Hiv膜融合抑制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)与一种宿主细胞相融合的一种抑制剂或HIV进入该宿主细胞的抑制剂，该抑制剂包括至少24个、但是优选是26个连续的氨基酸；本发明还涉及一种包括所述氨基酸的药物组合物。
【专利说明】HIV膜融合抑制剂
[0001] 本发明涉及人类免疫缺陷病毒（HIV)与宿主细胞相融合的一种抑制剂或HIV进入 该宿主细胞的抑制剂，该抑制剂包括至少24个、但是优选是26个连续的氨基酸；本发明还 涉及一种包括所述氨基酸的药物组合物。
[0002] 用于治疗HIV的当前疗法总体上靶向病毒酶逆转录酶和/或蛋白酶。然而，HIV的 若干其他酶或结构蛋白（例如包膜糖蛋白）在感染中同样发挥关键作用。
[0003] HIV包膜糖蛋白由两个通过前体gpl60蛋白的蛋白酶剪切产生的相关亚单位 gpl20和gp41组成。它作为三个gpl20和三个gp41亚单位的复合物存在于病毒膜中。gp41 亚单位介导病毒与靶细胞的膜融合，从而允许HIV感染新的细胞。在靶细胞识别和受体结 合中涉及gpl20亚单位。
[0004] 由gp41介导的膜融合过程涉及糖蛋白的构象变化，这允许三聚体gp41的N端区 (N-螺旋）穿透细胞膜。这一插入之后，三个_gp41亚单位的C-端区（C-螺旋）在N-螺 旋上折返。在gp41的N-螺旋区与C-螺旋区之间形成的六聚体α螺旋相互作用（被称作 6_螺旋束）导致细胞膜和病毒膜的密切接近，这最终导致病毒膜与细胞膜融合。
[0005] 抑制这一稳定的6-螺旋束的形成为预防HIV感染提供了一个令人感兴趣的途径。 HIV包膜由带有包膜蛋白的脂双层组成，这些包膜蛋白由在外观上高度糖基化的gpl20蛋 白和gp41跨膜糖蛋白组成。gp41的分子序列包括所谓的"七肽重复（h印tad-r印eat) "区 (HR1和HR2)。一个七肽重复是一个由七个氨基酸的重复模式组成的结构基序。HIV进入宿 主细胞起始于gpl20与细胞CD4受体的结合及其与趋化因子共受体CCR5或CXCR4的随后 结合。这触发了一系列暴露gp41融合结构域的构象变化，该融合结构域插入细胞膜中。然 后，HR2区结合至由对应的HR1区形成的疏水槽，从而形成所述稳定的6-螺旋束。这使得 病毒膜与细胞膜接近以便融合和进入。由此可见，对6-螺旋束形成的干扰阻止了病毒进入 细胞。
[0006] HIV的gp41包含两个形成所述6-螺旋束的肽延伸（被称作HR1和HR2)，6-螺旋 束的形成是在病毒膜与宿主细胞膜融合背后的驱动力。真实的6-螺旋束由3个平行的HR1 延伸（内部的卷曲螺旋）、在外部沿着该内部的卷曲螺旋的槽以反向平行的方式补充的3个 HR2延伸组成。
[0007] 所谓的 N36 (SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL)是 HR1 的一部分并且 所谓的 C34(WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL)是 HR2 的一部分。大多数当前 的肽融合抑制剂是HR2模拟物，并且是C34的类似物或包含C34的部分。肽HR1模拟 物的抗病毒潜力同样被用文件证明并且全部包含N36的最后17个氨基酸，也被称作 N17(LLQLTVWGIKQLQARIL)。N36衍生的肽通常与肽标签融合，该肽标签同样是一个三聚 体卷曲螺旋并且具有有利的溶解性特征，这部分是由于它们包含许多带电荷的侧链。融 合以这样的一种方式发生，使得遵循七肽重复，典型的是卷曲螺旋拉链。此类肽标签 的两个实例是所谓的IQ序列：（RMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKK)和所谓的IZ序列： (IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK)。在目的是找到抑制HIV融合的小分子的实验中，本领域的 普通技术人员测试了许多肽，其中一些来源于关于HR1模拟物的已公开的作品。
[0008] 在本领域中已知的所谓的HIV进入或HIV融合肽的问题之一是这些肽的相对低的 抗病毒活性。这些肽的另一个问题，尤其是当预期被配制为一种适当的药物组合物时，是由 于在所述肽中存在疏水性氨基酸而造成的差的溶解性。其结果是包括那些肽的药物组合物 难于配制并且因此难于研发。
[0009] 此外，在本领域中相信用于最佳抗病毒活性的所谓的HIV进入或HIV融合肽应该 在N端侧包含所谓的"吉姆口袋（Kim pocket)"结合基序或在C端侧包含脂类结合基序。 两侧都被认为是抗病毒活性所不可或缺的。（Eckert (埃克特）和Kim (吉姆），PNAS，2001， 第 98 卷，第 20 期，第 11187-11192 页）。
[0010] 然而，对基于拥有用于药物配制品目的的高抗病毒活性以及可接受的溶解度的肽 和/或小分子的所谓的融合或进入HIV抑制剂仍存在未满足的医学需要。
[0011] 根据本发明，一种肽的衍生物出人意料地显示出在低nM范围内极好的EC5Q的效 力，这些衍生物在N端侧既不包含所谓的吉姆口袋结合基序在C端侧又不包含脂类结合基 序，包括至少24个连接至N封端基团的连续的氨基酸，其中所述N封端基团选自琥珀酰基、 乙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基或异戊酰基的组并且其中所述24个氨基酸的第一个氨基 酸直接连接至该N封端基团或经由另一个选自E、A或a的组的氨基酸间接连接至所述N封 端基团。
[0012] 本发明的肽的长度是至少24个连续的氨基酸长并且连接至N封端基团，其中所 述N封端基团选自琥珀酰基、乙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基或异戊酰基的组并且其中所 述24个氨基酸的第一个氨基酸直接连接至该N封端基团或经由另一个选自E、A或a的组 的氨基酸间接连接至所述N封端基团并且其中
[0013] 第一个氨基酸是C、Hcy、C(Bzl)或N，
[0014] 第二个氨基酸是Y，
[0015] 第三个氨基酸是一种亲脂性氨基酸，
[0016] 第四个氨基酸表示A或R，
[0017] 第五个氨基酸是C、Hey或L，
[0018] 第六个氨基酸是I，
[0019] 第七个氨基酸是一种酸性氨基酸，
[0020] 第八个氨基酸表示丙氨酸或一种酸性氨基酸，
[0021] 第九个氨基酸是L，
[0022] 第十个氨基酸是一种亲脂性氨基酸，
[0023] 第^^一个氨基酸是一种碱性氨基酸，
[0024] 第十二个氨基酸是丙氨酸或一种碱性氨基酸，
[0025] 第十三个氨基酸是一种亲脂性氨基酸，
[0026] 第十四个氨基酸是Q或R，
[0027] 第十五个氨基酸是E，
[0028] 第十六个氨基酸是Q，
[0029] 第十七个氨基酸是Q，
[0030] 第十八个氨基酸是E，
[0031] 第十九个氨基酸是K，
[0032] 第二十个氨基酸是N，
[0033] 第二^^一个氨基酸是E，
[0034] 第二十二个氨基酸是A，
[0035] 第二十三个氨基酸是一种亲脂性氨基酸并且
[0036] 第二十四个氨基酸是L，
[0037] 任选地所述第二十四个氨基酸连接至一个选自R、r、L、Tba或K (棕榈酰）的组的 氨基酸。
[0038] 在一个另外的实施例中，本发明涉及一种上面提及的肽，其中第三个氨基酸选自 A、L、I、F、V、W、Tba、Nva、Abu 或 Cha 的组，
[0039] 第四个氨基酸是R或A，
[0040] 第七个氨基酸选自E或D，
[0041] 当是一种酸性氨基酸时，第八个氨基酸表示E，
[0042] 第十个氨基酸选自I或Tba，
[0043] 当是一种碱性氨基酸时，第i^一个氨基酸是R或K，
[0044] 当是一种碱性氨基酸时，第十二个氨基酸是R或K，
[0045] 第十三个氨基酸选自A、Nva或Abu,并且
[0046] 第二十三个氨基酸是A或L。
[0047] 在另一个实施例中，当前发明涉及一种如上所定义的肽，其中第一个氨基酸和第 五个氨基酸彼此独立地是C或Hcy，并且其中所述第一个氨基酸和所述第五个氨基酸经由 Bl、B2、B3、B21或B22连接。当附接至这些Bl、B2、B3、B21或B22部分（用于对应的桥结 构的这些缩写的含义参见下面）时，获得一种根据本发明的在其N端部分具有一个环状肽 结构（(i-i+4侧链至侧链）的肽：一种所谓的CLIPS肽（用化学方法连接至一个（杂）芳 香族支架上的肽）
[0048] 根据本发明的肽在C端氨基酸处可以直接或间接结合至胆固醇或棕榈酰或其衍 生物。可替代地，它们可以通过包括两个或更多个氨基酸的接头连接。优选地，该接头由两 个、三个或四个氨基酸，更优选是四个氨基酸组成。这些氨基酸可以是天然存在的或合成的 氨基酸。该接头优选包括 Gly-Ser-Gly-Cys (-GSGC-)或 Gly-Ser-Gly-Lys (-GSGK-)。
[0049] 所以，本发明的一部分还是一种如在上面提及的肽，其中当连接至第二十四个氨 基酸时，氨基酸R间接附接至胆固醇或其衍生物，或间接附接至棕榈酰或其衍生物。胆固醇 经由乙酰基结合至C端半胱氨酸酰胺或同型半胱氨酸酰胺的侧链，即用于附接至胆固醇的 接头在其C端侧必有一种半胱氨酸酰胺或同型半胱氨酸酰胺（参见下图2)。
[0050] 所述氨基酸R和所述胆固醇或其衍生物优选地通过一个具有两个 或更多个氨基酸，优选是两个、三个或四个氨基酸，更优选是四个氨基酸（例 如-Gly-Ser-Gly-Cy S-(-GSGC-))的接头连接。
[0051] 可替代地，所述氨基酸R和所述棕榈酰或其衍生物优选地通过一个具有 两个或更多个氨基酸，优选是两个、三个或四个氨基酸，更优选是四个氨基酸（例 如-Gly-Ser-Gly-Lys-(-GSGK-))的接头连接。
[0052] 根据本发明的肽包括一个本身处于二聚体或三聚体构型的氨基酸序列。一个实例 是本发明的肽通过例如一个-s-s-桥用化学方法彼此连接。
[0053] 根据本发明的优选肽分别具有选自下组的氨基酸序列：戊酰基-ECYLACIEALIRAAQ EQQEKNEAALR-NH 2 (其中在该肽中的半胱氨酸（C)部分经由B1连接）以及戊酰基-ECYLACIE ELIRKAQEQQEKNEAALR-NH 2(其中在该肽中的半胱氨酸（C)部分经由B1连接）。
[0054] 根据本发明的另一个优选肽是Suc-ECYLRCIEELIRKAQEQQEKNEAALR-NH 2，其中在该 肽中的半胱氨酸（C)部分经由B1连接。
[0055] 根据本发明的另一个优选肽具有以下氨基酸序列：异戊酰基-E-C(Bzl)-YLALIEEL IRKAQEQQEKNEAALR-NH 2 ο
[0056] 具有选自 Suc-ECYLRCIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGC(胆甾醇基氧羰基甲基）-ΝΗ2 和 Ac-ACYAACIEALIRAAQEQQEKNEAALRGSGC (胆甾醇基-氧羰基甲基）-ΝΗ2的氨基酸序列的肽也 是高度优选的，其中在所述肽中在位置1和位置5处的半胱氨酸（C)部分经由Β1或Β3连 接，然而Β1是最优选的连接。
[0057] 非常优选的是具有氨基酸序列Suc-ECYLRCIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGC(胆甾醇 基氧羰基甲基）_NH2的这种肽，其中在所述肽中的位置1和位置5处的半胱氨酸（C)部分 经由B1连接。
[0058] 根据本发明的优选肽还是：
[0059] · Suc-ENYLRLIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGC (胆甾醇基-氧羰基甲基）-NH2
[0060] · Suc-ENYLRLIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGK (棕榈酰）-NH2
[0061] 此外，根据本发明的肽（优选在一种药物组合物中）用于或可以用于抑制HIV与 宿主细胞的融合或HIV进入宿主细胞中。
[0062] 那些药物组合物包括一种或多种发明的肽连同一种药学上可接受的载体。
[0063]定义：
[0064] 用于本说明书和权利要求书的目的并且就根据本发明的肽而论，术语"氨基酸"意 在指代一个具有至少一个游离氨基基团以及至少一个游离羧基基团并且除了氨基或羧基 基团以外可以进一步包括一个或多个游离化学反应性基团（例如，羟基、巯基等）的分子。 该氨基酸可以是一种天然存在的L-氨基酸（在本说明书中顺序地描绘为大写字母）或其 对应的D-对映异构体（在本说明书中顺序地描绘为小写字母），一种（合成的）非天然存 在的氨基酸（例如顺序地用3字母代码表示，如Tba等），一种修饰的氨基酸，一种氨基酸衍 生物，一种氨基酸前体，和/或一种保守取代。本领域的普通技术人员将了解，掺入一种肽 中的氨基酸的选择将部分取决于抗病毒肽所需的具体的物理、化学或生物特征。此类特征 部分由螺旋度和抗病毒活性的确定而确定。例如，本领域的普通技术人员将了解，一种合成 肽中的氨基酸可以由一个或多个天然存在的（L-)氨基酸及其对应的D-对映异构体、或非 天然存在的氨基酸（像Tba等）组成。
[0065] 在本说明书中使用"保守取代"来意指在合成肽的序列中的一个或多个氨基酸取 代使得该合成肽仍展示出出人意料的、改进的生物活性。这包括与被置换的氨基酸基本上 具有相同的电荷、大小、亲水性、和/或芳香性的氨基酸的取代。
[0066] "CLIPS"肽是一种根据本发明的肽，这种肽在N端部分包括一个肽结构，这种肽结 构形成自在所述N端部分第一个氨基酸与第五个氨基酸经由价、82、83、821或822部分之 一的连接（其中需要一个游离的硫醇官能团）。用于获得此类CLIPS肽的一种方法描述于 W02004/077062 中。
[0067] 术语"HIV"是指人类免疫缺陷病毒，并且更优选是HIV-1。
[0068] 一种"药学上可接受的载体"意指一种不显著地改变该载体添加至其中的根据本 发明的肽的生物活性的载体介质。此类载体是例如（缓冲的）水、等渗的水性缓冲溶液、含 水醇以及类似物。
[0069] 术语"接头"是指一种作为用于可操作地连接两个不同的分子的分子桥的化合物 或部分（例如其中该接头的一部分结合至根据本发明的肽并且其中该接头的另一部分结 合至胆固醇或其衍生物）。
[0070] "EC5(I"（=半最大有效浓度）是一种化合物抑制一种生物学功能的有效性的量度。 这一定量量度指示需要多少具体药物或其他物质（抑制剂）来抑制一半的给定的生物过程 (或过程的成分，即一种酶、细胞、细胞受体或微生物）。根据FDA，EC 5(I表示50%体外抑制 所需的药物的浓度
[0071] 在本说明书中俥用的命名法
[0072] 如在本领域中已知的，对于L-天然氨基酸而言，使用以下缩写：
[0073]
【权利要求】
1. 一种肽，包括至少24个连接至一个N封端基团的连续的氨基酸，其中所述N封端基 团选自琥珀酰基、乙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基或异戊酰基的组并且其中所述24个氨基 酸的第一个氨基酸直接连接至该N封端基团或经由另一个选自E、A或a的组的氨基酸间接 连接至所述N封端基团并且其中 第一个氨基酸是C、Hcy、C(Bzl)或N， 第二个氨基酸是Y， 第三个氨基酸是一种亲脂性氨基酸， 第四个氨基酸表示A或R， 第五个氨基酸是C、Hey或L， 第六个氨基酸是I， 第七个氨基酸是一种酸性氨基酸， 第八个氨基酸表示丙氨酸或一种酸性氨基酸， 第九个氨基酸是L， 第十个氨基酸是一种亲脂性氨基酸， 第i^一个氨基酸是一种碱性氨基酸， 第十二个氨基酸是丙氨酸或一种碱性氨基酸， 第十三个氨基酸是一种亲脂性氨基酸， 第十四个氨基酸是Q或R， 第十五个氨基酸是E， 第十六个氨基酸是Q， 第十七个氨基酸是Q， 第十八个氨基酸是E， 第十九个氨基酸是K， 第二十个氨基酸是N， 第二i^一个氨基酸是E， 第二十二个氨基酸是A， 第二十三个氨基酸是一种亲脂性氨基酸并且 第二十四个氨基酸是L ; 任选地所述第二十四个氨基酸连接至一个选自R、r、L、Tba或K (棕榈酰）的组的氨基 酸。
2. 根据权利要求1所述的肽，其中 第三个氨基酸选自A、L、I、F、V、W、Tba、Nva、Abu或Cha的组， 第四个氨基酸是R或A， 第七个氨基酸选自E或D， 当是一种酸性氨基酸时，第八个氨基酸表示E， 第十个氨基酸选自I或Tba， 当是一种碱性氨基酸时，第i^一个氨基酸是R或K， 当是一种碱性氨基酸时，第十二个氨基酸是R或K， 第十三个氨基酸选自A、Nva或Abu,并且 第二十三个氨基酸是A或L。
3. 根据权利要求1或2所述的肽，其中第一个氨基酸和第五个氨基酸彼此独立地是C 或Hey并且其中所述第一个和所述第五个氨基酸经由Bl、B2、B3、B21或B22连接。
4. 根据以上权利要求中任一项所述的肽，其中当连接至第二十四个氨基酸时，氨基酸 R间接附接至胆固醇或棕榈酰或其衍生物。
5. 根据权利要求4所述的肽，在所述氨基酸R与所述胆固醇或棕榈酰或其衍 生物之间具有一个接头，其中所述接头包括两个或更多个氨基酸，优选其中该接头 是-Gly-Ser-Gly-Cys - ( - GSGC -)或-Gly-Ser-Gly-Lys ( - GSGK -)。
6. 根据以上权利要求中任一项所述的肽，其中氨基酸序列处于二聚体或三聚体构型。
7. 根据权利要求1、2或3所述的肽，具有选自下组的氨基酸序列：戊酰基-E-C-Y-L-A -C-I-E-A-L-I-R-A-A-Q-E-Q-Q-E-K-N-E-A-A-L-R-NH2、戊酰基-E-C-Y-L-A-C-I-E-E-L-I-R-K-A-Q-E-Q-Q-E-K-N-E-A-A-L-R-NH 2 或 Suc-ECYLRCIEELIRKAQEQQEKNEAALR-NH2，其中在该肽 中的半胱氨酸（C)部分经由B1连接。
8. 根据权利要求1或2所述的肽，具有以下氨基酸序列：异戊酰基-E-C(Bzl)-Y-L-A- l-i-e-e-l-i-r-k-a-q-e-q-q-e-k-n-e-a-a-l-r-nh2。
9. 根据权利要求1-5中任一项所述的肽，具有选自以下的氨基酸序列：Suc-ECYLRCIE ELIRKAQEQQEKNEAALRGSGC(胆甾醇基氧羰基甲基）-NH 2 和 Ac-ACYAACIEALIRAAQEQQEKNEAAL RGSGC(胆留醇基氧羰基甲基）-NH2，其中在该肽中的位置1和位置5处的半胱氨酸（C)部分 经由B1连接。
10. 根据权利要求1-5中任一项所述的肽，具有选自以下的氨基酸序列 Suc-E-C-Y-L-R-C-I-E-E-L-I-R-K-A-Q-E-Q-Q-E-K-N-E-A-A-L-R-GSGK(棕榈酰 基）-NH2，其中在该肽中的位置1和位置5处的半胱氨酸（C)部分经由B1连接； Suc-E-N-Y-L-R-L-1-E-E-L-I-R-K-A-Q-E-Q-Q-E-K-N-E-A-A-L-R-GSGC (胆留醇基氧羰 基甲基）-NH2以及 Suc-E-N-Y-L-R-L-1-E-E-L-I-R-K-A-Q-E-Q-Q-E-K-N-E-A-A-L-R-GSGK (棕榈酰）-NH2。
11. 如权利要求1-10中任一项所述的肽用于抑制HIV与一种宿主细胞融合或抑制HIV 进入该宿主细胞中的用途。
12. 如权利要求1-10中任一项所述的肽用于生产一种用以预防或用以治疗HIV与一 种宿主细胞融合或HIV进入该宿主细胞中或人类的HIV感染的药物的用途。
13. 药物组合物，包括具有根据权利要求1-10中任一项所述的氨基酸序列的肽连同 一种药学上可接受的载体。
【文档编号】C07K14/005GK104159914SQ201280062599
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2011年12月19日
【发明者】B.A.马科姆, J.W.J.图林格, C.F.R.N.布克, W.B.G.舍彭斯, M.A.J.克立伊克, W.M.M.沙亚佩, J.W.斯鲁特斯拉, P.蒂梅曼 申请人:爱尔兰詹森研发公司, 佩普斯甘系统有限公司