用于降低气道高反应的方法和药物组合物的制作方法

用于降低气道高反应的方法和药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及选自抗S100B抗体、抗S100B适配子或S100B基因表达抑制剂的试剂用于降低有需要的受试者中的气道高反应的方法中。本发明还涉及用于确定受试者是否处于患有或发展气道高反应的风险的方法，包括测定从所述受试者获得的生物样品中S100B蛋白的水平。
【专利说明】用于降低气道高反应的方法和药物组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于降低有需要的受试者中的气道高反应的方法和药物组合物。
【背景技术】
[0002]气道高反应(“AHR”)是许多气道疾病的典型特征，其由使气道响应于刺激而太容易变窄和/或过分变窄的气道异常组成。与各种病症相关的呼吸道疾病在一般群体中非常常见。特别在哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)中观察到气道高反应。
[0003]哮喘是工业化国家中最常见的疾病之一。哮喘是一种特征在于气道的可变的、在许多情况下可逆性阻塞的病症。该过程与肺炎症相关，并且在一些情况下与肺过敏相关。许多受试者具有被称为“哮喘发作”的急性发作，而其他受试者患有慢性病症。所有哮喘患者具有一组症状，所述症状是该病症所特有的:发作性支气管收缩、肺炎症和降低的肺表面活性物质。现有支气管扩张剂和抗炎药是目前可商购的并且开处方用于治疗哮喘。更重要地，可用于治疗哮喘的大多数药物在小部分受试者中几乎无效。
[0004]CCffD的特征在于通常由慢性支气管炎、肺气肿或两者引起的气流阻塞。通常，气道阻塞是不完全可逆的，但10-20%的受试者在治疗下的确表现出一些气道阻塞的改善。在慢性支气管炎中，气道阻塞由异常气道粘液的长期和过量分泌、炎症、支气管痉挛和感染所导致。目前几乎没有可用的治疗来缓减COPD的症状、防止恶化、保持最佳肺功能、并改善每日生活活动和生活质量。许多受试者将在其余生长期使用药物，其中在恶化过程中需要增加剂量和额外药物。目前为COPD受试者开处方的药物包括:速效-β 2-受体激动剂、抗胆碱能支气管扩张剂、长效支气管扩张剂、抗生素和祛痰药。在目前可用的CCffD治疗中，从抗胆碱能药物、β 2肾上腺素受体激动剂和口服类固醇的施用开始，在其进展后发现短期得益，但非长期效果。短效和长效吸入的β2肾上腺素能激动剂实现短期支气管扩张，并且在COPD受试者中提供一些症状缓解，但没有显示对疾病进展的任何有意义的保持效果。
[0005]因此，存在对于管理气道疾病诸如哮喘或COPD中气道高反应性中的额外治疗选项的需要。
[0006]S100B是SlOO蛋白家族的成员。SlOO蛋白是脊椎动物中发现的低分子量蛋白，其特征在于螺旋-环螺旋(“EF手型”)构型的两个钙结合位点。存在至少21种不同类型的SlOO蛋白。该名称源自以下事实:该蛋白在中性pH的硫酸铵中100%可溶。S100B是作为由两个β亚基组成的同源二聚体存在的分子量为12kDa的酸性蛋白。两种单体以双重旋转轴设置，并且通过二硫键保持在一起。S100B已经被鉴定为钙结合蛋白，其在横纹肌和骨骼肌收缩中起作用，但 其在气道高反应中的作用尚未研究。
[0007]发明概述
[0008]本发明涉及选自抗S100B抗体、抗S100B适配子或S100B基因表达抑制剂的试剂用于降低有需要的受试者中的气道高反应的方法中。本发明还涉及用于确定受试者是否处于患有或发展气道高反应的风险的方法，包括测定从所述受试者获得的生物样品中S100B蛋白的水平。[0009]发明详述
[0010]支气管过度活跃是平滑细胞肌收缩的体征，导致气道收缩和呼吸困难。在急性肺损伤和过敏性哮喘的小鼠模型中，反应性由细菌或过敏衍生物诱导。本发明人已经在两种呼吸攻击的模型中解决了 SlOOb (RAGE/AGER途径的配体)在气道反应中的贡献。气道刺激后，SlOOb在肺中表达，其动力学概况类似于促炎细胞因子。缺乏SlOOb的小鼠表现出降低的LPS诱导的气道反应，对细胞募集或对TNF- α和IL_6促炎细胞因子的分泌没有影响。类似地，在LPS攻击和过敏性哮喘的OVA敏化模型中，中和抗体治疗消除了支气管反应性。LPS攻击后，表达SlOOb的细胞在支气管中的上气道上皮细胞和肌肉细胞附近聚集，表明SlOOb在气道高反应性过程中在控制细胞重塑的动力学中的潜在作用。这些观察结果强调了调节支气管过度活跃的级联上游的SlOOb，并显示SlOOb阻断作为用于呼吸疾病包括急性肺损伤和哮喘的潜在治疗策略。
[0011]因此，本发明涉及选自抗S100B抗体、抗S100B适配子或S100B基因表达抑制剂的试剂用于降低有需要的受试者中的气道高反应(AHR)的方法中。 [0012]值得提及的是，本发明的试剂能够降低AHR，而不改变炎症反应(参见实施例1)。
[0013]如本文所使用，术语“S100B”具有其在本领域中的一般含义，并且是指DonatoR.SlOO:a multigenic family of calcium-modulated proteins of the EF-hand type withintracellular and extracellular functional roles.1nt J Biochem Cell Biol.2001Jul ；33(7):637-68中所描述的SlOO钙结合蛋白B。
[0014]如本文所使用，“抗体”包括天然存在和非天然存在的抗体。具体地，“抗体”包括多克隆和单克隆抗体，及其单价和二价片段。此外，“抗体”包括嵌合抗体、全合成抗体、单链抗体及其片段。抗体可以是人或非人抗体。非人抗体可以通过重组方法来人源化，以降低其在人中的免疫原性。
[0015]如本文所使用，术语“抗S100B抗体”是指任何直接对抗S100B的抗体。
[0016]抗体可以根据常规方法来制备。单克隆抗体可以使用Kohler和Milstein(Nature, 256:495, 1975)的方法来生成。为了制备可用于本发明的单克隆抗体，小鼠或其它适当的宿主动物用S100B的抗原形式以合适时间间隔(例如，每周两次，每周一次，每月两次或每月一次)来免疫。动物可以在处死一周内施用抗原的最后“加强”。经常期望在免疫过程中使用免疫佐剂。合适的免疫佐剂包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、明矾、Ribi佐剂、Hunter的Titermax、皂苷佐剂诸如QS21或Quil A或含有CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其它合适的佐剂是本领域众所周知的。动物可以通过皮下、腹膜内、肌内、静脉内、鼻内或其它途径来免疫。给定动物可以用多种形式的抗原通过多种途径来免疫。
[0017]简而言之，可以使用任何之前描述的方法来提供重组形式的S100B。免疫方案之后，将淋巴细胞从动物的脾、淋巴结或其它器官分离并使用试剂诸如聚乙二醇与合适的骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤。融合之后，使用标准方法将细胞置于允许杂交瘤、但非融合伴侣的生长的培养基中。培养杂交瘤之后，分析细胞上清液中具有所需特异性的抗体(即，选择性结合抗原)的存在。合适的分析技术包括ELISA、流式细胞术、免疫沉淀和western印迹。其它筛选技术是本领域众所周知的。优选的技术是证实抗体与构象完整、本身折叠的抗原的结合的技术，诸如非变性ELISA、流式细胞术和免疫沉淀。
[0018]具体而言，如本领域众所周知的，只有抗体分子的一小部分，互补位，参与抗体与其表位的结合。例如，Fe’和Fe区是补体级联的效应物，但不参与抗原结合。已经从其酶促切割pFc’区的抗体或在没有pFc’区的情况下产生的抗体，被指定为F(ab’)2片段，保留了完整抗体的两个抗原结合位点。类似地，已经从其酶促切割Fe区的抗体或在没有Fe区的情况下产生的抗体，被指定为Fab片段，保留了完整抗体分子的抗原结合位点之一。进一步继续，Fab片段由共价结合的抗体轻链和表示为Fd的一部分抗体重链组成。Fd片段是抗体特异性的主要决定因素(单一 Fd片段可以与最高达10个不同的轻链结合，而不改变抗体特异性)，并且Fd片段在分离的情况下保留表位结合能力。
[0019]在抗体的抗原结合部分之内，如本领域中众所周知的，存在直接与抗原表位直接相互作用的互补决定区(OTR)和保持互补位的三级结构的构架区(FR)(通常参见，Clark, 1986 ；Roitt, 1991)。在IgG免疫球蛋白的重链Fd片段和轻链两者中，存在分别由三个互补决定区(⑶Rl至⑶RS)隔开的四个构架区(FRl至FR4)。⑶R，特别是⑶RS区域，更特别是重链⑶RS，主要负责抗体特异性。
[0020]现在本领域公认的是，哺乳动物抗体的非CDR区可以被同种特异性或异种特异性抗体的相似区域替换，同时保留初始抗体的表位特异性。这最清楚地体现在其中非人CDR共价连接人FR和/或Fc/pFc’区以产生功能性抗体的“人源化”抗体的开发和使用中。 [0021]本发明在某些实施方案中提供包括抗体的人源化形式的组合物和方法。如本文所使用，“人源化”描述了以下抗体，其中CDR区域外的一些、大部分或所有氨基酸被从人免疫球蛋白分子衍生的相应氨基酸替换。人源化的方法包括，但不限于，美国专利号4，816，567、5，225，539,5, 585，089,5, 693，761,5, 693，762 和 5，859，205 (其通过引用并入本文)中描述的那些。上述美国专利号5，585，089和5，693，761以及W090/07861也建议可用于设计人源化抗体的四种可能标准。第一个建议是，对于受体，使用来自通常与待人源化的供体免疫球蛋白同源的特定人免疫球蛋白的构架，或者使用来自许多人抗体的共有构架(consensusframework)。第二个建议是，如果人免疫球蛋白的构架中的氨基酸是稀有的并且在该位置的供体氨基酸对于人序列是典型的，则可以选择供体氨基酸而不是受体氨基酸。第三个建议是，在人源化免疫球蛋白链中紧邻3个CDR的位置中，可以选择供体氨基酸而不是受体氨基酸。第四个建议是，使用在以下构架位置的供体氨基酸残基:该位置的氨基酸被预测为具有在抗体的三维模型中CDR的3A内的侧链原子，并被预测为能够与CDR相互作用。上述方法仅仅说明一些本领域技术人员可以用来制备人源化抗体的方法。本领域普通技术人员将熟悉其它抗体人源化的方法。
[0022]在一个人源化形式的抗体的实施方案中，CDR区域外的一些、大部分或所有氨基酸已经替换为来自人免疫球蛋白分子的氨基酸，但其中在一个或多个CDR区域内的一些、大部分或所有氨基酸不变。氨基酸的小的增加、删除、插入、取代或修饰是可允许的，只要其不消除抗体结合给定抗原的能力。合适的人免疫球蛋白分子将包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgM分子。“人源化”抗体保留了与初始抗体相似的抗原特异性。然而，使用某些人源化方法，可以使用如Wu等人，/.Mol.Biol.294:151, 1999 (其内容通过引用并入本文)中所描述的“定向进化”方法增加抗体结合的亲和力和/或特异性。
[0023]完全人单克隆抗体还可以通过免疫对于人免疫球蛋白的重链和轻链基因座的大部分转基因的小鼠来制备。参见，例如，美国专利号5，591，669、5，598，369、5，545，806、5，545，807,6, 150, 584和其中弓丨用的参考文献，其内容通过引用并入本文。这些动物已经遗传修饰，从而使得在内源性(例如，鼠)抗体的产生中存在功能性缺失。进一步修饰动物以含有所有或一部分人种系免疫球蛋白基因座，从而使得这些动物的免疫将导致产生针对目标抗体的完全人抗体。免疫这些小鼠(例如，XenoMouse (Abgenix)，HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))之后，根据标准杂交瘤技术制备单克隆抗体。这些单克隆抗体将具有人免疫球蛋白氨基酸序列，并且因此当向人施用时不会引发人抗小鼠抗体(KAMA)反应。
[0024]产生人抗体也存在体外方法。这些方法包括噬菌体展示技术(美国专利号5，565，332和5，573，905)和人B细胞的体外刺激(美国专利号5，229，275和5，567，610)。这些专利的内容通过引用并入本文。
[0025]因此，如对于本领域普通技术人员将显而易见的，本发明还提供F(ab’)2Fab、Fv和Fd片段；其中Fe和/或FR和/或CDRl和/或CDR2和/或轻链CDR3区已被同源的人或非人序列替换的嵌合抗体；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或轻链CDR3区已被同源的人或非人序列替换的嵌合F (ab’) 2片段抗体；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或轻链CDR3区已被同源的人或非人序列替换的嵌合Fab片段抗体；和其中FR和/或CDRl和/或CDR2区已被同源的人或非人序列替换的嵌合Fd片段抗体。本发明还包括所谓的单链抗体。
[0026]各种抗体分子和片段可以衍生自任何通常已知的免疫球蛋白类别，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgE、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于人 IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4。
[0027]在另一个实施方案中，根据本发明的抗体是单一结构域抗体。术语“单一结构域抗体”(sdAb)或“VHH”是指在骆驼科哺乳动物中发现的类型的天然缺失轻链的抗体的单一重链可变结构域。此类VHH也被称为“纳米抗体⑩”。根据本发明，sdAb尤其可以是美洲驼(llama)sdAb。
[0028]如本文所使用，术语“适配子”是在分子识别方面代表抗体的替代物的一类分子。适配子是具有以高亲和力和特异性识别几乎任何类型的靶分子的能力的寡核苷酸或寡肽序列。因此，术语“抗SlOOB适配子”是指直接对抗SlOOB的适配子。
[0029]适配子可通过随机序列文库的指数富集的配体系统进化(Systematic Evolutionof Ligands by Exponential enrichment, SELEX)来分离。随机序列文库可通过DNA的组合化学合成获得。
[0030]“S100B基因表达抑制剂”是指具有抑制或显著降低S100B基因表达的生物效应的天然或合成的化合物。
[0031]用于在本发明中使用的表达抑制剂可以基于反义寡核苷酸构建体。反义寡核苷酸，包括反义RNA分子和反义DNA分子，将通过结合S100B mRNA并且由此阻止蛋白翻译或增加mRNA降解来发挥作用以直接阻断S100B mRNA的翻译，由此降低细胞中的S100B水平，并且因此降低其活性。例如，可以通过常规磷酸二酯技术合成至少大约15个碱基并且与编码S100B的mRNA转录物序列独特区互补的反义寡核苷酸，并且通过例如静脉内注射或输注施用。使用反义技术来特异性抑制其序列已知的基因的基因表达的方法在本领域是众所周知的(例如参见美国专利号 6，566，135 ;6，566，131 ;6，365，354 ;6，410，323 ;6，107，091 ；6，046，321 ;和 5，981，732)。
[0032] 小的抑制性RNA(SiRNA)也可作为表达的抑制剂起作用而用于本发明中。S100B基因表达可通过将受试者或细胞与小的双链RNA (dsRNA)或者引起产生小的双链RNA的载体或构建体接触，从而使得SlOOB基因表达被特异性抑制(即RNA干扰或RNAi)而降低。为其序列已知的基因选择适当的dsRNA或dsRNA-编码载体的方法是本领域众所周知的(例如参见 Tuschl, T.等人(1999) ；Elbashir, S.Μ.等人(2001) ；Hannon, GJ.(2002) ；McManus,MT.等人(2002) ；Brummelkamp, TR.等人(2002);美国专利号 6，573，099 和 6，506，559 ;以及国际专利公布号W001/36646、W099/32619和W001/68836)。可以有利地保护所有或部分本发明的siRNA的磷酸二酯键。该保护通常使用现有技术已知的方法经由化学途径来实施。例如，磷酸二酯键可以通过硫醇或胺官能团或通过苯基来保护。本发明的siRNA的5’ -和/或3’ -端也可以例如有利地使用上述用于保护磷酸二酯键的技术来保护。siRNA序列有利地包含至少12个连续的二核苷酸或其衍生物。
[0033]如本文所使用，关于本核酸序列的术语“siRNA衍生物”是指与促红细胞生成素或其片段具有至少90%，优选至少95%，作为实例至少98%，且更优选至少98%的同一性百分比的核酸。
[0034]如本文所使用，在两个核酸序列之间的“同一性百分比”是指在待比较的两个序列之间采用所述序列的最佳比对而获得的相同核酸的百分比，该百分比纯粹是统计学的，并且这两个序列之间的差异随机地遍布于核酸序列。如本文所使用，“最佳比对”或“最优比对”是指确定的同一性百分比(参见下文)为最高的比对。经常通过比较根据最佳比对的之前比对的两个核酸序列来实现这些序列之间的序列比较；为了鉴定并比较相似的局部区域，针对比较的片段来实现该比较。除了通过手工方式，通过使用由SMITH和WATERMAN开发的全局同源性算法(Ad.App.Math.，vol.2, p:482, 1981)，通过使用由 NEDDLEMAN 和 WUNSCH开发的局部同源性算法(J.Mol.Biol.，vol.48，p: 443，1970)，通过使用由PEARSON和LIPMAN开发的相似性的方法(Proc.Natl.Acd.Sc1.USA, vol.85, p:2444, 1988)，通过使用利用这种算法的计算机软件(在Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST P、BLASTN、FASTA、TFASTA, Genetics Computer Group, 575Science Dr., Madison, WI USA),通过使用MUSCLE 多比对算法(Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol.32, p: 1792, 2004)来实现进行比较的最佳序列比对。为了得到最佳局部比对，可优选地使用BLAST软件。通过比较最优比对的两个核酸序列来确定这两个序列之间的同一性百分比，为了得到这两个序列之间的最优比对，核酸序列关于参考序列能够包含添加或缺失。通过以下来计算同一性百分比:确定这两个序列之间相同位置的数目，将该数目除以比较位置的总数目，然后将所获得的结果乘以100，以得到这两个序列之间的同一性百分比。
[0035]shRNA(短发夹RNA)也可以作为用于本发明的表达抑制剂起作用。
[0036]核酶也可作为用于本发明的表达抑制剂起作用。核酶是能够催化RNA的特异性切割的酶性RNA分子。核酶的作用机制涉及核酶分子与互补的靶RNA的序列特异性杂交，随后内切核苷酸切割。因此特异性和有效催化S100B mRNA序列的内切核苷酸切割的工程改造的发夹或锤头基序核酶分子可以在本发明范围内使用。通过扫描靶分子中的核酶切割位点(其通常包括下列序列:GUA、GUU和⑶C)最初鉴定任何潜在RNA靶内的特异性核酶切位点。一旦鉴定出，评价对应于包含切割位点的靶基因区的在约15和20个核糖核苷酸之间的短RNA序列的预测结构特征，诸如致使寡核苷酸序列不适当的二级结构。
[0037]可以通过已知方法制备用作表达抑制剂的反义寡核苷酸和核酶两者。这包括用于化学合成的技术，诸如，例如通过固相亚磷酰胺化学合成。或者，反义RNA分子可以通过编码RNA分子的DNA序列的体外或体内转录产生。此类DNA序列可以整合入多种整合有适当RNA聚合酶启动子诸如T7或SP6聚合酶启动子的载体中。可以向本发明的寡核苷酸引入多种修饰作为增加细胞内稳定性和半衰期的手段。可能的修饰包括但不限于向分子的5’和/或3’端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列，或者在寡核苷酸主链内使用硫代磷酸酯或2’ -O-甲基而非磷酸二酯酶键。
[0038]本发明的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA和核酶可以单独地或者与载体一起向体内递送。“载体”以其最广义的含义是能够促进反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸转移至细胞并且优选表达S100B的细胞的任何媒介物。优选地，载体以相对于将导致缺乏载体的降解程度降低的降解将核酸转移至细胞。通常，用于本发明的载体包括，但不限于，质粒、噬菌粒、病毒、衍生自病毒或细菌来源的已经通过插入或整合入反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸序列而操作的其它媒介物。病毒载体是优选的载体类型，并且包括，但不限于来自下列病毒的核酸序列:逆转录病毒，诸如莫洛尼鼠白血病病毒、harvey鼠肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒和劳斯肉瘤病毒；腺病毒，腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；埃_巴病毒；乳头瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒诸如逆转录病毒。可以容易地采用未命名但本领域已知的其它病毒。
[0039]优选的病毒载体基于其中非必需基因已经被目的基因替换的非细胞病真核病毒。非细胞病病毒包括逆转录病毒(例如慢病毒)，其生命周期涉及基因组病毒RNA反转录成DNA，随后前病毒整合入宿主细胞DNA中。逆转录病毒已经被批准用于人基因治疗试验。最有用的是复制缺 陷的那些逆转录病毒(即，能够指导期望蛋白质的合成，但是不能够产生感染颗粒)。此类基因工程改变的逆病毒表达载体通常可用于体内基因的高效转导。用于产生复制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包括将外源遗传物质整合入质粒中、以质粒转染包装细胞系、由包装细胞系产生重组逆转录病毒、从组织培养基收集病毒颗粒、和以病毒颗粒感染祀细胞的步骤)在Kriegler, 1990和Murry, 1991中提供。
[0040]对于某些应用的优选病毒是腺病毒和腺相关(AAV)病毒，其是已经批准用于人基因治疗的双链DNA病毒。事实上，12种不同的AAV血清型(AAV1至12)是已知的，各自具有不同的组织嗜性(Wu，ZMol Ther2006 ; 14:316-27)。重组AAV衍生自依赖性细小病毒AAV2 (Choi, Vff J Virol2005 ；79:6801-07)。腺相关病毒I至12型可以被工程改造成复制缺陷型的并且能够感染大量细胞类型和种类(Wu，Z Mol Ther2006 ;14:316_27)。其还具有优点诸如，热和脂质溶剂稳定性；在不同谱系细胞，包括造血细胞中的高转导频率；和缺乏重复感染抑制因此允许多重转导系列。据报导，腺相关病毒可以以位点特异性的方式整合入人细胞DNA中，由此使逆转录病毒感染所特有的插入诱变和所插入基因表达变异性的可能性最小化。此外，在缺乏选择压力的情况下，野生型腺相关病毒感染已经在组织培养中传代超过100代，这意味着腺相关病毒基因组整合是相对稳定的事件。腺相关病毒还可以以染色体外方式起作用。
[0041]其它载体包括质粒载体。质粒载体已经在本领域中广泛描述并且是本领域技术人员众所周知的。参见例如Sambrook等人，1989。在最近几年中，质粒载体已经用作DNA疫苗用于体内向细胞递送编码抗原的基因。对于此它们是特别有益的，因为它们不具有与许多病毒载体所具有的相同的安全性问题。然而，具有与宿主细胞相容的启动子的这些质粒可从质粒内有效编码的基因表达肽。一些常用的质粒包括pBR322、pUC18、pUC19、pRC/CMV、SV40和pBlueScript。其它质粒是本领域普通技术人员众所周知的。此外，质粒可以使用限制酶和连接反应以去除和添加特定的DNA片断而定制设计。质粒可以通过多种肠胃外、粘膜和局部途径递送。例如，DNA质粒可以通过肌肉内、皮内、皮下或其它途径注射。其还可通过鼻内喷雾剂或滴剂、直肠栓剂和口服施用。它还可使用基因枪施用至表皮或粘膜表面。质粒可在水溶液中提供，在金颗粒上干燥或与另一种DNA递送系统结合，所述另一种DNA递送系统包括但不限于脂质体、树状聚合物、蜗形体(cochleate)和微囊。
[0042]在一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸序列在异源调控区，例如，异源启动子的控制下。启动子可以对于Muller胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞是特异性的。例如，在Mu11 er胶质细胞中的特异性表达可以通过合适的谷氨酰胺合成酶基因的启动子来获得。启动子也可以是，例如，病毒启动子，诸如CMV启动子或任何合成的启动子。
[0043]根据本发明，“气道高反应”或“AHR”是指气道异常，其由对许多环境触发物诸如过敏原和运动的气道变窄反应增加组成。AHR可以是由炎症或气道重塑引起的呼吸系统的功能性改变。气道高反应可由胶原蛋白沉积、支气管痉挛、气道平滑肌肥大、气道平滑肌收缩、粘液分泌、细胞沉积、上皮的破坏、上皮穿透性的改变、平滑肌功能或敏感性的改变、肺实质的异常和/或气道内和周围的浸润性疾病而引起。这些致病因素中有许多可与炎症相关。本发明涉及任何气道高反应，包括与气道的炎症相关的气道高反应(例如嗜酸性粒细胞增多和炎性细胞因子产生)。
[0044]如本文所使用，“降低气道高反应”是指受试者中任何可测量的气道高反应的降低和/或发生气道高反应的发生率或频率的任何降低。优选地，气道高反应降低了，最佳地，降低至受试者不再遭受不适和/或由气道高反应导致或与气道高反应相关的功能改变的程度。AHR的降低可以使用本领域中已知的任何合适方法来测量。呼吸功能可以通过，例如，肺量测定法、体积描记法、峰值流量、症状评分、生理体征(即呼吸速率)、气喘、运动耐量、使用急救药物(即支气管扩张药)和血液气体来测量。
[0045]在具体实施方案中，气道高反应与过敏性炎症相关。
[0046]在具体实施方案中，受试者患有选自以下的气道疾病:哮喘、慢性阻塞性肺疾病、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性肺炎、嗜酸粒细胞性肺炎、肺气肿、支气管炎、过敏性支气管炎、支气管扩张、囊性纤维化、结核病、过敏性肺炎、职业性哮喘、结节病、反应性气道疾病综合征、间质性肺病、嗜酸粒细胞增多综合征、鼻炎、鼻窦炎、运动诱发的哮喘、污染诱发的哮喘和肺寄生虫病。优选地，受试者患有哮喘、慢性阻塞性气道疾病、职业性哮喘、运动诱发的哮喘、污染诱发的哮喘和反应性气道病综合征，具有慢性阻塞性气道疾病。受试者还可以患有与病毒感染诸如由呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、鼻病毒(RV)或腺病毒引起的感染相关的气道高反应。
[0047]本发明的试剂可以如下定义的药物组合物形式施用。优选地，所述试剂以治疗有效量施用。“治疗有效量”是指在适用于任何医学治疗的合理效益/风险比下，所述试剂足以治疗AHR的量。
[0048]应该理解的是，试剂或包含其的药物组合物的总的每日使用量由主治医生在合理的医学判断的范围内决定。用于任何特定受试者的具体的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括:待治疗的疾病和疾病的严重程度；所使用的特定化合物的活性；所使用的特定组合物、受试者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；所使用的特定试剂的给药时间、给药途径和排泄速率；治疗持续时间；与所使用的特定试剂组合使用或同时使用的药物；和医学领域内众所周知的类似因素。例如，本领域技术人员众所周知的是，以低于获得期望治疗效果所需的水平开始试剂的剂量，并逐渐增加剂量直到获得期望的效果。但是，试剂的日剂量可以在每位成人每天0.01至1，OOOmg的较宽的范围内变化。优选地，组合物含有0.01、0.05,0.1,0.5、1.0,2.5,5.0,10.0,15.0,25.0,50.0、100、250 和 500mg 试剂，以对症调整待治疗的受试者的剂量。药物通常含有约0.01mg至约500mg的活性成分，优选含有Img至约IOOmg的活性成分。药物的有效量通常以每天0.0002mg/kg至约20mg/kg体重,特别是以每天约0.0Olmg/kg至7mg/kg体重的剂量水平提供。
[0049]因此本发明的试剂可以配制成药物组合物，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或媒介物。在一个实施方案中，本发明涉及包含上述本发明的试剂和药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或媒介物的药物组合物。在一个实施方案中，本发明是包含有效量的本发明的试剂或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或媒介物的药物组合物。药学上可接受的载体包括，例如，关于期望施用形式合适地选择并且与常规药物实践一致的药物稀释剂、赋形剂或载体。
[0050]药学上可接受的载体可以含有不过度抑制试剂的生物活性的惰性成分。药学上可接受的载体应当是生物相容的，例如，在向受试者施用之后，无毒、无炎性、无免疫原性或缺乏其它不期望的反应或副作用。可以采用标准药物配制技术。
[0051]如本文所 使用，药学上可接受的载体、佐剂或媒介物包括适合于所需特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington’s PharmaceuticalSciences, Sixteenth Edition, E.ff.Martin (Mack Publishing C0., Easton, Pa., 1980)公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体和用于其制备的已知技术。除了任何常规载体介质与本文所述的化合物不相容的程度，诸如通过产生任何不良生物效应或者另外以有害方式与药学上可接受的组合物的任何其它组分相互作用，否则其用途涵盖在本发明的范围内。
[0052]可作为药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如人血清白蛋白)、缓冲物质(诸如twinSO、磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾)、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐，或电解质(诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠或锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羊毛脂、糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇；如丙二醇或聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer’s solution);乙醇和磷酸盐缓冲溶液；以及根据配制者的判断，所述组合物中也可存在的其它无毒可相容润滑剂，诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
[0053]根据所治疗的气道高反应的严重性，本文所述的组合物可以口服、胃肠外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道或经由植入储库施用。如本文所使用，术语“肠胃外”包括，但不限于，皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。
[0054]本文所述组合物的无菌注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可根据本领域已知技术使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可为在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如，作为1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受载体和溶剂为水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，通常使用无菌的、非挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何温和的非挥发油，包括合成的单-或二-甘油酯。脂肪酸，诸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，如作为天然药学上可接受的油，诸如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或类似的分散剂，其通常用于制备药学上可接受的剂型，包括乳剂和悬浮剂。其它常用的表面活性剂，诸如吐温、司盘和通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它乳化剂或生物利用度增强剂，也可以用于配制目的。
[0055]本文所述的药物组合物可以以任何口服可接受的剂型口服施用，所述剂型包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在用于口服使用的片剂的情况下，常用的载体包括，但不限于，乳糖和玉米淀粉。还典型地添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要水性悬浮液用于口服使用时，所述试剂与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，还可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。
[0056]或者，本文所述的 药物组合物可以以用于直肠施用的栓剂形式来施用。这些可以通过将试剂与在室温下为固体、但在直肠温度下为液体、因此将在直肠中熔融以释放药物的合适的无刺激性赋形剂混合而制备。此类材料包括，但不限于，可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
[0057]还可以将药物组合物施用于呼吸道。肺部递送组合物可以通过受试者吸入分散体而递送，从而使得分散体内的试剂可以达到肺部，在其中其可以，例如，容易地通过肺泡区直接吸收进入血液循环。肺部递送可以通过不同方法实现，包括使用雾化、气溶胶化、胶束和基于干燥粉末的制剂；通过吸入施用可以是经口和/或经鼻的。递送可以使用液体喷雾器、基于气溶胶的吸入器和干燥粉末分散体装置来实现。计量装置是优选的。使用喷雾器或吸入器的益处之一在于，使污染的可能性最小化，因为装置是自含的。例如，干燥粉末分散体装置递送可以容易地配制为干燥粉末的药物。本发明的药物组合物可以以本身或与合适的粉末载体组合稳定地保存为冻干或喷雾干燥的粉末。用于吸入的本发明药物组合物的递送可以通过计量定时元件来介导，所述计量定时元件可以包括计时器、剂量计数器、时间测量装置或时间指示器，当加入装置时其在施用气雾剂药物的过程中能够实现受试者的剂量追踪、顺应性监测和/或剂量引发。用于气雾剂递送的药物装置的实例包括计量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和空气喷射喷雾器。
[0058]本发明的另一个目的涉及用于确定受试者是否处于患有或发展气道高反应的风险的方法，包括测定从所述受试者获得的生物样品中S100B蛋白的水平。
[0059]如本文所使用，术语生物样品涵盖从患者获得的用于确定受试者是否处于患有或发展气道高反应的风险的目的的任何样品。通常，所述生物样品可以是血液样品或支气管肺泡灌洗液样品。
[0060]确定生物样品中S100B的水平可以通过多种技术来进行。通常，确定所述水平包括将样品与抗S100B的结合伴侣接触，从而检测精液样品中S100B的存在或测定精液样品中S100B的量。如本文所使用，术语“结合伴侣”是指任何能够以高亲和力结合生物标志物的(天然或非天然的)任何分子。所述结合伴侣包括但不限于抗体或适配子。
[0061]本发明的结合伴侣，诸如抗体或适配子，可以用可检测的分子或物质标记，诸如，优选荧光分子、或放射性分子或任何其它本领域已知的标记。本领域已知通常(直接地或间接地)提供信号的标记。如本文所使用，关于抗体或适配子的术语“标记的”意图涵盖通过将可检测物质，诸如荧光团[例如异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或靛青(Indocyanine) (Cy5)])或放射性试剂偶联(即，物理连接)至抗体或适配子而对抗体或适配子进行直接标记，以及通过与可检测物质的反应性对探针或抗体进行间接标记。本发明的抗体或适配子可通过本领域已知的任何方法用放射性分子来标记。例如放射性分子包括但不限于用于闪烁照相研究的放射性原子，诸如1123、1124、Inlll、Rel86、Rel88。
[0062]接触可以在任何合适的装置(诸如板、微量滴定皿，试管、孔、玻璃、柱等)中进行。在具体实施方案中，接触在用结合伴侣包被的基底上进行。基底可以是固体或半固体基底，诸如任何适合的支持物，包括玻璃、塑料、尼龙、纸、金属、聚合物等。基底可以是各种形式和尺寸，诸如载玻片、膜、珠、柱、凝胶等。接触可以在任何适于在结合伴侣和样品的生物标志物之间形成可检测的复合物(诸如抗体-抗原复合物)的条件下进行。
[0063]S100B的存在可以使用标准的电泳和免疫诊断技术来检测，所述技术包括免疫测定法，诸如竞争、直接反应或夹心型测定法。此类测定法包括，但不限于，Western印迹；凝集试验；酶标记和介导的免疫测定法，诸如ELISA ;生物素/抗生物素蛋白类型分析；放射免疫测定法；免疫电泳；免疫沉淀等。反应通常包括显示标记，诸如荧光、化学发光、放射性、酶标记或染料分子，或用于检测抗原和抗体或与其反应的抗体之间的复合物的形成的其它方法。
[0064]上述测定法通常涉及将液相中未结合的蛋白与结合抗原-抗体复合物的固相支持物分离。可用于实施本发明的固体支持物包括基底诸如硝基纤维素(例如，膜或微滴定孔的形式)；聚氯乙烯(例如，片或微滴定孔)；聚苯乙烯胶乳(例如，珠或微滴定板)；聚偏氟乙烯；重氮化纸(diazotized paper);尼龙膜；活化珠、磁反应性珠(magneticallyresponsive bead)等。
[0065]更具体地，可使用ELISA方法，其中微滴定板的孔包被有抗待测试蛋白的抗体。然后将含有或怀疑含有标记物蛋白的生物样品加入包被的孔中。在孵育足够时间以使得形成抗体-抗原复合物后，可以洗涤该板以除去未结合的部分，再加入可检测地标记的二级结合分子。使二级结合分子与任何捕获的样品标志物蛋白反应，洗涤板并使用本领域众所周知的方法检测二级结合分子的存在。
[0066]本发明的方法可以进一步包括由将S100B的表达水平与参考值进行比较组成的步骤，其中检测到样品中测定的表达水平与参考值的差异指示受试者是否处于患有或发展气道闻反应的风险。
[0067]在一个实施方案中，参考值可以是指数值，或者可以源自一个或多个气道高反应事件的风险预测算法或计算指数。参考值可相对于源自群体研究的数字或值，包括不限于具有类似的机体质量指数的受试者、相同或类似年龄范围的受试者、相同或类似种族的受试者、具有气道疾病的家族史的受试者,或相对于可引起气道高反应的经历气道疾病治疗的受试者的起始样品。在本发明的一个实施方案中，参考值从源自一个或多个基本健康的受试者(即，无气道高反应的受试者)的对照样品中SlOOB的水平获得。此类基本健康的受试者缺少气道高反应的传统风险因子:例如，目前不吸烟，无诊断出的气道疾病病史。在另一个实施方案中，在此类测试之后的诊断上相关的时期(“纵向研究”)内监测和/或周期性再测试此类受试者以验证气道高反应事件的持续不存在。此类时期可以是从确定参考值的起始测试日期起的I年、2年、2到5年、5年、5到10年、10年、或10年或以上。此外，可使用适当累积的历史受试者样品中的S100B水平的追溯测量来产生这些参考值，从而缩短所需研究时间，假定受试者在产品诉求(product claim)的预期范围的干预期间已被适当随访。通常，处于气道高反应的风险的受试者中S100B的水平被认为高于从普通群体或从健康受试者获得的参考值。
[0068]本发明将进一步以以下附图和实施例进行说明。然而，这些实施例和附图将不以任何方式解释为限制本发明范围。
【专利附图】

【附图说明】
[0069]图1:在wt小鼠中LPS灌输后肺和血清中S100B蛋白的幻影的动力学。5只小鼠的组用LPS(IOyg)灌输并在不同时间点(0、30min、2h、4h、和6h)安乐死。通过测量中性粒细胞募集(A)Ji (B)和血清(C)中IL-6、TNF-a和S100B浓度(μ g/ml)来控制炎症幻影。LPS诱导肺(直到30min(C))中和血清(直到4h)中S100B的产生。所有结果都通过平均值+sem表示。
[0070]图2:在SlOOb+和 SlOOb+小鼠中气道高反应的评估。鼻内施用对照盐水(NaCl)溶液不影响wt中的PenH，也不影响SlOOb+(A)和SlOOb+(B)中的PenH。该实验进行两次，对于每个条件使用5只小鼠。一个拷贝S100B基因的丧失趋于降低PenH值(A)，而这些值在SlOOb+小鼠中显著降低⑶。通过中性粒细胞募集(C) ,BALF中IL-6和TNF- α细胞因子(D)和髓过氧化物酶(MPO)活性来测量肺部炎症。NaCl不影响任何参数。LPS细胞和炎症反应没有显示与wt相比杂合子或纯合子突变体中测量的参数的任何变化。
[0071]图3:用S100B抗体处理降低LPS依赖的气道高反应。5只小鼠的组用对照等渗NaCl溶液、LPS或LPS加上I或2mg S100B抗体处理。该实验在C57BL/6J小鼠上进行两次。Img S100B抗体足以降低PenH值(A),但使用2mg的反应更均匀(homogenous)。S100B抗体的存在不改变LPS刺激后24H中性粒细胞募集⑶、BALF中的MPO活性(C)或TNF- a (D)和IL-6(E)浓度。
[0072] 图4 =SlOOB抗体对Prmt2+/_小鼠(LPS反应增加的模型)的效果的表征。⑷与用等渗盐水溶液(NaCl)处理的对照小鼠相比，用LPS灌输的Prmt2+~j、鼠显示AHR加重。施用2mg S100B抗体显著降低所述反应。与wt小鼠相比，Prmt2+/_小鼠在LPS灌输后具有增加的炎症，其特征在于中性粒细胞募集(B)、BALF中的MPO活性(C)以及TNF-α⑶和IL_6(E)浓度的增加。施用S100B抗体不改变增加的肺部炎症反应，表明Prmt2和S100B在调节肺部炎症中的独立作用。所有结果都通过平均值+sem表示。Student’ s t-检验:*P < 0.05。[0073]图5 =MslYah小鼠模型中SlOOb的表达。(A)在对照和MslYah突变小鼠中全身注射LPS后90分钟，与对照小鼠相比，发现BALF中的S100B浓度更低。在盐水对照溶液(NaCl)注射(A)后或在血浆血清⑶中没有观察到变化。与MslYah(C)相比，LPS刺激后2h,在Prmt2突变小鼠的肺中SlOOb的表达增加。Student’ s t_检验:**P ^ 0.01。
[0074]图6 =SlOOb中和抗体降低OVA模型中的肺反应。(A)与对照小鼠相比，在OVA敏化的BALB/cJ小鼠之后观察到嗜酸性粒细胞的募集(η = 6个体的组；重复两次)。(B)在最后OVA敏化后BALB/cJ血清中SlOOb浓度增加，并且乙酰甲胆碱(Mch)增强了最后卵清蛋白注射后24小时的S100B的产生。如果不将小鼠针对OVA敏化并且在Mch之前16h用中和抗体处理，则没有发现呼吸作用。相反，与未处理的小鼠相比，最后OVA敏化前16h注射的中和抗体显著降低处理小鼠中的Penh值。Student’ s t_检验:*P < 0.05。
[0075]图7:NaCl(A、B、D)或LPS处理(C、E)后4h来自wt小鼠的苏木素染色的肺切片上SlOOb蛋白的免疫组织化学染色(初始放大倍数:A:x40 ；B-E:x20)。(A)稀有细胞，可能是驻留的肺泡巨噬细胞(A)，在未刺激肺中是SlOOb阳性的。(B-E)LPS灌输后，在肺泡(B-C)和细支气管周围(D、E)，表达S100B的细胞数明显增加。
【具体实施方式】
[0076]实施例1:在LPS诱导的急性肺损伤和卵清蛋白诱导的哮喘模型中SlOO钙结合蛋白B调节气道反应
[0077]介绍
[0078]呼吸道疾病(RD)诸如哮喘的患病率在过去几十年内增加了(Umetsu等人，2002)。为了更好地理解病理生理学、鉴定关键标志物和测试治疗策略，在小鼠中开发了 RD模型(Matute-Bello等人，2008 ;Nials和Uddin, 2008)。因此，灌输脂多糖(LPS)在小鼠中诱导了类似于急性肺损伤的肺反应，并且对卵清蛋白(OVA)敏化、随后乙酰甲胆碱刺激目前用于模拟哮喘。那些RD模型引发炎症和免疫应答，对肺上皮细胞具有特异性作用。
[0079]LPS刺激后，气道表现出可以通过非侵入性体积描记法监测的高反应。在气道中募集并激活巨噬细胞和中性粒细胞，并且局部产生炎症细胞因子，诸如TNF-α和IL-6。简而言之，与额外分子结合或不结合的LPS结合其受体TLR4，其导致NF- κ B转录因子的激活，所述转录因子转位至细胞核，在细胞核中其刺激基因转录(Dalloneau等人，2011a ；Karin和Ben-Neriah, 2000 ；Takeda和Akira, 2007)。除了经典途径，LPS诱导支气管肺泡空间(Uchida, 2006)中AGER “高级糖基化终产物特异性受体”(也称为RAGE)及其配体SlOO钙结合蛋白B SlOOb (Morbini等人，2006)的表达的增加。AGER属于细胞表面受体的免疫球蛋白超家族。AGER通过TIRAP和MyD88与TLR信号传导通路相互作用，以调节炎症反应和其它功能(Sakaguchi等人，2011b)。AGER在发育过程中以组成型方式表达，然后在成年期其表达被限制在某些组织中(Brett等人，1993 ；Sasaki等人，2001)。然而,其表达在肺中更为重要，其中其在I型和II肺泡肺细胞中、巨噬细胞中和支气管上皮细胞中被发现(Cheng等人，2005 ；Dahlin, 2004 ；Morbini 等人，2006)。 [0080]SlOOb是AGER配体之一，属于具有Ca2+-结合特性的25种蛋白的家族(Donato, 2001 ;Donato等人，2009)。像其它家族成员，SlOOb涵盖通过铰链区互连的EF-手型的两个Ca2+-结合位点和C-末端区域(Donato, 1999)。SlOOb作为同源二聚体(Rustandi等人，2000)或作为S100b/S100al异源二聚体(Donato, 2001)存在。SlOOb在有限数量的细胞类型中表达，根据细胞类型和微环境具有不同结果。细胞内SlOOb可以改变细胞增殖和分化(Arcuri, 2004)，调节微管装配(Donato, 1988)、调节p53依赖的转录(Wilder等人，2006)或抑制细胞凋亡和分化(Donato等人，2009)。此外，SlOOb由星形胶质细胞释放至细胞外空间中(Eldik和Zimmer, 1987),并且其还在血清中被发现(Donato等人，2009)。作为细胞外因子，SlOOb与AGER相互作用，并根据蛋白浓度、细胞类型和微环境导致有益或有害结果(Donato等人，2009)。在人肺部，在支气管周围神经和间质树突细胞的水平表达SlOOb (Morbini等人，2006)。SlOOb与AGER的结合激活内皮细胞和肌肉肺细胞、单核细胞以及淋巴细胞T,其涉及细胞因子和促炎粘附分子的产生(Donato等人，2009 ;Hofmann等人，1999 ；Yan 等人，2003)。
[0081 ] 在本研究中，我们进一步继续MslYah小鼠的研究，所述MslYah小鼠携带Col6al-Prmt2遗传区间的缺失，并且在LPS刺激后显示更强的炎症反应和抑制的气道高反应(AHR) (Besson等人，2007)。我们证实了 Prmt2在炎症反应增加和AHR(这是比MslYahLPS-诱导的表型更强且相对的反应)中的作用(Dalloneau等人，2011a)。我们用在小鼠中LPS灌输后肺和血清中产生的SlOOb发现了新的候选物。因此，我们通过使用基因敲除方法或使用中和抗体研究了改变SlOOb功能的后果，并且我们发现，SlOOb在控制LPS诱导的AHR中是关键作用因子。此外，我们证明，中和抗体处理在哮喘的OVA敏化模型中降低了乙酰甲胆碱诱导的气道反应性。这些观察结果将SlOOb作为调节支气管高反应性的级联的主要贡献者，并强调SlOOb阻断作为用于治疗RD包括急性肺损伤和哮喘的潜在治疗策略。
[0082]材料和方法:
[0083]小鼠品系
[0084]S100B+/_小鼠由 Xiong等人(44)描述，其携带SlOOb的外显子2 (其包括ATG翻译起始密码子)的缺失，其侧翼5’和3’内含子序列被新霉素抗性(neo)选择盒替换。在标准条件下用两对引物通过PCR鉴定野生型和突变体SlOOb等位基因的存在。Prmt2和MslYah突变小鼠之前已有描述(Besson等人，2007 ；Dal1neau等人，2011b ；Yoshimoto等人，2006)。
[0085]施用LPS诱导的内毒素休克
[0086]在深度麻醉下通过鼻内灌输用等渗盐水溶液或10 μ g LPS (大肠埃希氏菌，血清型055B5, IOmg, Sigma - Aldrich, St Louis, USA)处理动物(η = 10)。在 LPS 灌输前 16h 通过
1.P.施用Img或2mg的多克隆抗S100B抗体(Santa cruz)。
[0087]气道抗性和支气管肺泡灌洗液
[0088]在深度麻醉下通过鼻内灌输用等渗盐水溶液(NaCl0.9% )或10 μ g LPS (大肠埃希氏菌，血清型 055B5, IOmg, Sigma - Aldrich, StLouis, USA)处理动物(η = 10)。使用全身体积描记法和PenH(负责呼吸概况的无量纲参数)的测量结果，考虑在呼吸周期过程中在封闭室中测量的呼气期和压力变化(EMKA Technologies, Paris, France)，在处理后6h期间内研究气道反应。可以将PenH概念化为胸流量和鼻流量曲线的相移。相移增加与呼吸系统阻力增加相关。通过式PenH = (Te/RT-l)X PEF/PIF计算PenH，其中Te为呼气时间，RT为松弛时间，PEF为呼气流量峰值，且PIF为吸气流量峰值(Togbe等人，2007)。使用Datanalyst软件(EMKA Technologies)分析数据，并表示为平均值土sem(平均值的标准误差)。刺激后二十四小时，将小鼠安乐死并如前所述分析BALF的细胞组成和细胞因子定量。等分试样用台盼蓝溶液进行染色并分析，以确定细胞含量。在显微载玻片上离心后，将空气干燥的制备物固定，并使用May-Griinwald-Giemsa着色法用Diff-Quick(Merz&Dade)染色。两次计数两百个细胞，用于测定BALF中每种细胞类型的差异计数。将一部分肺储存在_80°C用于髓过氧化物酶(MPO)测定(Besson等人，2007 ；Dal1neau等人，2011a)。
[0089]细胞因子的测量和髓过氧化物酶测定法
[0090]使用供应商(RnD Systems)的方案在标准条件下通过Elisa测试评估IL-6和TNF-α浓度。以V4稀释血清并未稀释地使用BALF。通过读板器EL800 (ΒΙ0-ΤΕΚINSTRUMENTS)阅读96孔板。对于MPO测量，用盐水灌注右心室以冲洗血管内容物，并将肺冷冻在-80°C直至使用。将肺通过polytron匀浆并离心，并弃去上清液。将沉淀重悬浮于Iml含有0.5%十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)和5mM EDTA的PBS中。离心后，将50 μ I上清液置于具有200 μ I PBS-HTABEDTA、2ml HBSS、100 μ I 邻-联茴香胺二盐酸盐(1.25mg/ml)和100 μ I Η2020.05%的试管中。在搅拌器中在37°C下孵育15min后，用100 μ I NaN31%停止反应。将MPO活性测定为在460nm针对介质的吸光度。
[0091]施用LPS诱导的全身内毒素休克
[0092]小鼠接受腹腔注射100 μ g LPS (血清型055B5) (η = 10)或盐水对照溶液(η = 6)，以评估体内全身炎症反应(Besson等人，2007)。90min后,将小鼠安乐死,通过股静脉收集血液并以2000rpm离心15min，收集血清并储存在_20°C下用于细胞因子测定。然后，打开胸部，并通过将IOml PBS注入心脏的右心室而洗涤肺。肺褪色成白色。然后移除心脏-肺块，然后将肺分离并储存在浸在液氮中的管中。使用肺来通过QRT-PCR研究目标基因的表达。
[0093]OVA敏化和肺反应
[0094]我们开发了用于哮喘的急性鼠模型。在第I和7天通过腹膜内注射100 μ I由无菌NaClO, 9% 中 20mg/ml 氧氧化招(Sigma A8222, Sigma-Aldrich)中吸附的 0，5mg/ml OVA(卵清蛋白，0VA，V级-Sigma)构成的溶液而敏化雄性BALB/cJ小鼠。然后在第18至21天以卵清蛋白攻击小鼠。为此，将小鼠用氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(3，5mg/kg)麻醉,并用25 μ 10，4mg/ml的OVA溶液灌输。在第17天，首次攻击之前16h，一组小鼠通过1.p.接受2mg抗S100B抗体(Santa Cruz)。对照组仅用NaClO, 9%敏化和攻击。如上所述,在第22天，在最后攻击后18和24h之间，通过全身体积描记法评估支气管反应性。在第22天，就在体积描记法获取之后，收集血清、BALF和肺样品。对于每组总数12只动物，进行两次实验。在体积描记器上获取的方案由30min稳定化小鼠(未记录值)，然后30min测量基础值(记录，称为基础值)，然后雾化NaCl0.9% 30秒和随后30min记录信号，然后四次雾化30秒的渐增量的乙酰甲胆碱(0.05 ;0.1 ;0.2和0.3M)(被20min记录信号所间隔)所组成。然后用Datanalyst软件处理数据。
[0095]SlOOb的免疫检测
[0096]为了免疫检测S100B、α-肌动蛋白和SV2，将肺通过在6小时过程中浸溃在PBS中的冰冷4% (w/v) PFA中而固定，在PBS中洗涤，并包埋在石蜡中。免疫染色之前，将来自石蜡包埋组织的组织学切片收集在载玻片上，在40分钟过程中在94 °C浴中用Tr i s-EDTA缓冲液(IOmM Tris碱，ImM EDTA溶液，0.05% Tween20, pH9.0)处理。对于免疫染色，在4°C下将切片与单独的兔多克隆抗体SlOOB (1/10000稀释，HPAO15768, Sigma Aldrich)孵育过夜用于色原免疫染色，或者与兔多克隆抗体S100B (1/10000稀释，HPA015768，Sigma Aldrich)与小鼠单克隆抗体 SV2 (1/500稀释 SV2_c, Developmental Studies Hybridoma Bank)或肌动蛋白α平滑肌(1/10000稀释，Α5228，Sigma Aldrich)的组合孵育过夜用于双重免疫荧光染色。对于SlOOb的色原免疫染色,根据制造商的说明书,使用elite vectastain ABC技术(PK-6101, Vector)实现主要抗体的检测。使用二氨基联苯胺片(D4168, Sigma Aldrich)显示过氧化物酶。对于免疫突光，通过使用1/500稀释的Cy3-结合的山羊抗兔IgG(JacksonTmmuno Research Laboratories)(对于 S100B)或 Alexa-Fluor-488-结合的小鼠抗体(Molecular Probes ;对于SV2和肌动蛋白)将切片在室温孵育I小时而实现主要抗体的检测。将切片用DAPI复染。
[0097]统计分析
[0098]经由Statgraphics 软件(Centurion XV, Sigma plus, Levallois Perret)使用参数 Fischer Student’ s t_ 检验(当适用时)或非参数 Wilcoxon Mann - Whitney’ s U 检验进行统计分析。值表示为平均值土SEM，且显著性阈值为P〈0.05，或另有说明。
[0099]研究批准
[0100]所有小鼠程序由ICS或TAAM的当地伦理委员会批准。YH,作为本研究中的主要研究员，被授予认证45-31和67-369以进行所报道的实验。
[0101]结果:
[0102]LPS刺激后SlOO b在肺和血清中表达
[0103]为了研究SlOOb在LPS诱导的呼吸和炎症反应中的作用，我们首先检查了 LPS攻击后蛋白的产生。C57BL/6J(B6)小鼠组用LPS(IOyg)灌输并在不同时间点(0、30min、2h、4h、和6h)安乐死。我们通过测量支气管肺泡灌洗流体中巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数目加上两种促炎细胞因子TNF-α和IL-6的浓度评价肺炎症(BALF ;图1)。在O和2h之间，巨噬细胞是BALF中发现的主要细胞类型。2h后中性粒细胞开始被募集，并且我们观察到在2h和4h之间巨噬细胞减少和中性粒细胞增加的转变(图1A)。TNF- α已经在O和30min以弱浓度检测到，并且强烈产生，直到LPS攻击后2h (图1B)。IL-6的分泌在30min开始，其中在2h时有重要增加(图1B)。在LPS刺激后30min，在BALF中强烈产生SlOOb，显示在2h的集中聚集(a pick of accumulation),随后LPS处理后缓慢减少(图1)。我们在血清中观察到相同现象，其中在Omin时TNF-α已经以低水平存在。LPS刺激后4h，TNF-α、IL-6和SlOOb的血清浓度以敏感方式增加(图1C)。所有这些结果显示，SlOOb在肺和血清中表现出与促炎细胞因子相同的动力学。因此，SlOOb是肺反应的标志物，其聚集动力学与通过LPS直接控制的促炎细胞因子相当类似。
[0104]LPS灌输导致SlOOb+小鼠中AHR降低而不影响肺中的炎症
[0105]根据SlOOb在BALF中的聚集，我们在SlOOb突变小鼠中LPS攻击之后监测肺中的变化。我们使用全身体积描记法，并且我们对反映呼吸模式的暂停增强时间(PenH)评分以评价SlOOb突变小鼠中肺对LPS的反应。如先前显示，携带单一拷贝SlOOb的MslYah小鼠在LPS灌输后具有降低的呼吸反应(Besson等人，2007)。为了研究SlOOb在AHR中的精确作用，我们使用SlOOb的功能丧失等位基因(Xiong等人，2000)，并且我们比较了用LPS(IOyg)或盐水(NaCl)对照溶液灌输的对照野生型(wt)动物、杂合子(S100b+/_)和纯合子(SlOOb—勺突变个体。如由Wt小鼠与S100b+/-和SlOOb+两者中的PenH所评价，用盐水溶液处理不影响呼吸功能(图2A-B)。LPS灌输在wt小鼠中诱导AHR，其特征在于PenH值优于5的增加。S100b+/_小鼠中PenH值趋于降低(图2B)，而SlOOb+小鼠中AHR显著降低(图2A)。两个拷贝SlOOb的丧失对LPS刺激诱导的AHR具有主要影响。
[0106]与野生型小鼠相比，LPS灌输的MslYah小鼠在支气管肺泡空间中具有增强的炎性细胞募集和TNF- α和IL-6产生(Besson等人，2007)，我们将其与Prmt2关联(Dalloneau等人，2011a)。我们研究了 SlOOb在局部炎症反应中的参与。灌输LPS或盐水对照溶液后24小时，我们测量了野生型、S100b+/_和SlOOb+小鼠中LPS诱导的炎症。我们追踪了 BALF中的中性粒细胞募集(图2C)、髓过氧化物酶(MPO)活性(图2D)和TNF-α和IL-6的浓度(图2Ε)。用盐水对照溶液灌输的小鼠没有呈现炎症细胞募集类型的任何变化。测量的炎症参数在wt和S100b+/_或SlOOb+小鼠之间没有呈现任何变化。因此，我们在这里证明，改变SlOOb基因功能强烈损害LPS诱导的AHR，但不干扰肺中的炎症反应。
[0107]中和抗SlOOb抗体降低C57BL/6J小鼠中的AHR而不影响肺中的炎症
[0108]SlOOb的失活降低了 LPS处理后的肺反应而不改变炎症信号的分泌。然后我们想知道抗SlOOb的中和抗体是否改变LPS诱导的AHR。使用注射多克隆抗SlOOb抗体，我们在野生型C57BL/6J(B6)小鼠中进行被动免疫。我们将三组B6小鼠与5个个体进行比较，所述5个个体为:用对照盐水溶液处理的个体、用LPS灌输的另一个阳性对照和接受LPS前16h腹膜内(1.p.)注射Img或2mg抗SlOOb的多克隆抗体的两个额外个体(Vandal等人，2003b)。实验独立地进行两次以达到η = 10个体每组。抗SlOOb预注射导致与仅接受LPS的小鼠相比PenH值的显著降低。Img抗体足以降低AHR,然而使用2mg的反应更均匀(图3A)。抗SlOOb对BALF中观察的炎症没有影响，因为与单独的LPS刺激的小鼠相比，在接受Img或2mg抗体加上LPS的小鼠中测量的参数均没有改变(图3B-E)。此外，在处理的小鼠中没有注意到异常行为变化。在类似条件下用中和抗体处理的BALB/cJ小鼠中观察到类似结果(数据未显示)。所有获得的结果证实，SlOOb参与LPS诱导的AHR。SlOOb的活性可以被中和抗体完全衰减而对LPS攻击过程中的炎症没有强烈后果。
[0109]中和抗SlOOb降低Prmt2+/_小鼠(LPS反应增加的模型)中的AHR
[0110]与wt相比，Prmt2+/_突变小鼠在LPS灌输后呈现出推迟、但加重的AHR(Dalloneau等人，2011a)。这些小鼠还呈现在血清和BALF两者中增加的促炎症反应。然后，我们测试了 SlOOb抗体对Prmt2缺陷小鼠中观察到的气道反应增加的作用。如前一段中描述，在Prmt2+/_小鼠上进行实验。抗S100B处理导致与仅接受LPS的小鼠相比PenH值的显著降低(图4A)。与wt小鼠相比，用S100B抗体处理的Prmt2+〃小鼠表现出相同加重的炎症反应，其具有在BALF中分泌的更高水平的TNF- α和IL-6，与仅接受LPS的Prmt2+/_小鼠类似(图4B-E)。对于Prmt2纯合子突变体发现类似的结果(数据未显示)。
[0111] 然后，我们追踪全身注射LPS后的SlOOb反应。发现SlOOb在肺中比血清中更重要地分泌(图5A、B)。有趣的是，SlOOb的表达被突变小鼠中Prmt2的功能丧失进一步刺激，增强了 SlOOb对于LPS诱导的肺AHR是关键的假设(图5C)。这些结果一方面证实了SlOOb参与LPS诱导的AHR，另一方面证实了 SlOOb不是LPS诱导的炎症反应的诱导的主要作用因子。其证实了(I) SlOOb应当通过LPS诱导的炎症反应中Prmt2依赖性途径、受LPS/TLR4和S100b/AGER信号传导途径控制的NF-Kb转录因子而起作用；和(2)Prmt2和SlOOb功能的抑制对于重现MslYah突变体中LPS诱导的表型是需要的(Besson等人，2007)。
[0112]中和抗SlOOb降低OVA哮喘小鼠模型中的AHR
[0113]SlOOb抗体降低wt和Prmt2+小鼠中LPS诱导的AHR。因此，我们探讨SlOOb在另一种肺攻击、卵清蛋白(OVA)哮喘鼠模型中的效果。用卵清蛋白敏化后，BALB/cJ小鼠在用乙酰甲胆碱进一步攻击后呈现出AHR和组织炎症。肺部过敏性哮喘需要淋巴细胞T辅助细胞2(LTh2型)介导的炎症反应的产生。这些细胞产生IL-4，引发嗜酸性粒细胞募集到炎症部位。我们首先检查了该OVA诱导的哮喘中SlOOb的产生。在第O和7天使两组5只小鼠对卵清蛋白敏化，并且在第18、19、20和21天用过敏原攻击。在第22天，一组接受增加量的乙酰甲胆碱(Mch, O, 05 ;0，I ;0，2和0，3M)。在t = 0、2h、6h和24h时将小鼠处死，并且我们评估了嗜酸性粒细胞的募集和SlOOb产生(图6)。募集嗜酸性粒细胞直至2h，并且在最后攻击后24h仍然存在于BALF。在无Mch的组中，在6h时在血清中检测到SlOOb，但在24h时减少。乙酰甲胆碱似乎放大了反应:用Mch攻击的小鼠显示高于未攻击小鼠中发现的SlOOb浓度。然后我们检查了在幼稚小鼠和敏化小鼠中抗SlOOb的抗体的效果(图6C-D)。在用Mch攻击第22天测量呼吸功能之前，如下所述，将两组6只小鼠敏化，然后以卵清蛋白进行攻击。
[0114]在第17天，OVA攻击前16h，一组接受2mg的S100B抗体。实验独立地重复两次。在对Mch攻击正常反应的对照幼稚小鼠中没有观察到显著效果(图6C)。OVA敏化后，小鼠呈现出对Mch的高反应性，并且我们发现，Mch的量越重要，抗体的效果越显著(图6D)。事实上，与对照小鼠相比，接受抗体的小鼠趋向于具有较低的PenH值。S100B蛋白的抑制在OVA哮喘模型中降低了 Mch-诱导的高反应性。这些结果使得预见能够抑制SlOOb活性的分子尤其在肺疾病诸如哮喘中的治疗影响。
[0115]SlOOb在肺中表达并且在LPS刺激后增加。
[0116]抗SlOOb的中和抗体能够降低AHR，而不改变LPS诱导的炎症反应。然后我们试图破译SlOOb反应的细胞成分是什么？为了检测LPS处理前后鼠肺中的SlOOb，我们在小鼠肺组织切片上进行免疫组织化学。在用NaCl处理的正常条件下，发现SlOOb散布在肺泡壁的细胞中。在肺泡内空间中发现几个表达细胞，并且基于其位置和形态将其鉴定为巨噬细胞(图7A)。LPS灌输后四小时，与对照NaCl处理的肺相比，SlOOb表达在LPS处理的肺中高得多(图7B-E)。用LPS灌输四小时后的肺切片的苏木精和伊红(H&E)染色显示在肺的肺泡和细支气管周围空间中炎症细胞(基本上为表达SlOOb的中性粒细胞和巨噬细胞)的增加。使用免疫荧光法，我们发现，与H&E切片上观察到的炎症细胞类似，表达SlOOb的细胞基本上在肺泡的间质空间中和细支气管周围被发现，显示SlOOb在LPS灌输后募集的巨噬细胞和嗜中性粒细胞中表达。
[0117]由于在抗S100B处理的小鼠中不再观察到LPS介导的AHR，我们检查了均参与肺反应的细支气管周围平滑肌细胞和神经丛中S100B的表达。如用泛神经标志物、已知在NEB和气道神经网络中表达的突触小泡蛋白2(SV2)的双重免疫荧光染色所显示，在支气管上皮下的神经束中和神经上皮体(NEB)中发现SlOOb的表达。如用平滑肌α-肌动蛋白抗体的双重免疫荧光染色所显示，SlOOb不在细支气管周围平滑肌细胞中表达。在表达SV2的神经中观察到SlOOb的整体部分表达，显示SlOOb将被限制在神经的特定区域。
[0118]讨论:[0119]在本报道中，我们证实了 SlOOb在急性肺损伤(ALI)的LPS模型中和OVA哮喘模型中调节呼吸功能的新作用。SlOOb对LPS诱导的AHR的调节具有剂量依赖性作用，而关键炎症参数没有变化。抗SlOOb的中和抗体的使用使得C57BL/6J、BALB/cJ和Prmt2缺陷小鼠中LPS诱导的AHR显著降低(Dalloneau等人，2011b)。在BALF中，SlOOb从刺激的驻留巨噬细胞和肺泡中和细支气管处的平滑肌细胞附近募集的嗜中性粒细胞分泌，表明SlOOb可能干扰AHR过程中肌肉收缩的控制。
[0120]SlOOb与受体AGER的相互作用体内诱导NF- κ B转录因子的激活(Yan等人，1994)，和随后尤其是肝和肺中IL-6的产生(Schmidt等人，2000)以及TNF-α的表达(Hofmann等人，1999)。已知AGER在败血性休克过程中(Yamamoto等人，2011)或在肺中(Yamakawa等人，2011)在与LPS间接或直接相互作用的情况下促进炎症反应。已建议AGER作为肺损伤的标志物(Su等人，2009)，并且其表达在LPS刺激后增加(Zhang等人，2008)。已经描述了 AGER和TLR4信号传导级联之间的交叉对话，但是对于AGER的另一种配体(Park等人，2006 ；Qin等人，2009)。此处，我们在SlOOb突变小鼠中发现两次肺攻击中SlOOb对AHR的直接影响，在LPS诱导的炎症反应中没有差别。没有观察到细胞募集和促炎细胞因子分泌的变化。IL-6和TNF-α的表达不受影响，表明甚至在突变小鼠中不存在SlOOb或使用中和抗体的情况下TLR4/NF- κ B途径没有任何改变。我们发现，当Prmt2(NF-kb的间接抑制剂)失活时，SlOOb表达受LPS调节，并且甚至上调(Dalloneau等人，2011a)。已经在星形胶质细胞和小胶质细胞中观察到SlOOb的此类LPS依赖性表达(Donato等人，2009 ;Guerra等人，2011)。在急性肺攻击模型中，SlOOb通过与TLR4/TIRAP/MYD88/NF-kB途径共享共同中间体的AGER来信号传导，促进气道和炎症反应(Sakaguchi等人，2011a)ο
[0121]三体和部分单体21患者呈现对实际上代表患者的主要死亡原因的呼吸道感染的敏感性增加(Day等人，2005 ；Pandit和Fitzgerald, 2012)。为了破译该现象,我们开发了不同的人21号染色体 区域的非整倍体的鼠模型(Herault等人，2012 ;Raveau等人，2012)。我们之前证实，MslYah模型呈现出不存在LPS诱导的AHR (Besson等人，2007)。Prmt2是MslYah模型中缺失的基因。其属于蛋白精氨酸甲基转移酶家族，并且其调节NF-kb的核聚集。我们表明，Prmt2的表达是剂量敏感的，并且在LPS处理后降低(Besson等人，2007 ；Dalloneau等人，201 Ia)。一个或两个拷贝Prmt2缺陷的小鼠的呼吸模式的研究表明与wt小鼠相比时间也延迟并保持的加重的AHR(Dal1neau等人，2011a)。该结果指出，Prmt2-Col6al区域的至少另一个基因参与MslYah小鼠中观察到的AHR的控制。然后，我们把我们的注意力集中在肺中表达发现的SlOOb (Besson等人，2007)。对于LPS灌输后呼吸模式的本研究显示SlOOb对调节AHR的剂量效应。S100b+/_小鼠中PenH值趋于降低，并且在SlOOb+小鼠中显著降低。我们首次证实了 SlOOb在以剂量依赖性方式诱导的LPS诱导的AHR中的明确作用。类似地，发现SlOOb在OVA哮喘模型中增加，并且中和抗体可以阻止敏化和攻击后部分的乙酰甲胆碱诱导的收缩。基本上已知SlOOb是一些类型癌症(Hwang等人，2010)、脑损伤(ZurekandFedora, 2011)和心脏骤停(Song等人，2010)的标志物，但现在SlOOb应被视为肺反应的标志物。
[0122]功能丧失SlOOb导致呼吸功能的改进，而不改变突变小鼠中肺中的炎症反应。最初，我们检查了野生小鼠中SlOOb的抑制重现了 SlOOb+小鼠中观察到的表型。然后，我们使用阻断抗体来探讨SlOOb在呼吸功能中的作用。用抗S100B抗体处理降低了 LPS诱导的HRA，而不改变B6小鼠中的炎症反应。在呈现加重AHR的Prmt2+/_和PrmtZ+ (数据未显示)小鼠中进行相同实验。该模型允许我们证实该抗体的作用。在这些小鼠中注射抗体导致Penh值的显著降低，而不改变在突变体中保持较高的炎症应答。
[0123]SlOOb属于23钙结合蛋白的家族，并且与相同家族的其它蛋白相反，SlOOb不是肺炎症的主要作用因子。事实上，SlOOaS和S100a9基本上在炎症部位分泌，在那里它们诱导中性粒细胞的趋化和粘附(Ryckman等人，2003 ；Vandal等人，2003a)。S100al2经由与AGER相互作用而起作用，导致促炎介质的分泌(Hofmann等人，1999)。这些SlOO蛋白的血清浓度与炎症疾病活动性相关(Foell等人，2004 ；Frosch等人，2000)。LPS灌输后，我们证实，表达SlOOb的细胞数量增加，但在SlOOb缺陷小鼠中测量的炎症参数不改变，表明SlOOb对于诱导炎症是不必需的。在正常人肺中，SlOOb在间质树突细胞和支气管周围神经中(以高水平)、在烟雾相关损伤中的气道树突状细胞中和肺炎中的间质树突状细胞中(5)表达。此处，我们发现在肺泡驻留巨噬细胞中和LPS激活的巨噬细胞和募集的肺中性粒细胞中表达的SlOOb。但是，即使表达SlOOb的细胞数量在这些肺疾病或攻击过程中增加，该蛋白的确切作用仅通过该系列显示SlOOb是AHR和因此是呼吸道疾病的作用因子的实验而揭示。
[0124]SlOOb是钙结合蛋白，因此其可以参与控制肌肉收缩。SlOOb在细胞的细胞质中发现，并且可以刺激Ca2+流量、抑制PKC-介导的磷酸化和微管组装。如之前所述(5)，在肺中，SlOOb在肺泡驻留巨噬细胞和LPS刺激后募集的中性粒细胞中、神经上皮体周围和神经中表达。没有观察到SlOOb与肺中的平滑肌 细胞的直接共定位。已知SlOOb是控制钙储备的有效性的细胞内和细胞外调节物(18)。如果SlOOb作为Ca2+水平的传感器(sense Ca2+level)，则LPS处理过程中SlOOb的分泌可以促进肌肉收缩，限制钙的扩散。或者，SlOOb可以改变的Ca2+依赖性细胞内信号传导级联，诸如涉及Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白磷酸酶钙调磷酸酶的级联，其上调免疫细胞中许多细胞因子和促炎因子(Crabtree和Olson, 2002)。或者，已知SlOOb与来自细胞骨架的几种蛋白相互作用，并且因此可以介导细胞重塑和细胞迁移(Donato等人，2009)。将需要进一步实验来更好地理解SlOOb在AHR中的分子和细胞机制。
[0125]降低SlOOb功能且在不改变炎症反应的关键参数的情况下降低AHR代表从治疗观点(特别是对于长期治疗)来看代表令人感兴趣的途径。事实上，如果我们考虑哮喘发作，更不利的方面是患者的呼吸困难，这一方面导致细支气管收缩后从细支气管直径(gauge)的降低，另一方面导致粘液产生。因此，在这种情况下，令人感兴趣的是促进支气管扩张而不改变长期治疗中的炎症反应。事实上，用中和抗体治疗可用于降低在过敏性哮喘中或慢性阻塞性支气管肺病中观察到的气道阻力。今天，哮喘的主要治疗仍然是持续时间较短。用糖皮质激素长期治疗诱导一些副作用，诸如高血糖、骨质疏松症、抑郁症(Donihi等人，2006)。在LPS模型中，已经接受抗体的小鼠呈现相对低的PenH值，并且这持续获取的所有持续时间。用单独LPS刺激的小鼠(B6和Prmt2+/-)在60和90min之间呈现出PenH值的上升，然后在达到峰值后，在刺激后180min，这些值找到与已经接受抗体的小鼠相同的基础水平。该观察结果显示，抗SlOOb抗体的效果在LPS模型中至少持续3h ;这不是惊人的，因为来自自身免疫性疾病的治疗中使用的抗体在血清中的半衰期在8天和8周之间变化(Chan和Carter, 2010)。这对于检查抗体在哮喘鼠模型中的作用的有效性和持续时间当然是必要的。所有这些结果首次显示，SlOOb蛋白在支气管收缩中的重要性和SlOOb抗体在LPS鼠模型中的用途揭示了能够抑制SlOOb的分子的潜在治疗作用。
[0126]参考文献
[0127]贯穿本申请，各种参考文献描述了本发明所涉及领域的现状。这些参考文献的公开内容通过引用并入本公开内容。
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【权利要求】
1.用于降低有需要的受试者中的气道高反应的方法，包括向所述受试者施用选自抗SlOOB抗体、抗S100B适配子或S100B基因表达抑制剂的试剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的气道疾病:哮喘、慢性阻塞性肺疾病、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性肺炎、嗜酸粒细胞性肺炎、肺气肿、支气管炎、过敏性支气管炎、支气管扩张、囊性纤维化、结核病、过敏性肺炎、职业性哮喘、结节病、反应性气道疾病综合征、间质性肺病、嗜酸粒细胞增多综合征、鼻炎、鼻窦炎、运动诱发的哮喘、污染诱发的哮喘和肺 寄生虫病。
3.用于确定受试者是否处于患有或发展气道高反应的风险的方法，包括测定从所述受试者获得的生物样品中S100B蛋白的水平。
【文档编号】C07K16/24GK103998466SQ201280062394
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年11月22日 优先权日:2011年11月22日
【发明者】Y·埃罗, E·达隆诺 申请人:国家医疗保健研究所, 斯特拉斯堡大学, 国家科学研究中心