a)中，活性抗体、酸性抗体同种型、以及碱性同种型优选分别控制在65-80%、15-30%和5-20%的范围内。
[0056]在上述步骤(a)中，洗涤过程优选包括以下步骤:第一洗涤步骤，使剩余抗体吸附在柱上；第二洗涤步骤是为了将柱进行二次平衡；第三洗涤步骤，去除酸性抗体同种型；和第四洗涤步骤，使在第三洗涤步骤中未去除的酸性抗体同种型再次吸附。以上洗涤步骤1-4中的PH和缓冲液组成可根据所需去除的抗体同种型的类型或纯化过程中柱的类型进行调難
iF.0
[0057]可优选采用羧甲基琼脂糖(CM琼脂糖)以从含有抗体混合物的样品中去除酸性抗体同种型。在本发明的一个优选例中，采用含有COO—基团的CM琼脂糖进行抗体纯化。结果显示,在收率和纯度方面,采用CM琼脂糖和蛋白A没有差异。而采用CM琼脂糖比采用SP生产所得的抗体收率以及纯度更高。(表4)
[0058]采用羧甲基琼脂糖的制备方法优选含有(i)将样品上样至羧甲基琼脂糖(CM琼脂糖)柱，该柱用含有20-30mM醋酸钠(pH4.5-5.5)以及35-45M氯化钠(NaCl)的平衡缓冲溶液进行预平衡；(?)采用含有20-30mM的醋酸钠(pH4.5-5.5)和35_45mM氯化钠缓冲液洗柱；(iii)采用含有20-30mM的Tris-盐酸(Tris-HCl) (pH7.0-7.5)的缓冲液洗柱；(iv)采用含有20-30mM的Tris-盐酸(pH7.0-7.5)和20_30mM氯化钠的缓冲液洗柱；(V)采用含有20-30mM 的 Tris-盐酸(Tris-HCl) (ρΗ7.0-7.5)的缓冲液洗柱；和(vi)采用含有 20_30mM的Tris-盐酸(Tris-HCl) (pH7.0-7.5)和80_100mM氯化钠的洗脱缓冲液将抗体从柱上洗脱。在本发明的一个实施例中发现，抗体通过采用平衡-上柱-洗柱1-洗柱2-洗柱3-洗柱4-解吸附(detachment)-剥离(stripping)-柱再生的步骤(表5)得以纯化,从而使活性抗体的含量提高至10%或更高(图4和表7)。
[0059]此外，优选地，可通过采用Fractogel C00_去除酸性抗体同种型和碱性同种型。
[0060]当大量碱性抗体同种型和酸性同种型混合时，为了制备所需的抗体群，必须采用阳离子交换柱来同时去除酸性抗体和碱性抗体。在这种情况下，可采用由合成甲基丙烯酸酯聚合型树脂作为担体(support)构成的Fractogel C00_以同时去除酸性抗体同种型和碱性抗体同种型，这与CM不同，CM虽含有Fractogel C00_官能团，但由琼脂糖基担体构成。在本发明的一个实施例中，采用Fractogel C00_进行抗体纯化，可有效地去除碱性抗体同种型以及酸性抗体同种型(表7和图8)。
[0061]采用Fractogel C00_的制备方法可优选包括(i)将样品上样至经过预平衡的Fractogel COCT柱，所述的预平衡是由含有20_30mM醋酸钠(pH4.5-5.5)和30_45mM氯化钠(NaCl)的平衡缓冲液进行的；(ii)采用含有20_30mM的醋酸钠(pH4.5-5.5)和35_45mM氯化钠缓冲液洗柱；(iii)采用含有25-35mM的醋酸钠(pH5.5-6.5)的缓冲液洗柱；(iv)采用含有25-35mM的醋酸钠(pH5.5-6.5)和45_55mM氯化钠的缓冲液洗柱；(V)采用含有25-35mM的醋酸钠(pH5.5-6.5)的缓冲液洗柱；和(vi)采用含有25_35mM醋酸钠以及70-90mM氯化钠的洗脱 缓冲液将抗体从柱上洗脱。在本发明的一个实施例中发现，抗体通过采用了平衡-上柱-洗柱1-洗柱2-洗柱3-洗柱4-解吸附-剥离-柱再生的步骤(表6)得以纯化，从而使活性抗体的含量增至14%或更高，而碱性抗体同种型的含量降低至约4%或更低(图6和表7)。
[0062]在本发明中，步骤(b)用于收集来自疏水相互作用柱(HIC)的洗脱物，与步骤(a)的洗脱物相比，HCP含量降低。更具体地，步骤(b)包括(i)将步骤(a)中的洗脱物与盐混合制备的样品上样至经平衡液预平衡的疏水相互作用柱(HIC);和(ii)用洗脱缓冲液将结合在柱上的抗体洗脱。
[0063]自步骤(a)收集的抗体洗脱物可以是原始收集的洗脱物或是经额外缓冲液稀释的。疏水相互作用层析法的样品可通过向步骤(a)的洗脱物添加盐而制得。所述向样品中添加的盐没有限制，而在本发明的一个实施例中，向步骤(a)的洗脱物添加的是柠檬酸钠。此外，可将上述样品中盐的浓度调整为高于步骤(b)中用于疏水相互作用柱的平衡缓冲液中盐浓度的0.8-1.2倍，更优选地(但不限于)，可通过向步骤(a)的抗体洗脱物加入盐而制得所述的样品，从而使其与平衡缓冲溶液中的盐浓度相同。
[0064]此外，上述步骤(b)优选以线性浓度梯度洗脱抗体。在本发明的实施例中，就收率和洗脱体积而言，浓度梯度洗脱较分段式洗脱更有效(实施例3)。
[0065]上述步骤(b)旨在通过去除未能在步骤(a)中去除的如宿主细胞蛋白等杂质来提高抗体产物的纯度。所述步骤(b)采用的疏水相互作用柱基于疏水性的不同来去除宿主细胞蛋白，而这与所述步骤(a)中阳离子交换树脂的分离机制不同。
[0066]如本文所用，术语“疏水相互作用层析柱(HIC) ”是指装载有疏水相互作用树脂的柱子。在上述步骤中，采用疏水相互作用层析法来去除杂质，优选地为宿主细胞蛋白。蛋白的三级结构通常呈亲水性，但蛋白在其整体结构内部也含疏水部分。而该部分的疏水性在蛋白间静电相互作用很强的环境中并不会显现。但当溶剂的离子强度或介电常数(permittivity)增加导致静电相互作用减弱,则蛋白的疏水性就会变得较强。就这一点而言，当将疏水配体(长烃链或芳环)引入亲水层析担体(琼脂糖胶片、有机聚合物担体等等)，并用高浓度的盐作平衡，各种不同的蛋白可吸附于这些配体。继而，随着盐浓度下降，蛋白就可根据其属性随洗脱而轻易地分离。即，当通过调整盐浓度来制造疏水环境时，基于蛋白的疏水性，特定柱的吸附强度不同。利用这个原理，可采用疏水相互作用柱实施所述步骤(b)来去除HCP。
[0067]疏水相互作用树脂可选自(但不限于)本领域常用的树脂。较佳地，其包括苯基柱、丁基柱、苯基琼脂糖或Fractogel EMA苯基柱等等，更佳地，为苯基琼脂糖。
[0068]所述采用疏水相互作用柱的步骤(b)优选包括以下步骤，⑴通过将步骤(a)洗脱物中的柠檬酸钠浓度调节至与含有25-35mM醋酸钠(pH5.5-6.5)和0.3-1.0M柠檬酸钠的平衡缓冲液相同以制得样品，将该样品上样至经平衡缓冲液预平衡的疏水相互作用柱(HIC);和(ii)采用含有25-35mM醋酸钠(pH5.5-6.5)的洗脱缓冲液以线性梯度洗脱所述的抗体。
[0069]在本发明的实施例中，当采用pH6.0的醋酸钠缓冲液时，产品的收率比采用Tris-盐酸时更高。此外，梯度洗脱较分段式洗脱也表现出更高的产品收率(表9)。这些结果表明，涉及梯度洗脱的上述方法是制备高纯度抗体群的有效方法。
[0070]在本发明中，所述步骤(C)旨在去除步骤(b)所获洗脱物中的杂质从而收集所需的抗体群。具体地，上述步骤(C)旨在通过将步骤(b)中的洗脱物上样至阴离子交换柱以便收集其流出物。此外，从上述步骤(b)中收集的洗脱物可以是(但不限于)所收集的洗脱物本身或经额外缓冲溶液稀释的。
[0071]如本文所用，术语“阴离子交换柱”指的是装载有阴离子交换树脂的柱子。在上述步骤中，阴离子交换层析法可用于去除杂质，优选为宿主细胞蛋白。所述的阴离子交换树脂是指将自身阴离子与溶液中其他阴离子交换的合成树脂。所述阴离子交换柱可吸附在高于其等电点的PH下带负电荷的蛋白。由于抗体的等电点较高，当使用中性缓冲溶液时，那些抗体不会结合于树脂而是流过柱。在另一方面，如宿主细胞蛋白等杂质的等电点较低，从而易于被阴离子交换树脂吸附并去除。基于该原理，实施所述步骤(C)。
[0072]所述的阴离子交换树脂可选自(但不限于)本领域常用的树脂。这些树脂的例子优选地包括Q琼脂糖、季氨乙基、季胺(Q)等，更优选地，为快流速Q(Q Fast Flow)。
[0073]此外，所述的方法可采用pH低于所述目标抗体等电点(pi)的平衡缓冲液，优选地为pH7.0-8.0的缓冲液，更优选地，为pH7.0-8.0的含有Tris-盐酸的缓冲液。在本发明的一个实施例中，快流速Q作为阴离子交换树脂而Tris-盐酸作为平衡缓冲液，所得抗体的纯度和收率都较采用MES缓冲液时的高。另外，还发现pH为7.0-8.0的范围对于抗体的分离来说是最合适的(表11)。[0074]如上所述,所需去除的宿主细胞蛋白包括除所需抗体以外的所有杂质,其也包括所有宿主细胞来源的DNA、细胞生长因子等，以及宿主细胞蛋白本身。因此，若首先去除了所述的宿主细胞蛋白，则更易纯化获得所需的高质量、高纯度的抗体。此外，步骤(C)中的阴离子树脂还能够在去除宿主细胞蛋白的同时有效地去除内毒素，从而纯化获得所需的高质量抗体群。
[0075]总体而言，通过含有上述步骤(a)-(c)的本发明抗体纯化方法，可有效地去除杂质，尤其是宿主细胞蛋白，从而制备获得高纯度、高收率的抗体。优选地，最终经纯化的样品中宿主细胞蛋白的浓度范围在0.0OOl-1Oppm,更优选地，在0.001-5ppm的范围内。在本发明的一个实施例中，经过第一次纯化后，所述宿主细胞蛋白的浓度降至低于550ppm，第二次纯化后低于IOOppm,而在第三次纯化后低于5ppm(图12)。此外,在本发明的另一实施例中，证明了本发明抗体纯化方法可制备纯度为99.9%的抗体群(表13)。
[0076]在另一方面，本发明提供了通过上述方法制备的抗体群，其中，抗体群中65%以上都是活性抗体。
[0077]所述方法，所述抗体群，以及群中65%以上为活性抗体的抗体群均与上述的相同。
[0078]【本发明实施方式】
[0079]下文中，将根据各实施例对本发明进行具体地描述。然而，这些实施例仅用作举例说明而并不是对本发明的限制。
_0] 实施例1用于纯化抗体的培养肉汤预处理
[0081]对表达重组曲妥单抗抗体的CHO细胞(ATCC N0.CCL61)进行培养并表达曲妥单抗抗体，降低pH值至6或更低，从而使抗体吸附在阳离子交换柱上。
[0082]在本实施例中，采用了两种方法用于比对。在方法I中，采用深度过滤器，通过初步过滤去除培养肉汤中的细胞，从而回收培养物上清液，将培养物上清液的pH值降低至5，并对培养物上清液进行再过滤。在方法2中，将含有细胞的培养肉汤的pH值降至5，然后采用深度过滤器对培养肉汤进行过滤，从而制备用于阳离子交换柱上样的样品。本实验用于这两种方法的对比(表1)。
[0083]【表1】
[0084]通过降低培养肉汤的pH值去除杂质的两种方法
[0085]
【权利要求】
1.一种制备抗体群的方法，其中所述群内65%以上为活性抗体，所述方法包括: (a)将含有抗体混合物的样品上样至经预平衡的阳离子交换柱，然后任选采用洗涤缓冲液洗柱，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体，从而自样品中去除宿主细胞蛋白(HCP)和抗体同种型； (b)将盐和步骤(a)的洗脱物混合制得的样品上样至疏水相互作用柱(HIC)，并用洗脱缓冲液洗脱结合在柱上的抗体，从而自步骤(a)的洗脱物中去除宿主细胞蛋白(HCP);和 (C)将步骤(b)的洗脱物上样至阴离子交换柱并收集流出物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的样品制备如下:将培养物上清液的PH调节至4-6的范围内以去除杂质。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中样品的电导率为5-7mS/cm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体的等电点为8-10。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体为曲妥单抗。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)的洗脱物含有65-80%的活性抗体，15-30%的酸性抗体同种型，和5-20%的碱性抗体同种型。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)的所述抗体同种型为酸性抗体同种型。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)的所述阳离子交换柱为羧甲基(CM)琼脂糖柱。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤(a)包括: (i)将样品上样至用含有20-30mM醋酸钠(ρΗ4.5_5.5)以及35_45mM氯化钠(NaCl)的平衡缓冲溶液作预平衡的羧甲基(CM)琼脂糖柱； (ii)采用含有20-30mM醋酸钠(pH4.5-5.5)和35_45mM氯化钠的缓冲液洗柱； (iii)采用含有20-30mM Tris-盐酸(Tris-HCl) (pH7.0-7.5)的缓冲液洗柱； (iv)采用含有20-30mMTris-盐酸(pH7.0-7.5)和20_30mM氯化钠的缓冲液洗柱； (V)采用含有20-30mM Tris-盐酸(Tris-HCl) (pH7.0-7.5)的缓冲液洗柱；和 (vi)采用含有20-30mM Tris-盐酸(pH7.0-7.5)和80-100mM氯化钠的洗脱缓冲液将抗体从柱上洗脱。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的所述抗体同种型为酸性抗体同种型和碱性抗体同种型。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的阳离子交换柱为fractogel COCT 柱。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)包括: (i)将样品上样至用含有20-30mM醋酸钠(ρΗ4.5-5.5)和30_45mM氯化钠(NaCl)的平衡缓冲液作预平衡的fractogel C00_柱； (ii)采用含有20-30mM醋酸盐(pH4.5-5.5)和35_45mM氯化钠的缓冲液洗柱； (iii)采用含有25-35mM醋酸钠(pH5.5-6.5)的缓冲液洗柱； (iv)采用含有25-35mM醋酸钠(pH5.5-6.5)和45_55mM氯化钠的缓冲液洗柱； (V)采用含有25-35mM的醋酸钠(pH5.5-6.5)的缓冲液洗柱；和 (vi)采用含有25-35mM醋酸钠以及70_90mM氯化钠的洗脱缓冲液将抗体从柱上洗脱。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中结合于柱子的抗体由含盐的洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)包括: (i)通过将步骤(a)洗脱物中的柠檬酸盐浓度调节至与含有25-35mM醋酸盐和0.3-1.0M柠檬酸钠的平衡缓冲液相同，从而制备获得样品，并将该样品上样至经平衡缓冲液预平衡的疏水相互作用柱(HIC);和 (ii)采用含有25-35mM醋酸钠(pH5.5-6.5)的洗脱缓冲液，以线性梯度洗脱所述的抗体。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述的疏水相互作用柱是苯基琼脂糖柱。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阴离子交换柱在上样前经pH范围7.0-8.0之间的预平衡缓冲液进行预平衡。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的预平衡缓冲液含有Tris-HCl (pH7.0-8.0)。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的阴离子交换柱是快流速Q 柱(Q Fast Flow column)。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)所得的阴离子交换柱的流出物中宿主细胞蛋白(HCP)浓度为0.001-5ppm。
20.权利要求1-19任一所述方法制备的抗体群。
【文档编号】C07K1/34GK103998469SQ201280060939
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2011年12月15日
【发明者】尹志容, 李东垠, 金元谦, 尹正源, 白晶殷 申请人:韩华石油化学株式会社