专利名称：一种缩宫素溶液的提取工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药用原料缩宫素的生物提取方法，属于生物工程领域，具体是一种缩宫素溶液的提取工艺。
背景技术：
缩宫素又名 催产素，是一种有胎盘哺乳类动物体内的九肽神经内分泌激素，主要由下丘脑催产素神经元合成，沿其轴突运输并贮存到垂体后叶，在适当的刺激下以脉冲方式释放，对动物体具有多种生理效应，现主要被用于催产、引产和防止产后出血。催产素由9个氨基酸组成，其中2个半胱氨酸在1，6位组成I个二硫键，相对分子量为1007，等电点7.7，易溶于水，溶于丙酮、丁醇和稀醋酸，不溶于乙醚和石油醚，pH3.8 4.4的酸性溶液中较稳定，碱性溶液中不稳定，在血液循环中以自由肽的形式存在。自从Vigneaud等在1953年首次合成出催产素以来，目前全球范围的缩宫素原料药的生产以化学合成为主，少数从动物脑垂体后叶提取。但多年来的临床应用发现，化学合成缩宫素的使用个体差异较大，药物半衰期短，预防产后出血国内多用10 20U化学合成缩宫素肌注或静脉注射，但仍有部分产妇对此无效。夏红卫等研究了“天然缩宫素与合成缩宫素预防产后出血的比较”发现天然缩宫素促子宫收缩、预防产后出血的作用优于化学缩宫素。与化学合成法相比，生物提取法不会引入多种缩宫素的结构类似物，如二聚体、非对映异构体、断裂肽、开环肽等。但生物原料成份复杂，缩宫素的含量较低一直成为制约其应用的瓶颈，若能开发一种有限去除杂组分，提高缩宫素的提取率的工艺必将推动生物提取法的发展，应用前景广泛。
发明内容
本发明的目的是为了缩短了生产周期、降低了生产成本并简化了纯化工艺而提出了一种采用膜分离技术和树脂纯化组合的一种缩宫素溶液的提取工艺。不发明的技术方案为:一种缩宫素溶液的提取工艺，其具体步骤如下:(1)向猪脑垂体中加入有机溶剂,浸泡20 24小时后,去除上清液,再加入有机溶剂重新浸泡16 20小时,取出脑垂体滤干；(2)将步骤(I)中滤干的脑垂体切取垂体后叶，干燥后粉碎，得垂体后叶干粉；(3)将步骤(2)中得到的垂体后叶干粉加入到醋酸溶液中，机械搅拌，过滤得滤液A和滤饼；(4)将步骤(3)中得到的滤饼加入到醋酸溶液中，机械搅拌，过滤得滤液B ；(5)合并滤液A和滤液B后，通过超滤膜得滤液C，将滤液C减压浓缩4 6倍，得浓缩液；(6)将步骤(5)中的浓缩液用酸调pH为3.5 6.0，通过平衡好的弱酸型离子交换树脂柱进行洗脱，间隔收集洗脱液；(7)将步骤(6)中的洗脱液在280nm下进行紫外检测，当吸光度小于0.2时停止洗脱，合并吸光度不小于0.2的洗脱液；(8)把步骤(7)中合并的洗脱液减压浓缩8 10倍，得缩宫素溶液。优选步骤(1)中的有机溶剂为丙酮、乙醇或乙酸；有机溶剂每次的加入量为6 8mL/g猪脑垂体量。优选步骤(2)中干燥条件为60 80°C真空干燥6 12小时；所得的垂体干粉全部过60 120目筛。优选步骤(3)和(4)的醋酸溶液量均为6 12mL/g垂体后叶干粉量；醋酸溶液的体积百分浓度为0.1 0.2%;机械搅拌的速率为150 300rpm，时间为I 2小时。优选步骤(5)中所用的超滤膜截留分子量为1200 1600Da，超滤过程的压力为0.02 0.04Mpa，温度为 30 40°C，流速为 1.0 2.0mL/s。优选步骤(6)中调节pH值所用的酸为盐酸、硫酸或醋酸；弱酸型离子交换树脂为D113，724或111，柱的径高比为1:8 10 ;以体积百分浓度4 6%醋酸钠溶液洗脱，流速为4 6mL/min,每30 50min收集一次。优选步骤(5)和(8)中的减压浓缩过程:转速均为50 90rpm，温度均为50 60°C，真空度均为0.07 0.1OMPa0有益效果:(1)本发明采用生物提取法提取缩宫素，生产周期比化学合成法缩短30%，仅用到一种有机试剂，减少了环境污染。(2)本发明采用膜技术与树脂纯化相结合的方法纯化缩宫素，缩宫素的纯度达到90%,提取率达85%以上，并且未检测到缩宫素结构类似物加压素，达到目前生物提取法的最闻水平。
具体实施例方式以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1称取猪脑垂体2kg,加入12L丙酮，浸泡24小时后，去除上清液，再加入12L丙酮，浸泡20小时后，取出脑垂体滤干。切取滤干脑垂体的垂体后叶，80°C真空干燥12小时后粉碎，所得的垂体干粉全部过60目筛，称量垂体干粉质量为122g。向垂体干粉中加入732ml体积浓度为0.2%醋酸溶液，300rpm下机械搅拌2小时，过滤得滤液A和滤饼。将滤饼加入到732ml体积浓度为0.2%醋酸溶液中，300rpm下机械搅拌2小时，过滤得滤液B。合并滤液A和滤液B后，通过截留分子量为1600Da超滤膜，在压力为0.04Mpa，温度为40°C，流速为2.0mL/s，超滤收集滤液C共计1450ml，将滤液C在转速为90rpm，温度为60°C，真空度为0.099MPa下减压浓缩，得浓缩液量取共计290ml。将浓缩液用盐酸调pH为3.5，通过平衡好的D113弱酸型离子交换树脂柱，柱的径高比为1:10，以体积浓度6%醋酸钠溶液洗脱，流速为6mL/min,每30min收集一瓶。将洗脱液在280nm下进行紫外检测，当吸光度小于0.2时停止洗脱，合并吸光度不小于0.2的洗脱液。把合并的洗脱液在转速为90rpm，温度为60°C，真空度为0.099MPa下减压浓缩10倍，得缩宫素溶液，检测其纯度为90.3%。实施例2
称取猪脑垂体1.5kg,加入10.5L乙醇，浸泡22小时后，去除上清液，再加入10.5L乙醇，浸泡18小时后，取出脑垂体滤干。切取滤干脑垂体的垂体后叶，70°C真空干燥8小时后粉碎，所得的垂体干粉全部过80目筛，称量垂体干粉质量为87g。向垂体干粉中加入1044ml体积浓度为0.15%醋酸溶液，200rpm下机械搅拌1.5小时，过滤得滤液A和滤饼。将滤饼加入到1044ml体积浓度为0.15%醋酸溶液中，200rpm下机械搅拌1.5小时，过滤得滤液B。合并滤液A和滤液B后，通过截留分子量为1400Da超滤膜，在压力为0.03Mpa，温度为35°C，流速为1.5mL/s，超滤收集滤液C共计2100ml，将滤液C在转速为70rpm，温度为55°C，真空度为0.08MPa下减压浓缩，得浓缩液量取共计350ml。将浓缩液用硫酸调pH为
4.5，通过平衡好的724弱酸型离子交换树脂柱，柱的径高比为1:9，以体积浓度5%醋酸钠溶液洗脱，流速为5mL/min,每40min收集一瓶。将洗脱液在280nm下进行紫外检测，当吸光度小于0.2时停止洗脱，合并吸光度不小于0.2的洗脱液。把合并的洗脱液在转速为70rpm，温度为55°C，真空度为0.08MPa下减压浓缩9倍，得缩宫素溶液，检测其纯度为93.4%。实施例3
称取猪脑垂体Ikg,加入8L醋酸，浸泡20小时后，去除上清液，再加入8L醋酸，浸泡16小时后，取出脑垂体滤干。切取滤干脑垂体的垂体后叶，60°C真空干燥6小时后粉碎，所得的垂体干粉全部过120目筛，称量垂体干粉质量为53g。向垂体干粉中加入420ml体积浓度为0.1%醋酸溶液，150rpm下机械搅拌I小时，过滤得滤液A和滤饼。将滤饼加入到420ml体积浓度为0.1%醋酸溶液中，150rpm下机械搅拌I小时，过滤得滤液B。合并滤液A和滤液B后，通过截留分子量为1200Da超滤膜，在压力为0.02Mpa，温度为30°C，流速为1.0mL/s，超滤收集滤液C共计800ml，将滤液C在转速为50rpm，温度为50°C，真空度为
0.07MPa下减压浓缩，得浓缩液量取共计198ml。将浓缩液用醋酸调pH为6.0，通过平衡好的111弱酸型离子交换树脂柱，柱的径高比为1:8，以体积浓度4%醋酸钠溶液洗脱，流速为4mL/min,每50min收集一瓶。将洗脱液在280nm下进行紫外检测，当吸光度小于0.2时停止洗脱，合并吸光度不小于0.2的洗脱液。把合并的洗脱液在转速为50rpm，温度为50°C，真空度为0.07MPa下减压浓缩8倍，得缩宫素溶液，检测其纯度为93.7%。
权利要求
1.一种缩宫素溶液的提取工艺，其具体步骤如下: (1)向猪脑垂体中加入有机溶剂，浸泡20 24小时后,去除上清液,再加入有机溶剂重新浸泡16 20小时，取出脑垂体滤干； (2)将步骤(I)中滤干的脑垂体切取垂体后叶，干燥后粉碎，得垂体后叶干粉； (3)将步骤(2)中得到的垂体后叶干粉加入到醋酸溶液中，机械搅拌，过滤得滤液A和滤饼； (4)将步骤(3)中得到的滤饼加入到醋酸溶液中，机械搅拌，过滤得滤液B; (5)合并滤液A和滤液B后，通过超滤膜得滤液C，将滤液C减压浓缩4 6倍，得浓缩液； (6)将步骤(5)中的浓缩液用酸调pH为3.5 6.0，通过平衡好的弱酸型离子交换树脂柱进行洗脱，间隔收集洗脱液； (7)将步骤(6)中的洗脱液在280nm下进行紫外检测，当吸光度小于0.2时停止洗脱，合并吸光度不小于0.2的洗脱液； (8)把步骤(7)中合并的洗脱液减压浓缩8 10倍，得缩宫素溶液。
2.根据权利要求1所述的一种缩宫素溶液的提取工艺，其特征在于步骤(I)中的有机溶剂为丙酮、乙醇或乙酸，有机溶剂每次的加入量为6 8mL/g猪脑垂体量。
3.根据权利要求1所述的一种缩宫素溶液的提取工艺，其特征在于步骤(2)中干燥条件为60 80°C干燥6 12小时；所得的垂体干粉过60 120目筛。
4.根据权利要求1所述的一种缩宫素溶液的提取工艺，其特征在于步骤(3)和(4)中醋酸溶液的体积百分浓度均为0.1 0.2% ;醋酸溶液量均为6 12mL/g垂体后叶干粉量；机械搅拌的速率为150 300rpm，时间为I 2小时。
5.根据权利要求1所述的一种缩宫素溶液的提取工艺，其特征在于步骤(5)中所用的超滤膜截留分子量为1200 1600Da，超滤过程的压力为0.02 0.04Mpa，温度为30 40°C，流速为 1.0 2.0mL/s。
6.根据权利要求1所述的一种缩宫素溶液的提取工艺，其特征在于步骤(6)中调节pH值所用的酸为盐酸、硫酸或醋酸；弱酸型离子交换树脂为D113，724或111，柱的径高比为1:8 10 ;以体积百分浓度4 6%醋酸钠溶液洗脱，流速为4 6mL/min，每30 50min收集一次。
7.根据权利要求1所述的一种缩宫素溶液的提取工艺，其特征在于步骤(5)和(8)中的减压浓缩过程:转速均为50 90rpm，温度均为50 60°C， 真空度均为0.07 0.1OMPa0
全文摘要
本发明公开了一种缩宫素溶液的提取工艺。主要包括原料的处理、高温提取、超滤、浓缩、离子交换树脂纯化等。该工艺是从动物垂体中直接分离提取缩宫素，克服了化学合成缩宫素工艺过程复杂、生物活性低、半衰期短、成本高等问题，高温提取有效的使原料液中的蛋白质变性，并通过超滤和离子交换树脂纯化除去变性蛋白、杂质及缩宫素类似物，缩短了生产周期、节约了成本、工艺简单、易操作、适合工业化生产。
文档编号C07K1/18GK103087152SQ201310017410
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月17日 优先权日2013年1月17日
发明者沈飞, 胡永红, 于辉, 李栋芸, 李佼佼, 冯旌, 朱文俊, 杨文革 申请人:南京新百药业有限公司, 南京工业大学