一种整合膜蛋白的多克隆抗体及其制备方法

专利名称：一种整合膜蛋白的多克隆抗体及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种细菌表层黏附蛋白及其用途。
背景技术：
黏附是细菌与肠上皮细胞(IEC)相互作用的第一步，人肠道内含有500-1000种 不同的微生物，尤其是结肠内细菌的数量达到1012/g粪便，面临着最高的细菌负荷。越来越多证据表明相对粪便内的其它细菌，只有能同肠粘膜紧密连接及黏附的细菌才能影响人类的健康。乳酸杆菌作为一种非侵袭性的细菌，其在肠道内的黏附、定植对抑制致病菌的定植、移位和感染，维护肠道黏膜屏障的完整性具有特别重要的意义。目前认为乳酸杆菌可识别宿主表面特异受体，而宿主表面的蛋白、糖蛋白和糖脂可能就是受体，其黏附过程的第一步是非特异性的，由菌体结构所决定；第二步是在非特异性结合的基础上，菌体特异性配体进一步与宿主细胞相应的受体之间特异性的结合。该配体通常是存在于细菌表面或分泌至细胞外的黏附活性分子，不但可以介导细菌对靶细胞的黏着，激发继发于黏附的细胞内信号传导途径；并且通过竞争抑制等机制阻断具有类似配体结构的病原菌的黏附活性。近来研究较多的黏附分子包括脂磷壁酸(LTA)、细胞外多糖(EPS)、细胞表层蛋白等，其中细胞表层蛋白起着关键性的作用。自从1994年Bernet MF在乳酸杆菌与致病菌之间对肠上皮细胞顶端受体竞争黏附实验中，提出黏附成分可能是细菌表面的不稳定蛋白质，据此研制了含冻干培养上清成分的活菌制剂，临床效果较单纯活菌为优，但黏附分子的本质未阐明(Bernet MF等，Lactobacillus acidophilus LA I binds to Cultured intestinal cell Lines andinhibits cell attachment cell invasion by enterovirulen bacteria. Gut，1994 ;35
(4):483 - 9)。研究发现多种具有黏附特性的乳酸杆菌在通过化学及生物方法祛除或破坏表层蛋白后，其和宿主上皮的黏附能力也降低了。还有研究显示单用L. crispatus的表层蛋白提取物也可以达到抑制肠致病性大肠杆菌对宿主上皮细胞的黏附的效果。由于表层的膜蛋白特有的亲疏水性结构所导致的生化纯化及结构功能分析的困难，使其相比可溶性蛋白，深入研究较少。受此影响，国内外对细菌如乳酸杆菌同肠上皮黏附过程中的起作用的靶蛋白的报道尚少。因此，本领域非常有必要进一步研究细菌的黏附机制，找到与黏附相关的蛋白或黏附机制，用于微生物的改良或良种筛选等。

发明内容
本发明的目的在于提供一种细菌表层黏附(又称为“粘附”)蛋白及其用途。本发明的另一目的在于提供所述细菌表层黏附蛋白的特异性抗体。
在本发明的第一方面，提供一种整合膜蛋白的用途，用于制备促进细胞黏附的试剂。在另一优选例中，所述的整合膜蛋白是
(i)如SEQID NO:1中第455-755位所示氨基酸序列的蛋白；
(ii)如SEQID NO:1所示氨基酸序列的蛋白；
(iii)(i)或(ii)指定的氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个；较佳的1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进细胞黏附功能的由(i)或(ii)衍生的蛋白。在另一优选例中，所述的细胞是细菌细胞。在另一优选例中，所述的细胞是乳酸菌细胞。在另一优选例中，所述的促进细胞黏附是促进细胞在消化道(特别是肠道)上的黏附性能。特别是，所述的促进细胞黏附是促进细胞与消化道上皮细胞的黏附。在本发明的第二方面，提供一种分离的蛋白，所述的蛋白是
(a)如SEQID NO:1中第455-755位所示氨基酸序列的蛋白；
(b)Ca)指定的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳的1-10个；更佳地1_5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进细胞黏附功能的由(a)衍生的蛋白。在本发明的第三方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的蛋白。在另一优选例中，所述的多核苷酸是通过SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示序列的引物从植物乳酸菌CGMCC NO. 1258基因组中扩增获得。在本发明的第四方面，提供一种质粒载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的第五方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。在本发明的第六方面，提供一种所述的蛋白的制备方法，该方法包含
Ca)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出所述的蛋白。在本发明的第七方面，提供一种促进细胞黏附的方法，所述方法包括使所述细胞重组表达整合膜蛋白。
在本发明的第八方面，提供一种抑制细胞(如植物乳酸杆菌细胞)黏附的方法，所述方法包括利用特异性结合整合膜蛋白的抗体处理所述的细胞，从而封闭细胞中的整合月吴蛋白。在本发明的第九方面，提供一种抗体，所述的抗体特异性地结合所述的整合膜蛋白。在另一优选例中所述的整合膜蛋白是
(i)如SEQID NO:1中第455-755位所示氨基酸序列的蛋白；
(ii)如SEQID NO:1所示氨基酸序列的蛋白；
(iii)(i)或(ii)指定的氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个；较佳的1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进细胞黏附功能的由(i)或(ii)衍生的蛋白。在另一优选例中，所述的抗体是如下制备的用所述的整合膜蛋白免疫动物，从动物体内分离多克隆抗体。在另一优选例中，所述的多克隆抗体如下制备用纯化的所述的整合膜蛋白(优选地加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化)免疫兔子(优选通过多点注射)；免疫量600±200μ g每只每次；初次免疫14±3天后，每14±3天用纯化的所述的整合膜蛋白加强免疫I次，免疫量是300±100 μ g每只每次，至少加强免疫2次；从兔血清中分离多克隆抗体。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1.整合膜蛋白序列分析(TMHMM2分析)。其中，红色区域为跨膜区域，紫色区域为膜外区域，蓝色为膜内区域。图2a.表层蛋白的SDS-PAGE电泳，其中，泳道I表示Marker蛋白电泳结果；泳道2表不表层蛋白电泳结果。图2b.表层蛋白的Western印迹(泳道3,4, 5)结果。图3.表层黏附蛋白的表达和鉴定。A. L Plantarum CGMCC Nol258目的基因的PCR扩增产物的电泳鉴定；其中，泳道1-7 分别是 Marker、PO、GBP、CD、IMP2, MP3)、IMPl 基因的电泳结果。B.表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果；其中，泳道1_7分别是Marker、GBP、
PO、CD、IMP2, MP3、IMPl蛋白的电泳结果。C. Western印迹鉴定黏附蛋白(HRP_mucin)的结果；其中，泳道1_7分别是Marker、GBP、PO、CD、IMP2, MP3、IMPl 蛋白的印迹结果。图4. Western鉴定抗MP2抗体的灵敏度。其中，泳道1. Marker，泳道2.1MP2(Ipg),泳道 3.1MP2 (10pg)，泳道 4· IMP2 (IOOpg)0图5.通过Wetern印迹验证IMP2。其中泳道I为Marker,泳道2为全菌体黏附蛋白。图6显示了各试验组的EPEC黏附率。图7显示了各试验组的Lacto黏附率。图8乳酸杆菌黏附蛋白的筛选过程。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现整合膜蛋白STY，特别是整合膜蛋白STY的MP2段是一种有助于细胞黏附的蛋白片段。基于上述发现，可利用该蛋白来改变细胞的黏附性能，如使得有益菌重组表达该黏附蛋白以促进其肠道黏附性能，或利用特异性封闭该黏附蛋白的试剂来抑制表达该种黏附蛋白的有害菌的肠道黏附性能。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”;“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，抗体的“特异性”是指抗体能结合于所述的整合膜蛋白STY蛋白片段；特别指那些能与哺乳动物整合膜蛋白STY或蛋白片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。整合膜蛋白或其生物活性片段
在分析植物乳酸杆菌表层蛋白的过程中，本发明人首次分离出一种整合膜蛋白，并且经鉴定发现该整合膜蛋白是乳酸杆菌细胞发挥黏附作用的重要蛋白，本发明人将之命名 为整合膜蛋白STY。在本发明中，所用的整合膜蛋白STY可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的整合膜蛋白STY也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组整合膜蛋白STY。优选的，本发明可采用重组的整合膜蛋白STY。任何适合的整合膜蛋白STY均可用于本发明。所述的整合膜蛋白STY包括全长的整合膜蛋白STY或其生物活性片段(或称为活性片段)。较佳地，所述的整合膜蛋白STY的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的整合膜蛋白STY的氨基酸序列也包括在本发明中。整合膜蛋白STY或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene,第四版，1987,The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224。任何一种整合膜蛋白STY的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，整合膜蛋白STY的生物活性片段的含义是指作为一种蛋白，其仍然能保持全长的整合膜蛋白STY的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长整合膜蛋白STY的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长整合膜蛋白STY的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或 100% 的活性。作为本发明的优选方式，所述的整合膜蛋白STY的生物活性片段具有SEQ ID NO:1中第455-755位所示氨基酸序列或其的蛋白。经验证，整合膜蛋白STY 10的上述生物活性片段是发挥黏附特性的关键性区域，该片段保留了全长整合膜蛋白STY的全部生物活性，甚至比全长整合膜蛋白STY具有更优异的生物活性。所述的整合膜蛋白STY的上述生物活性片段更易于被细胞重组表达。一旦分离获得了所述蛋白的序列，就可以用重组法来大批量地获得该蛋白。这通常是将其编码基因克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到。此外，对于较短的蛋白而言，也可采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法来合成有关序列，人工合成的方法可简便且快速地得到所需要的蛋白。
本发明还包括了编码所述的整合膜蛋白STY的生物活性片段的分离的核酸，也可以是其互补链。编码整合膜蛋白STY的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码所述的整合膜蛋白STY的生物活性片段的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到所要的蛋白。本发明还包括了包含编码所述整合膜蛋白STY的生物活性片段的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含整合膜蛋白STY编码基因的序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、 体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，含有编码所述整合膜蛋白STY的生物活性片段核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E. coli)，如大肠杆菌HMS174 (DE3)、或BL21 (DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。作为本发明的优选方式，所述的“宿主细胞”是一类有益菌(如益生菌)细胞，包括但不限于乳酸菌细胞。整合膜蛋白STY的用途
基于本发明人的新发现，本发明还提供了整合膜蛋白STY或其生物活性片段的用途，用于制备促进细胞黏附的试剂。作为本发明的优选方式，所述的促进细胞黏附的方法包括使所述细胞重组表达整合膜蛋白STY。在得知了所述的整合膜蛋白STY的氨基酸序列之后，本领域人员可以方便地制备重组表达整合膜蛋白STY的细胞，这通常是将整合膜蛋白STY的编码基因克隆入载体，再转入所述细胞。将外源的整合膜蛋白STY的编码基因导入到所述细胞内的方法是本领域人员熟知的。通常的方法是，获得编码所述的整合膜蛋白STY或其生物活性片段的基因序列，将其连入合适的表达载体，再转入细胞。更具体的步骤是(i)提供一重组表达载体，该重组表达载体含有一基因表达盒，所述表达盒含有外源的整合膜蛋白STY或其生物活性片段的编码基因；(ii)将(i)的重组表达载体转化到细胞内，从而使得所述细胞内含有所述重组表达载体或者其基因组中整合有所述外源的整合膜蛋白STY。通过选择合适的表达载体，或者在表达载体上选择合适的启动子或增强子等以促进整合膜蛋白STY的表达是本领域人员熟知的。由于全长的整合膜蛋白STY氨基酸序列特别长(含有多于1000个氨基酸)，蛋白表达效率通常不如相对氨基酸序列较短的蛋白。因此，优选的是使细胞重组表达整合膜蛋白STY上决定黏附作用的关键区域。作为本发明的优选方式，30使所述细胞重组表达具有整合膜蛋白STY的第455-755位氨基酸序列的蛋白，这将大大提高蛋白的表达效率。当所述的细胞稳定地表达所述的整合膜蛋白STY后，所述的整合膜蛋白STY可起到促进细胞黏附，特别是促进细胞在肠道中黏附的作用。当所述的细胞是一种有益菌的细胞时，该有益菌在肠道中良好的黏附作用将有利于阻止一些肠道有害菌在肠道中的黏附，从而保障了肠道的健康。当需要抑制一些有害菌(表达所述整合膜蛋白STY的有害菌)的细胞黏附作用是，所述方法通常包括利用特异性封闭整合膜蛋白STY的试剂处理所述的细胞，从而封闭细胞中的整合膜蛋白STY。所述的特异性封闭整合膜蛋白STY的试剂优选地例如是特异性结合整合膜蛋白STY的抗体(包括单克隆抗体和多克隆抗体)。结合整合膜蛋白STY的试剂
在得知了所述整合膜蛋白STY及其序列之后，可基于此来筛选或制备特异性封闭该整合膜蛋白STY的试剂，例如特异性结合整合膜蛋白STY的抗体。如利用所述整合膜蛋白STY制备一系列抗体，从这些抗体中找到结合特异性良好的可用于抑制整合膜蛋白STY，从而抑制相关细胞黏附作用的抗体。
在基于一些蛋白制备抗体的过程中，由于全长蛋白一般序列较长，制备特异性抗体的效率并不高，获得的抗体经常存在结合能力差、结合位点不确定等问题。因此需要针对相应蛋白找到其发挥相关作用的关键性位点，从而更有针对性地来制备抗体。因此，作为本发明的优选方式，基于整合膜蛋白STY上决20定黏附作用的关键区域来设计结合整合膜蛋白STY的试剂。例如，以具有所述整合膜蛋白STY上第455-755位氨基酸序列的蛋白片段作为抗原，来制备特异性抗体。所述的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明的多肽可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达本发明的多肽的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256 ;495，1975 ;Kohler等人,Eur. J.Tmmunol · 6 :511,1976 ;Kohler 等人,Eur. J. Tmmunol · 6 :292,1976 ;Hammerling等人，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, Ν· Υ· , 1981 )。多克隆抗体的生产可用本发明的多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。作为本发明的优选方式，本发明提供了一种多克隆抗体，所述的多克隆抗体特异性地结合所述的整合膜蛋白STY。所述的抗体是如下制备的用所述的整合膜蛋白STY免疫动物，从动物体内分离多克隆抗体。更优选地，所述的多克隆抗体如下制备用纯化的所述的整合膜蛋白STY (优选地加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化)免疫兔子(优选通过多点注射);免疫量600±200μ g每只每次；初次免疫14±3天后，每14±3天用纯化的所述的整合膜蛋白STY加强免疫I次，免疫量是300 ± 100 μ g每只每次，至少加强免疫2次；从兔血清中分离多克隆抗体。所述的多克隆抗体特异性良好，对于整合膜蛋白STY具有优异的封闭效果，且对于整合膜蛋白STY以外的其它蛋白不发生交叉结合。筛选调节细胞黏附的潜在物质的方法
在得知了所述的整合膜蛋白STY对于调节细胞黏附的用途后，可以基于该特征来筛选调节整合膜蛋白STY的表达或活性，从而调节细胞黏附作用的物质。因此，本发明提供一种筛选可用于调节细胞黏附作用的潜在物质的方法，所述的方法包括将候选物质与表达整合膜蛋白STY (或其生物活性片段，如具有整合膜蛋白STY第455-755位氨基酸序列的蛋白)的体系接触；和检测候选物质对整合膜蛋白STY的影响；若所述候选物质可提高整合膜蛋白STY的表达或活性，则表明该候选物质是可用于促进细胞黏附的潜在物质；若所述候选物质可降低整合膜蛋白STY的表达或活性，则表明该候选物质是可用于抑制细胞黏附的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到整合膜蛋白STY表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达整合膜蛋白STY的体系。所述的体 系包括(但不限于)溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于调节细胞黏附作用真正有用的物质。另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于调节细胞黏附的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调节细胞黏附真正有用的物质。本发明的主要优点在于
(O首次发现整合膜蛋白STY是一种有助于细胞黏附的蛋白，具有良好的促进细胞黏附的作用。(2)首次鉴定出了所述整合膜蛋白STY上发挥黏附作用的关键区域，即该整合膜蛋白STY氨基酸序列的第455-755位，找到了抑制黏附的靶点，从而有利于设计特异性针对整合膜蛋白STY上该氨基酸区域的阻止黏附作用的试剂。3)利用所述的整合膜蛋白STY，可方便地改变特定细胞的黏附特性，产业应用价值不可估量。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人,分子克隆实验室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。1.材料与方法 材料
植物乳酸杆菌(Lactobacillus pi ant arum CGMCC NO. 1258)获自交大昂立微生物研究所。超速离心机购自Beckman公司。Mucin购自sigma公司。蛋白Marker及生物素标记Marker购自吉泰公司。表达质粒pET16b购自Novagen公司，并且通过常规方法在其多克隆位点添加了 BglII和XhoI酶切位点。限制性内切酶、连接酶、及Taq DNA聚合酶和IPTG均购自MBI公司。质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒AXgen和HRP标记的山羊抗鼠IgG购于北京中杉生物工程公司。植物乳酸杆菌的培养和表层蛋白的提取
将植物乳酸杆菌CGMCC NO. 1258接种于新鲜配置的MRS液体培养基，37°C 200转/hr培养24hr。将菌液3500g、4°C离心20min，去除上清，再用PBS混匀3500g，4°C离心20min，去除上清后加入2M盐酸胍室温200转/hr，3小时。将菌液6000g，4°C离心20min取上清液置半透膜内O. OlM的PBS透析过夜，加入离心管放进4°C超速离心机40000g，离心60min,小心抽去上清。沉淀溶于O.1M的PBS,放于70°C恒温水槽孵育30min, 16 OOOg,4°C离心20min,上清液移出后即可进行后续Western印迹操作。对黏蛋白作辣根过氧化酶(HRP )标记
根据 Rojas.M 的方法(Rojas M 等；Purification and characterization of asurface protein from Lactobacillus fermentum 104R that binds to porcine small10 intestinal mucus and gastric mucin. Appl Environ Microbiol2002 ；68 (5):2330-6)，取黏蛋白溶解于0. lmol/L碳酸盐缓冲液中(PH9. 5)，配置成4mg/ml的黏蛋白溶液。将辣根过氧化物酶(HRP)8mg溶解于2ml蒸馏水中，配置成HRP溶液，然后加入至400 μ I新鲜配置的0. lmol/L过碘酸钠溶液中，混合物室温下搅拌20min，然后置于0. 001mol/L(PH4. 4)乙酸盐缓冲液中，4°C透析过夜。取出透析后的HRP，加入0.1 mol/L碳酸盐缓冲液中(PH9. 5)20 μ I调节PH至9. 0-9. 5，取Iml黏蛋白和Iml HRP溶液混合，置于室温下混合搅拌2h,然后加入新鲜配置的4mg/L硼氢化钠溶液100 μ I以去除连接反应。混合液置于0.1 mol/L (PH7. 4)的硼酸缓冲液中4°C透析过夜，标记好的黏蛋白等体积加入80%甘 油，-20°C保存。表层蛋白的Western印迹分析
表达产物经SDS-PAGE电泳，采用10%分离胶和5%浓缩胶的不连续浓度梯度，恒压60V30min，后改120V 90min。电泳完毕后，部分胶用考马斯亮蓝进行染色，另一部分胶移至电转膜仪上，100V 120min，用半干转移系统将蛋白转印至PVDF膜上，根据同细菌表面黏附蛋白可以同黏蛋白特异性结合的原理，加入I 600稀释的HRP标记的粘蛋白作为抗体，同PVDF膜上的相关蛋白进行杂交，4°C孵育过夜，TBST洗膜3次，每次30分钟，ECL显色检测目的蛋白。LC-MS/MS
根据Western印迹结果，选取PAGE胶上蛋白条带，通过液质联用(LC-MS/MS)测定氨基酸序列，并通过Sequest软件做初步分析。根据质谱分析的结果，通过蛋白质组学数据统计分析软件(Trans-proteomics Pipeline,TPP)软件包及FASTA软件进一步筛选分析相关蛋白。初筛蛋白基因的克隆
MS结果发现相关蛋白可能是(I) A型GTP结合蛋白(GTP-Binding Protein TypA,GBP) ； (2)丙酮酸氧化酶(Pyruvate Oxidase, PO) ； (3)细胞分裂激活蛋白(Cell Divisioninitiation protein FtsQ, CD) ; (4)整合膜蛋白(Integral Menbrane Protein, IMP) ； (5)后期能力蛋白(Late Competence Protein, LCP)。分别对其进行克隆和表达(见表I);应用expasy (http://cn. expasy. org/)中的TMHMM工具,显示跨膜区。并根据蛋白质序列分析对整合膜蛋白的膜外部分作分段表达(见图1)。以Genbank中各蛋白对应的基因序列为模板，设计引物，通过PCR反应获取相应的基因产物。反应程序为基因组DNA经94°C变性3分钟；随后按94°C 30秒，550C 30秒，72°C 2分钟进行30个循环；最后72°C 10分钟。PCR结束后1%琼脂糖电泳鉴定。表1. PCR 引物
权利要求
1.一种整合膜蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，用整合膜蛋白免疫动物，从动物体内分离多克隆抗体，其中，所述的整合膜蛋白是 (i)如SEQID NO:1中第455-755位所示氨基酸序列的蛋白；或 (ii)如SEQID NO:1所示氨基酸序列的蛋白；或 (iii)(i)或(ii)指定的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进细胞黏附功能的由(i)或(ii)衍生的蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的动物为家兔、小鼠或大鼠。
3.根据权利要去2所述的制备方法，其特征在于，用纯化的所述的整合膜蛋白免疫兔子；免疫量600 ±200 u g每只每次；初次免疫14±3天后，每14±3天用纯化的所述的整合膜蛋白STY加强免疫I次，免疫量是300 ± 100 u g每只每次，至少加强免疫2次；从兔血清中分离多克隆抗体。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述的整合膜蛋白在免疫动物之前，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸残基为1-20个。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸残基为1-10个。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸残基为1-5个。
8.—种如权利要求1所述制备方法制备的整合膜蛋白的多克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及一种细菌表层黏附蛋白及其用途。本发明公开了一种整合膜蛋白STY的用途，用于制备促进细胞黏附的试剂。本发明还公开了利用所述整合膜蛋白STY改变细胞黏附特性的方法。本发明还公开了所述整合膜蛋白STY的特异性抗体。
文档编号C07K16/06GK103012585SQ20131000799
公开日2013年4月3日 申请日期2008年12月25日 优先权日2008年12月25日
发明者秦环龙, 沈通一 申请人:上海市第六人民医院