具有改善的细胞表面表达的gpcr的制作方法

具有改善的细胞表面表达的gpcr的制作方法
【专利摘要】本发明出人意料地显示，在GPCR的氨基末端加入源自异源病毒-GPCR(G蛋白偶联受体)的序列改善真核细胞中此种受体的细胞表面表达。在其表面表达上述异源病毒GPCR的转染的细胞用于基于细胞的测定以鉴定增加或调节GPCR或GPCR配体的活性的测试化合物，例如用于药物发现，食品工业中新的味道的开发或基于气味GPCR的传感器的开发。此外，源自转染的细胞的膜提取物可以被用于例如药物发现中的化合物测定或用于开发包含此种膜提取物的传感器以鉴定和/或定量挥发性有机化合物。
【专利说明】具有改善的细胞表面表达的GPCR 发明领域
[0001] 本发明可以包括在生物技术和制药领域。本发明显示在GPCR的氨基末端添加源 自病毒_GPCR(G蛋白偶联受体）的序列改善真核细胞中此种受体的细胞表面表达。通过此 种源自异源病毒-GPCR序列对细胞表面表达的此种改善可以在原代或建立的细胞系（例如 哺乳动物的造血或非造血细胞系）和在稳定转染或瞬时转染的细胞中完成。可以将此种异 源序列与信号肽和/或肽标签联合用于表面检测和/或分离GPCR阳性细胞。此外，用于表 达至少包含源自异源病毒-GPCR的序列的GPCR的有用的启动子可以选自非沉默组成型启 动子或诱导型启动子。
[0002] 在其表面表达上述异源病毒-GPCR的转染的细胞用于基于细胞的测定以鉴定增 加或调节GPCR或GPCR配体的活性的测试/候选化合物，例如用于药物发现，食品工业中新 的味道的开发或基于气味GPCR的传感器的开发。此外，源自转染的细胞的膜提取物可以用 于例如药物发现中的化合物测定或用于开发包含此种膜提取物的传感器以鉴定和/或定 量挥发性有机化合物。 现有技术
[0003] 对于配体的细胞表面受体是分子实体，通过该分子实体，细胞感受其周围环境。配 体-受体相互作用之后，细胞引导响应于此相互作用的细胞进程。GPCR，也被称为七跨膜受 体，包含已经鉴定的细胞表面受体的最大家族。超过60%的当前的处方药靶向GPCR，并因 此，GPCR是用于药物发现研究的最重要的靶点之一。至今，约400种基因已被鉴定为GPCR。 并且，GPCR也是用于感受气味和味道的受体。
[0004] GPCR通过类似的分子机制运转。通过胞外刺激激活GPCR引起受体中的构象改变， 其导致中间偶合（intermediate coupling)和GTP-结合蛋白（G蛋白）的激活。性质上G 蛋白是异源三聚的并且由不同基因编码的α，β，和Y亚基组成。所述α亚基负责⑶P和 GTP的结合。配体对GPCR的结合导致α亚基从⑶Ρ-结合形式到GTP-结合形式的转变并 导致通过α-GTP从β γ二聚体解离激活异源三聚体。α-GTP和β γ二聚体二者都调节 多种通过产生第二信使分子（例如，钙，cAMP，等）向细胞内传递信号的效应物的活性。存 在至少17种Ga基因，并且可以将G蛋白的成员分为四种主要类型，所述四种主要类型被称 为G a i/Q，G a q，G α 15和G α 12。基于结合GPCR的配体可以与多种G蛋白偶联，因此导致激 活很多复杂的信号传导通路，其能够使对于GPCR的高通量筛选（HTS)读出复杂化。
[0005] 配体对特定GPCR的结合起始信号，所述信号可以通过测量信号传导通路的一些 元件（主要是第二信使，如细胞内钙，环AMP和磷酸肌醇代谢产物）的性质的一些改变被检 测。对简单性和对无已知配体的受体的脱孤（deorphanization)二者而言，对大多数GPCR 通用的读出对药物发现是有用的。在现有技术中已知某些内源的混杂的G-蛋白可以与很 多 GPCR 偶联[Wilkie TM，Scherle PA，Strathman MP，Slepak VZ 和 Simon Ml.Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 :10049-10053(1991)]和[Amatruda TT.，Steele DA.，SI印ak VZ.和 Simon MI. Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 :5587-5591 (1991)]，但此种内源的混杂的 G-蛋白仅在某 些造血细胞（如人中的髓单核细胞和T细胞和小鼠和大鼠中的髓单核细胞，B细胞和某些T 细胞）中天然表达。但大多数GPCR的表达在大多数造血细胞中难以获得。
[0006] 备选方案是将GPCR和混杂的G-蛋白偶联受体二者共转染入非造血细胞，但还有 为了改善的灵敏度在此种细胞系中以高水平表达GPCR的需求。另外，一些研究者想使用原 代细胞用于筛选，但那些细胞通常表达低水平的GPCR并且因此，灵敏度低。备选方案可以 是将靶GPCR转染入此种原代细胞以改善灵敏度，同时保持细胞背景尽可能接近目标疾病 的细胞背景。但是原代细胞难以转染，它们不能长时间在体外培养并且因此它们不能被稳 定转染。因此，对于非造血细胞和原代细胞二者，都需要对于GPCR表达改善的方法。
[0007] -种筛选GPCR药物靶点的常见技术是以高通量的方式测量当配体结合于GPCR时 细胞内钙的变化。然而，不是所有GPCR偶联于G a q导致钙动员。
[0008] 现有技术已知，造血细胞以高水平表达内源的混杂的G-蛋白（比如6〇15和/或 Ga16) [Wilkie TM, Scherle PA, Strathman MP, Slepak VZ 和 Simon Ml.Proc. Natl. Acad. Sci.USA88 :10049-10053(1991)]和[Amatruda TT·， Steele DA. ， Slepak VZ.和 Simon MI. Proc. Natl. Acad. Sci.USA88 :5587-5591(1991)];其全部教导通过引用并入本文。不幸 的是，很多GPCR难以在细胞表面，尤其在造血细胞表面以高水平表达。
[0009] -种用于将非-G α ,偶联的受体偶联于钙通路的备选方法是将混杂的G蛋白（例 如Ga15)或GaqR合体之一共转染以将GPCR激活与钙动员联系起来。在该方法中，还有 在细胞表面上以用于筛选的足够水平表达GPCR的需求。
[0010] 另外，有时需要使用原代细胞系用于筛选药物，尤其使用尽可能接近于开发药物 所针对的目标疾病的细胞类型的细胞系。对于原代细胞，细胞表面上内源GPCR的水平低， 并且因此用原代细胞仅鉴定高亲和力的结合剂。但是原代细胞系难以被转染并且它们不能 长时间培养并且因此稳定的转染通常是不可能的。
[0011] GPCR也是介导气味识别的嗅球中表达的受体。人在其嗅球上表达约400种功能性 GPCR并且啮齿动物表达约1000种功能性GPCR。但是异源细胞表面上GPCR的表达非常低。 用以改善在异源细胞表面上嗅觉的GPCR的细胞表面表达的策略中的一种是单独或与源自 视紫红质受体的N-末端序列一起使用分子伴侣如RTP1S和REEP。需要改善细胞表面表达 的新序列。
[0012] 现有技术中公知，糖基化是七跨膜G-蛋白偶联受体（GPCR)的常见翻译后修饰。现 有技术中已知糖基化的两种常见形式：N-连接的糖基化和0-连接的糖基化。N-连接的糖 基化是天冬氨酸或精氨酸侧链的寡糖修饰的过程并且对于一些真核蛋白的折叠重要。N-连 接的糖基化通常发生在真核生物内质网腔中。〇-连接的糖基化涉及通过N-乙酰半乳糖胺 连接于丝氨酸或苏氨酸的羟基侧链的多糖。〇-连接的糖基化发生在高尔基体中。
[0013] 尽管已经显示糖基化对于蛋白折叠，受体向细胞表面的运输和靶向是重要的，对 GPCR表面表达相关的糖基化的实例限于N-连接的糖基化。实际上，关于GPCR中的0-连 接的糖基化，没有现有技术。因此，目前，不知道〇-连接的糖基化是否改善GPCR的表面表 达或在GPCR的氨基末端添加异源序列是否产生0-连接的糖基化和此种潜在的糖基化对于 GPCR的表面表达的效果。
[0014] 已经在具有蛋白0-糖基化的可逆缺陷的突变的中国仓鼠卵巢（CH0)细胞系 中研究白细胞介素-2(IL-2)受体的合成和细胞内分选（Kozarsky，KF等人，Mol.Cell. Biol. 1988,8(8)，3357)。错误分选碳水化合物缺陷的IL-2受体并导致几乎没有表面表 达。现有技术中已知一些其它受体连接于〇-糖基化用于其改善的表面表达或其对蛋白水 解的增加的稳定性。此种受体的实例是低密度脂蛋白受体，促衰变因子，和EB病毒的主 要抗原包膜蛋白。但是对于其它分泌的蛋白和受体，比如人绒毛膜促性腺激素（Matzuk等 人.1987);脱辅基蛋白质E(Zanni等人（1989) ;HIV的gpl20/41包膜蛋白，在其表达水平 或稳定性方面，〇-连接的糖基化没有效果。但是再次，上述实例未教导我们在GPCR中是否 存在0-连接的糖基化和此种潜在的0-糖基化对GPCR的表面表达水平的影响。此外，上述 使用与GPCR不相关的天然受体的实例未证明或预见将此种序列添加于异源GPCR改善其表 面表达。
[0015] 本发明中描述了，当将某些源自病毒的GPCR序列添加于异源GPCR的氨基末端时， 改善其表面表达。还证明了，存在于此种源自病毒的GPCR序列的上的丝氨酸和苏氨酸的突 变降低部分但不是全部通过包括此种病毒序列达到的细胞表面表达的改善。此外，我们证 明GPCR表面表达的此种改善在造血和非-造血来源的细胞二者中完成。表达该修饰的受 体的此种细胞可以用于基于细胞的测定，例如用于药物发现，或者源自此种细胞的膜应该 用于其中需要GPCR的测定。
[0016] 发明描述
[0017] 如上文引用的，本发明出人意料地显示，将源自病毒-GPCR的序列添加在GPCR的 氨基末端改善此种受体的细胞表面表达。源自病毒-GPCR的序列导致的细胞表面表达的该 改善可以在真核细胞，例如，哺乳动物原代或建立的细胞系（比如造血或非造血细胞系）中 达到。
[0018] 在本发明的一个特定实施方案中，所述源自病毒-GPCR的序列是SEQ ID N0 :1。在 一个优选的实施方案中，所述源自病毒-GPCR的序列是SEQ ID N0 :1的更短的形式，设计为 SEQ ID N0 :2。在另一个实施方案中，上述序列可以出现一次或以两条或更多条序列串联的 方式出现。在一个优选的实施方案中，SEQ ID N0:1编码SEQ ID N0:8并且SEQ ID N0:2 编码 SEQ ID NO :9。
[0019] 将添加在GPCR的氨基末端的病毒序列制作为DNA嵌合分子，其中将病毒序列添加 在例如编码肽标签的序列和编码成熟GPCR的第二氨基酸之间。添加在GPCR的氨基末端的 此种病毒序列优选分离自来自EB病毒的BILF1开放阅读框。此种序列当添加于异源GPCR 的氨基末端时，通过改善阳性细胞的百分数或改善各个细胞表面上GPCR分子数量的平均 数或中位数改善其表面表达。然而，本发明的病毒-GPCR序列可以源自其它β-和γ疱疹 病毒，例如源自β疱疹病毒家族的全部成员，例如，巨细胞病毒（CMV)，编码GPCR同系物和 Y 2-疱疹病毒，例如，卡波西氏肉瘤-相关疱疹病毒（KSHV)和Yl-疱疹病毒，例如，EB病 毒也编码GPCR同系物。在本发明的某些实施方案中，用于改善GPCR的表面表达的源自病 毒-GPCR 的序列选自一组病毒 GPCR 包括 UL33, M33, R33, UL78, M78, R78, US27,和 US28 的 最前30个氨基酸。
[0020] 在另一个优选的实施方案中，包含本发明的源自病毒GPCR的序列的载体还包含 用以进一步改善表面表达（过量表达）的信号肽或例如通过流式细胞术或通过磁珠用于表 面检测和/或分离GPCR阳性细胞的序列标签。
[0021] 在本发明的另一个实施方案中，所述源自病毒-GPCR的序列稳定转染于细胞系 中。在优选的实施方案中，本发明的源自病毒-GPCR的序列瞬时转染于真核细胞系或真核 原代细胞中。在本发明的一个进一步实施方案中，为了 GPCR阳性细胞的物理分离，将瞬时 或稳定转染有GPCR的细胞系或原代细胞进行分选。在一个实施方案中，转染有至少包含源 自异源病毒-GPCR的序列的GPCR的细胞是真核细胞。在一个特定的实施方案中，转染有至 少包含源自异源病毒-GPCR的序列的GPCR的细胞是哺乳动物造血细胞或哺乳动物非造血 细胞。
[0022] 在本发明的一个实施方案中，至少包含源自异源病毒-GPCR的序列的GPCR在组成 型启动子的控制下表达。在一个进一步的实施方案中，所述启动子选自对于要转染的特定 细胞系非沉默的启动子。在更进一步的实施方案中，所述非沉默启动子选自遍在蛋白启动 子或病毒启动子。在一个实施方案中，对于构成型GPCR表达合适的启动子可以选自包含以 下各项的组：人或小鼠延伸因子l-α启动子（SEQ ID N0 :3)，来自人，小鼠和大鼠种的磷酸 甘油酸激酶启动子（SEQ ID N0:4)，劳斯肉瘤病毒（RSV)启动子（SEQ ID N0:5)，来自莫洛 尼鼠白血病病毒启动子的5' LTRMoMLV-5^ LTR(SEQIDN0:6)和来自人，小鼠和大鼠种 的遍在蛋白启动子。当将造血细胞用于本发明的方法时，此种启动子不随时间沉默，并且当 非造血细胞用于本发明的方法时，此种启动子也是合适的。在本发明的另一个实施方案中， 对于GPCR的表面表达合适的启动子是诱导型启动子。
[0023] 在本发明的一个实施方案中，至少包含源自异源病毒-GPCR的序列的GPCR在诱导 型启动子的控制下表达。在一个特定的实施方案中，合适的诱导型启动子选自包含以下各 项的组：四环素诱导型启动子，蜕皮激素诱导型启动子，cumate诱导型启动子和孕酮诱导 型启动子。
[0024] 如上文描述的，将编码一个或多个在氨基末端区域至少具有源自异源病毒-GPCR 的序列的GPCR的外源核酸序列引入真核细胞。如在本文使用的，外源核酸序列指不天然存 在于细胞中和/或尚未引入细胞（例如，宿主细胞，祖（祖先）细胞）的核酸序列。可以编 码在氨基末端区域至少具有源自异源病毒-GPCR的序列（比如SEQ ID N0 :1或SEQ ID N0: 2)的GPCR和外源表达的任何核酸序列（例如，DNA，RNA)可以用于本发明。
[0025] 外源核酸序列的引入是本领域公知的，并可以例如，通过转染进行。在一个实施方 案中，将编码在氨基末端区域至少具有源自异源病毒-GPCR的序列的GPCR的外源核酸序列 以质粒或载体引入细胞。在本发明的一个实施方案中，转染可以是瞬时或稳定转染。
[0026] 在一个实施方案中，本发明涉及包含编码在氨基末端区域至少具有源自异源病 毒-GPCR的序列（比如SEQ ID N0 :1或SEQ ID NO :2)的GPCR的核酸序列的质粒或载体， 其中所述GPCR以高水平表达。在另一个实施方案中，所述质粒包含编码在氨基末端区域至 少具有源自异源病毒-GPCR的序列（比如SEQ ID N0 :1或SEQ ID NO :2)的G-蛋白偶联受 体（GPCR)的核酸序列，其中编码所述GPCR的核酸序列进一步包含可操作连接于GPCR的启 动子。
[0027] 在一个特定的实施方案中，用于构成型GPCR表达的载体是 P-MoMLV-5' LTR-SP-cmyc-标签-VGS-MCS-多聚腺苷酸（SEQ ID N0:7)，其包含在造血细胞 或非造血细胞中非沉默的强组成型启动子，有助于跨膜移位的信号肽，用于筛选在表面具 有GPCR的细胞的标签，用以改善膜表达的源自异源病毒-GPCR的序列和用以稳定信使RNA 的多腺苷酸化序列。如果序列SEQ ID N0:7的载体中P-M〇MLV5' LTR启动子的序列被四 环素诱导型启动子替代，那么获得适于诱导型GPCR表达的载体。本发明首次证明，在GPCR 的N-末端添加 SEQIDN0:1或SEQIDN0:2(源自异源病毒-GPCR的序列）改善真核细胞 中细胞表面受体表达并且该改善不限于如由我们在之前发现的哺乳动物造血细胞。
[0028] 本发明的具有GPCR改善的表面表达的细胞通常用于测试至少两种分子（至少一 种用作配体或激动剂和至少GPCR)之间的相互作用。例如，在药物发现中，针对靶测试数千 的或甚至数百万的小分子以发现修饰此种靶的活性的小分子。在一个特定的实例中，筛选 为G-蛋白偶联受体（高度可成药（druggable)类型的受体）的激动剂或拮抗剂的化合物。 可以使用基于细胞的测定或具有改善的表面GPCR表达的细胞的膜富集的级分测试此种相 互作用。基于细胞的测定的实例是：无标签测定，测量例如胞内钙，环AMP和磷酸肌醇代谢 产物的水平的依赖第二信使的测定。使用GPCR阳性细胞的膜级分的实例是基于亲和力的 筛选技术（比如放射性配体结合测定和包被有来自在其表面上表达GPCR的细胞的膜级分 的表面等离子共振传感器。此外，基于具有源自病毒GPCR的序列的GPCR的传感器可以用 于诊断，尤其是对于挥发性有机化合物检测的传感器。具有源自病毒GPCR的序列的质粒可 以用于开发作为将用于基于细胞的测定或用于产生GPCR中富集的膜级分的瞬时或稳定细 胞群的，具有改善的GPCR表达的细胞系。
[0029] 因此，本发明还包含用于测试化合物是否与GPCR相互作用和/或用以定量GPCR 和化合物之间的相互作用的方法和试剂盒。此种试剂盒包含至少：细胞系或包含在合适的 启动子的控制下在氨基末端至少具有源自异源病毒-GPCR的序列的G-蛋白偶联受体的细 胞系的膜富集的级分。此种细胞系还可以表达内源的或转染的混杂的G-蛋白。对于基于 细胞的测定，上述试剂盒还包含用于确定GPCR活性的底物（例如用于测量细胞内钙升高的 荧光底物或水母发光蛋白的底物或用于测量细胞调节的胞吐作用的底物）。
[0030] 本发明中达到的细胞表面表达的改善提供制备GPCR富集的膜例如用于放射性配 体结合测定或用于以活细胞进行的功能性测定（比如无标记测定，第二信使测定（如在具 有专职调节的胞吐作用的造血细胞中细胞内I丐动员，cAMP增加，磷酸肌醇产生或颗粒储存 的酶的释放））的可能性。
[0031] 仅为本发明的目的定义以下术语：
[0032] 表面受体：其指存在于细胞表面，与胞外环境相互作用和以最终调节特定启动子 的转录，导致特定基因的转录的方式细胞内传递或转导关于环境的信息的分子。表面受体 的实例是酪氨酸激酶受体，离子通道受体，细胞因子受体，G-蛋白偶联受体（GPCR)比如化 学引诱物肽受体，神经肽受体，光受体，神经递质受体，多肽激素受体或有气味物质受体。
[0033] G蛋白偶联受体（GPCR)，也被称为七跨膜受体，7TM受体，七螺旋受体，和G蛋白连 接的受体（GPLR):它们是跨膜受体的大蛋白家族，以具有胞外N末端的七跨膜结构域和胞 质C末端为特征。结合GPCR的配体促进构象改变，导致小G-蛋白偶联（信号转导通路的 起始），并最终导致细胞的应答。结合和激活这些受体的配体包括光敏化合物，气味，信息 素，激素，和神经递质，并且尺寸从小分子到肽到大蛋白不同。仅在更高等的真核生物，包括 酵母，植物和尤其是动物中发现G蛋白偶联受体。G蛋白偶联受体参与很多疾病，但是也是 全部现代医学药物约一半的靶。GPCR通过类似的分子机制运行。通过胞外刺激的GPCR激 活引起受体中构象变化，其导致中间偶联和GTP-结合蛋白（G蛋白）的激活。G蛋白天然 是异源三聚体，并由不同基因编码的α，β，和Y亚基构成。α亚基负责⑶P和GTP的结 合。配体对GPCR的结合导致α亚基从⑶P-结合形式到GTP-结合形式的转变并导致通过 α-GTP从β γ二聚体解离激活异源三聚体。α-GTP和β γ二聚体二者都调节多种通过 产生第二信使分子（例如，钙，cAMP，等）向细胞内传递信号的效应物的活性。存在至少17 种Ga基因，并且可以将G蛋白的成员分为四种主要类型，所述四种主要类型被称为G a i/；， G a q，G a 15和G a 12。基于结合GPCR的配体可以与多种G蛋白偶联，因此导致激活很多复杂 的信号传导通路，其能够使对于GPCR的高通量筛选（HTS)的读出复杂化。
[0034] "源自异源病毒-GPCR的序列"或"源自病毒-GPCR的序列"：为了本发明的目的， 其指源自非真核生物，主要是病毒的任何序列，所述序列优选借助于表达载体被转染入真 核细胞，用作受体，以获得其在真核细胞内的表达（即异源表达）。通过实施例的方式，本发 明包含源自病毒的异源序列（SEQ ID N0 :1和2)，其被转移到真核细胞中以改善蛋白G受 体的表达。如在本文使用的，该术语描述从作为病毒GPCR的编码序列的第一个密码子的甲 硫氨酸到在前述病毒GPCR的跨膜1区之前的所述病毒GPCR序列胞外氨基末端的最后一个 氨基酸的序列。如在本发明的方法中使用的，该术语还优选例如，分离自哺乳动物的β和 Υ疱疹病毒GPCR的病毒序列或序列片段的意义。
[0035] 造血细胞：它们是源自骨髓干细胞的细胞并且包括所有血液细胞类型（包括骨髓 系（单核细胞和巨噬细胞，嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，红细胞，巨核细胞 /血小板和一些树突状细胞）和淋巴系（T-细胞，B-细胞，NK-细胞，一些树突状细胞）二 者）。反之，不源自骨髓的细胞被认为是非造血细胞。
[0036] 传感器（sensor):它是一种类型的传感器（transducer)。转导生物信号的传感器 被称为生物传感器。所有存活的生物体包含生物传感器，其具有类似于机械传感器的功能。 这些中的大多数是专用的细胞，所述细胞敏感于：光，运动，温度，磁场，重力，湿度，震动，压 力，电场，声音，和外界环境的其它物理特性；内部环境的物理特性，比如生物体的伸长，运 动，和附属物的位置（本体感受）；大量的环境分子，包括毒素，营养物和信息素；内部代谢 环境的很多方面，比如葡萄糖水平，氧水平，或重量摩尔渗透压浓度；和不同范围的内部信 号分子，比如激素，神经递质，和细胞因子。通过使用生物敏感的组分模拟生物的传感器的 人工传感器被称为生物传感器。
[0037] 具有调节的胞吐作用的细胞系：它指通常设计为表达通过胞吐作用的调节者（如 细胞表面受体，比如激动剂配体结合后的GPCR)释放于培养基中的颗粒储存的报告子的细 胞系。用于本文时，术语"具有调节的胞吐作用的细胞，""专职的分泌细胞系，"和" 具有专职调节的胞吐作用的细胞系"可以互换使用。所有这些术语还包括其子代。人们理 解由于蓄意的或无意的突变，所有子代可以不相同。
[0038] 药物发现：发现和/或设计药物所通过的过程。如在本文使用的，药物发现包含对 亲和力，副作用，生物利用度的药物鉴定和修饰以及在投放市场之前在新的治疗适应征中 测试药物的效果，也被称为再评价（reprofiling)的过程。
[0039] 基因：如在本文使用的，基因不仅由编码序列组成，而可以包参与控制编码序列 (例如，启动子，增强子）和内含子的转录的相邻DNA区域。
[0040] "稳定引入"或"稳定转化的"或"稳定转导的"或"稳定转染的"或"稳定电穿孔 的":它指具有整合入其基因组的所需的外源DNA的部分细胞。根据使用的表达载体和转染 技术，仅部分细胞可以将外源DNA整合入其基因组。为了鉴定和选择这些部分，编码选择标 记（例如，对抗生素的抗性）的基因通常与目的基因一起引入宿主细胞。优选的选择标记 包括给予对药物，比如G418,潮霉素和嘌呤霉素抗性的那些。可以将编码选择标记的核酸在 与编码可检测的翻译产物的载体相同的载体上引入宿主细胞或可以在分开的载体上引入。 可以通过药物筛选鉴定稳定转染有引入的核酸的细胞（例如，具有整合的选择标记基因的 细胞将存活，而其它细胞死亡）。
[0041] 嵌合受体：它们是基于将一种受体的部分与另一种受体，蛋白片段，标签序列或其 任何组合（包括整个结构域或其部分）的部分组合的人工受体的受体。通常，嵌合蛋白或 "融合蛋白"是包含融合于至少另一种肽序列或另一种多肽的所需蛋白产物的至少一部分 的多肽。
[0042] 载体或质粒载体或质粒：术语"载体"指可以将核酸序列插入其中用于引入细胞 (其在所述细胞中可以复制）的载体核酸分子。核酸序列可以是"外源的，"其意为它对 于载体被引入的细胞是外源的或所述序列对于细胞中的序列是同源的，但在宿主细胞核酸 内通常未发现该序列的位置。载体包括质粒，粘粒，病毒（噬菌体，动物病毒和植物病毒）， 和人工染色体（例如，YACs)。
[0043] 表达载体：术语"表达载体"指包含编码能够被转录的RNA的核酸的任何类型的 基因构建体。在一些情况下，RNA分子随后被翻译为蛋白，多肽，或肽。在其它情况下，这些 序列不翻译，例如，在反义分子或核酶的产生中。表达载体可以包含多种"控制序列，"其 指对于在特定宿主细胞中可操作连接的编码序列的转录和可能对于翻译需要的核酸序列。 除了控制转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体也可以包含用作其它功能的核苷酸序 列并且在下文描述。
[0044] 启动子：其是位于基因上游的DNA调节区域，为调节的基因转录提供控制点。其可 以包含调节蛋白和分子（比如RNA聚合酶和其它转录因子）可以结合的基因元件，以起始 核酸序列的特定转录。措辞"可操作定位，""可操作连接，""在控制下，"和"在转 录控制下"意为，启动子在与核酸序列相关的正确的功能性位置和/或方位以控制那个序 列转录起始和/或表达。
[0045] 信号肽或信号序列：信号肽是引导蛋白的翻译后运输的短的（3-60个氨基酸长） 肽链。信号肽还可以被称为靶向信号，信号序列，运输肽，或定位信号。信号肽的氨基酸序 列引导蛋白（其在细胞溶质中合成）至某些细胞器比如核，线粒体基质，内质网，叶绿体，质 外体和过氧化物酶体。在蛋白转运后，一些信号肽被信号肽酶从蛋白上切除。
[0046] 序列标签：它是cDNA序列的短的子-序列，其可以用于鉴定基因转录本，并且通 常参与当针对蛋白的特异抗体不可用时的例如用抗体的基因发现和基因序列确定或用于 蛋白纯化。可以用于细胞表面检测和分离的已知的肽标签的实例是c-myc标签，HA标签和 FLAGTM标签。通常，假如将此种特定结合蛋白用荧光团直接或间接标记，或例如利用用于表 面分离的珠子，可用的特定结合蛋白的任何肽标签可以用于表面检测和或分离。
[0047] 可选择标志物或可选择标志物序列或可选择标志物基因：它是引入细胞的给予适 于人工选择的特征的基因。它们是一类用于实验室微生物学，分子生物学，遗传工程以指示 转染或其它意在将外源DNA引入细胞的过程成功的报告基因。可选择标志物经常是抗生素 抗性基因；已进行引入外源DNA的过程的细菌在包含抗生素的培养基上生长，并且那些可 以生长的细菌克隆成功接受和表达引入的遗传物质。
[0048] 转化或转染：如在本文使用的，指将外源DNA引入细胞（例如原核或真核细胞）。 转化可以通过本领域已知的多种方式完成，包括磷酸钙-DNA共沉淀，DEAE-葡聚糖-介导的 转染，1，5_二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物-介导的转染，电穿孔，显微注射，脂质 体融合，脂转染，原生质体融合，逆转录病毒感染，和基因枪粒子轰击（biolistics)。尤其， 当在细胞培养基中不包括合适的抗生素用于选择带有DNA稳定整合入染色体的细胞，转染 入真核细胞可以是瞬时的。用于稳定选择的质粒载体必须具有表达于将用抗生素选择的细 胞中的可选择标志物。尽管瞬时转染可以用于本发明的方法，优选的细胞是通过抗生素选 择制备的那些。
[0049] 细胞表面中受体GPCR的改善的表达：在本说明书的范围内该术语意为所述受体 的表达定性地（每个细胞的更多表达）或定量地增加（更多表达的细胞）。该概念因此还 意为或包含在其表面不表达GPCR的细胞开始表达它的实验事实。以此类推，当涉及每个细 胞定性地表达时，关于本描述的术语"过量表达"意为与术语改善的表达相同作用。
[0050] 包含：本专利说明书自始至终的该术语，当尤其涉及生物序列（氨基酸或核苷酸 序列）时，包括，具体地术语"由...组成（consisting) "。它意为序列可以包含本发明（被 看作生物活性或技术效果）主要存在于（reside on)的片段，所述片段任选地连接于其它 序列片段或序列部分；或仅仅精确地限于如此的片段。
[0051] 因此本发明的第一个实施方案涉及编码源自异源-病毒GPCR的序列的核酸序列 用于改善真核细胞表面真核受体GPCR的体外表达的应用。在一个优选的实施方案中，所述 真核受体GPCR在真核细胞中是体外过量表达的。在一个更优选的实施方案中，编码源自异 源-病毒GPCR的序列的核酸序列特征在于包含由SEQ ID N0 :1或SEQ ID N0 :2或编码包 含SEQ ID N0 :8或SEQ ID N0 :9的氨基酸序列的DNA序列表示的DNA序列。
[0052] 本发明的第二个实施方案涉及编码源自异源-病毒受体GPCR的序列的分离的核 酸序列，其特征在于包含由SEQ ID N0 :1或SEQ ID N0 :2或由包含编码包含SEQ ID N0 :8 或SEQ ID NO :9的氨基酸序列的核酸表示的核酸。
[0053] 本发明的第三个实施方案涉及编码G蛋白偶联受体（GPCR)的核酸序列，所述编码 核酸序列特征在于进一步包含编码源自异源-病毒GPCR的序列的核酸序列的至少部分。在 一个优选的实施方案中，编码源自异源-病毒GPCR的序列的所述序列的部分特征在于包含 SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2或特征在于包含编码包含SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9的 氨基酸序列的片段。在一个更优选的实施方案中，所述核酸序列进一步包含用于改善表面 表达的信号肽和/或用于表面检测和/或分离阳性表达异源-病毒GPCR序列的细胞的序 列标签。在一个更优选的实施方案中，所述序列进一步包含启动子，所述启动子可以是优选 选自：蜕皮激素诱导型启动子，cumate诱导型启动子和孕酮诱导型启动子的诱导型启动子 或优选选自序列：SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6的组成型启动 子。
[0054] 本发明的第五个实施方案涉及表达载体，优选质粒，所述载体包含上文描述的核 酸序列。在一个优选的实施方案中，所述表达载体包含SEQ ID N0 :7。
[0055] 本发明的第六个实施方案涉及转染有以上引用的核酸序列或转染由所述质粒或 表达载体的非人细胞。在一个优选的实施方案中，所述细胞是真核细胞，优选造血细胞。
[0056] 本发明的第七个实施方案涉及使用上文提到的细胞用于筛选候选化合物对真核 受体GPCR的活性或影响。
[0057] 本发明的第八个实施方案涉及GPCR，其特征在于至少包含源自异源-病毒GPCR的 序列。优选的，所述源自异源-病毒GPCR的序列选自包含由SEQ ID N0:8或SEQ ID N0: 9表示的氨基酸序列的那些或选自包含由包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的核酸序列编 码的氨基酸序列的那些。
[0058] 本发明的第九个实施方案涉及包含由上文提到的核酸序列编码的氨基酸序列的 GPCR。
[0059] 本发明的第十个实施方案涉及所述GPCR用于筛选候选化合物对真核受体GPCR的 活性或影响的应用。
[0060] 本发明的第十一个实施方案涉及用所述GPCR富集的细胞膜级分。
[0061] 本发明的第十二个实施方案涉及所述膜级分用于筛选候选化合物对真核受体 GPCR的活性或影响的应用。
[0062] 本发明的第十三个实施方案涉及用于测试候选化合物与包含根据上文描述的细 胞的细胞系，或在GPCR中富集的所述细胞膜级分，或上文提到的GPCR的真核受体GPCR相 互作用的试剂盒和用于确定真核受体GPCR活性的底物。在一个优选的实施方案中，所述底 物是用于测量细胞内钙升高的荧光底物，水母发光蛋白的底物或用于测量细胞调节的胞吐 作用的底物。
[0063] 本发明的第十四个实施方案涉及体外测试候选化合物与真核受体GPCR的相互作 用的方法，所述方法包含将候选化合物连同根据上文提到的细胞的细胞系，或在GPCR中富 集的所述膜级分，或上文提到的GPCR加入培养基和确定真核受体GPCR活性。在一个优选 的实施方案中，通过底物（优选用于测量细胞内钙升高的荧光底物，水母发光蛋白的底物 或用于测量细胞调节的胞吐作用的底物）的方式进行真核受体GPCR活性的确定。
[0064] 附图简述
[0065] 图1.用于表达功能性表面受体，比如GPCR的具有新霉素抗性的质粒载体图，所述 载体使用小鼠免疫球蛋白κ链的信号肽，用于以抗cmyc单克隆抗体表面检测的c-myc标 签和用于在M 〇MLV5' LTR启动子（A)的控制下或在四环素诱导型启动子（B)控制下的过量 表达源自病毒-GPCR的序列。 实施例
[0066] 实施例1.启动子，信号肽和异源病毒-GPCR序列的组合对造血细胞中GPCR的表 面表达的影响。
[0067] 开发载体用于在以下启动子：莫洛尼白血病病毒5' -LTR(MoMLV5' LTR，SEQ ID NO :6)，人磷酸甘油酸激酶启动子（SEQ ID NO :4)和人延伸因子1 α启动子（hEFl α，SEQ ID NO :3)控制下在具有专职调节的胞吐作用造血细胞中GPCR的稳定表达。所有载体具有用于 选择稳定真核细胞的新霉素抗性基因，紧接着c-myc标签（EQKLISEEDLN肽）的小鼠免疫球 蛋白 κ信号肽和在位置1无甲硫氨酸的完整GPCR。使用微穿孔器（microporator) (Digital Bio Technology，South Korea)将各个载体分别电穿孔入RBL-2H3并且48小时后以500ug/ mL将新霉素加入培养物用于选择。选择约2周后，通过流式细胞术（Guava Technologies, USA)用抗-cmyc 标签抗体（抗-cmyc-FITC，克隆 9E10，Sigma-Aldrich，USA)分析细胞的 表面表达。基于表面表达，将GPCR分为三类：以人白细胞介素-8受体为原型测试的，在所 有启动子情况下都为阳性的GPCR ;以人缓激肽类型B1受体为原型测试的，在至少一种启动 子的情况下为阳性的GPCR(仅在莫洛尼白血病病毒5' -LTR启动子情况下为阳性）和以 人HTR1B受体为原型测试的，在所有启动子情况下都为阴性的GPCR。因此，以难以表达在 类造血细胞RBL-2H3中的人HTR1B受体作为受体原型开发新的载体。开发载体用于在以下 启动子：莫洛尼白血病病毒5' -LTR(M〇MLV5' LTR，SEQIDN0:6)，人磷酸甘油酸激酶启动 子（SEQ ID NO :4)和人延伸因子1 α启动子（hEFl a，SEQ ID NO :3)的控制下，在具有专职 调节的胞吐作用的RBL-2H3细胞中人HTR1B的稳定表达。所有载体具有用于选择稳定的真 核细胞的新霉素抗性，紧接于c-myc标签（EQKLISEEDLN肽）的小鼠免疫球蛋白κ信号肽， 源自病毒-GPCR序列（VGS，SEQ ID N0:2)的序列和位置1无甲硫氨酸的整个人HTR1B。包 含此种源自异源病毒-GPCR的序列以检测通过某些源自异源病毒-GPCR的序列是否改善表 面表达。使用微穿孔器（Digital Bio Technology, South Korea)将各个载体分别电转入 RBL-2H3并且48小时后以500ug/mL将新霉素加入培养物用于选择。选择约2周后，通过 流式细胞术（Guava Technologies，USA)用抗-cmyc 标签抗体（抗-cmyc-FITC，克隆 9E10， Sigma-Aldrich，USA)分析细胞的表面表达。结果表达为减去来自以相同的抗-cmyc标签抗 体孵育的未转染的RBL-2H3细胞的值之后的阳性细胞的百分数。指示了本身小于百分之2 的百分数并且认为是阴性的，通过MACS分离此种阳性细胞不成功。对于阳性细胞，将平均 荧光强度（MFI)看作是阳性细胞表面上表面受体密度的标志物。结果显示于下表1中：
[0068] 表 1
[0069]
【权利要求】
1. 编码源自异源-病毒GPCR的序列的核酸序列用于改善真核细胞表面中真核受体 GPCR的体外表达的用途。
2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述真核受体GPCR在真核细胞中体外过量表达。
3. 根据权利要求1或2任一项所述的用途，其中所述编码源自异源-病毒GPCR的序 列的核酸序列特征在于：包含由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2表示的DNA序列或编码包含 SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :9的氨基酸序列的DNA序列。
4. 编码源自异源-病毒受体GPCR的序列的分离的核酸序列，其特征在于包含由SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2表示的核酸，或其特征在于包含编码包含SEQ ID N0:8或SEQ ID NO :9的氨基酸序列的核酸。
5. 编码真核受体GPCR的核酸序列，所述编码核酸序列特征在于：进一步包含编码源自 异源-病毒GPCR的序列的核酸序列的至少部分。
6. 根据权利要求5所述的核酸序列，其中编码源自异源-病毒GPCR的序列的所述序列 的部分特征在于包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2,或特征在于包含编码包含SEQ ID NO : 8或SEQ ID NO :9的氨基酸序列的片段。
7. 根据权利要求5至6任一项所述的核酸序列，所述核酸序列进一步包含用于改善表 面表达的信号肽和/或用于表面检测和/或分离阳性表达异源-病毒GPCR序列的细胞的 序列标签。
8. 根据权利要求5至7任一项所述的核酸序列，所述核酸序列进一步包含启动子。
9. 根据权利要求8所述的核酸序列，所述核酸序列包含诱导型启动子。
10. 根据权利要求9所述的核酸序列，所述核酸序列包含选自：蜕皮激素诱导型启动 子，cumate诱导型启动子和孕酮诱导型启动子的诱导型启动子。
11. 根据权利要求8所述的核酸序列，所述核酸序列包含组成型启动子。
12. 根据权利要求11所述的核酸序列，所述核酸序列包含选自序列：SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 的组成型启动子。
13. 表达载体，优选质粒，其包含权利要求4至12所述的核酸序列。
14. 根据权利要求13所述的表达载体，其特征在于所述表达载体包含SEQ ID NO :7。
15. 非人细胞，所述细胞转染有权利要求4至12所述的核酸序列或转染有权利要求13 或14所述的质粒或表达载体。
16. 根据权利要求15所述的细胞，其特征在于它们是真核细胞。
17. 根据权利要求16所述的细胞，其特征在于它们是造血的。
18. 根据权利要求15至17所述的细胞用于筛选候选化合物对真核受体GPCR的活性或 影响的用途。
19. 真核GPCR，其特征在于所述真核GPCR至少包含源自异源-病毒GPCR的序列。
20. 根据权利要求19所述的真核GPCR，其中所述源自异源-病毒GPCR的序列选自包 含由SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9表示的氨基酸序列的那些或选自包含由包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO :2的核酸序列编码的氨基酸序列的那些。
21. 根据权利要求19所述的真核GPCR，其包含由权利要求4至12的核酸序列编码的 氨基酸序列。
22. 根据权利要求19至21所述的真核GPCR用于筛选候选化合物对真核受体GPCR的 活性或影响的用途。
23. 由根据权利要求19至21所述的GPCR富集的细胞膜级分。
24. 根据权利要求23所述的膜级分用于筛选候选化合物对真核受体GPCR的活性或影 响的用途。
25. 测试候选化合物与真核受体GPCR相互作用的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要 求15至17所述的细胞系，或根据权利要求23所述的GPCR中富集的细胞膜级分，或根据权 利要求19至21所述的GPCR和用于确定真核受体GPCR活性的底物。
26. 根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述底物是用于测量细胞内钙升高的荧光底 物，水母发光蛋白的底物或用于测量细胞调节的胞吐作用的底物。
27. 测试候选化合物与真核受体GPCR的相互作用的体外方法，所述方法包括将候选化 合物连同根据权利要求15至17所述的细胞系，或根据权利要求23所述的GPCR中富集的 膜级分，或根据权利要求19至21所述的GPCR加入培养基和确定真核受体GPCR活性。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述真核受体GPCR活性的确定借助底物进行。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述底物是用于测量细胞内钙升高的荧光底 物，水母发光蛋白的底物或用于测量细胞调节的胞吐作用的底物。
【文档编号】C07K14/72GK104093736SQ201280068542
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年1月31日 优先权日:2012年1月31日
【发明者】埃利耶·帕斯罗哈斯, 费·伊莎贝尔·加西亚马塞拉, 韦罗妮卡·马库拉达·卢纳格雷罗, 马里亚·格拉西亚·蒙特罗佩尼亚尔沃, 塔尼亚·加西亚马塞拉, 何塞·安德列斯·莫拉莱斯马丁内斯, 安娜·贝伦·阿拉贡戈麦斯, 安娜·克萨达莫利纳, 奥罗拉·玛丽亚·马克斯莫拉莱斯 申请人:坎瓦克斯生物技术公司