一种高纯度比伐卢定及其工业化制备方法
【专利摘要】本发明提供一种高纯度比伐卢定及其工业制备方法。制备方法采用固相多肽合成技术，通过使用方便回收且价格低廉的溶剂乙酸乙酯作为洗涤剂，提高了反应收率和产品品质，有效降低了生产成本，减少了废物排放。
【专利说明】一种高纯度比伐卢定及其工业化制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于一种高纯度药用多肽及其工业化制备方法，特别的，本发明涉及一种高纯度比伐卢定及其工业制备方法。
【背景技术】
[0002]比伐卢定(bivalirudin)，又名比伐芦定，分子式C98H138N24O33, CAS 号 128270-60-0，是一种人工合成的水蛭素衍生物，具有抑制凝血酶的活性，临床中常作为抗凝剂应用于经皮冠状动脉成形术(PCI)中。比伐卢定最早由Biogen公司研发,后由美国the Medicines公司开发上市，商品名Angiomax。目前，国内仅有深圳信立泰药业上市了比伐卢定制剂产品，商品名为泰加宁。
[0003]比伐卢定由20个氨 基酸组成,其氨基酸序列为:D-Phe-Pro-Arg-Pro_Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-1Ie-pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH,化学名称为:D_ 苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-天冬酰胺酰-甘氨酰-天冬氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-异亮氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸。
[0004]比伐卢定原料药的工业生产多采用化学合成的方法，具体的，可以采用液相合成法、固相合成法或两种方法的结合。其中，固相合成法因其产率高、产物易分离等特点在多肽类产品化学合成中广泛使用。目前比伐卢定的合成多采用固相合成法。
[0005]比伐卢定的固相合成涉及多个合成步骤，每一步反应完成后都需要使用洗涤剂将肽树脂里的残留的反应物洗涤干净才能进行下一步反应。否则，残留的反应物会引起一系列副反应，并在后续反应中累积，进而导致产品总收率降低，产品杂质量和杂质数增多，并给后续的粗肽精制带来困难。
[0006]对于洗涤剂的选择，现有技术多用DMF或DMF配合甲醇、二氯甲烷作为每一步反应后的洗涤剂。专利CN200610024611.5报道了使用DMF作为洗涤剂应用于比伐卢定固相合成中；专利CN200810008131.9报道了使用DMF、甲醇及二氯甲烷作为洗涤剂应用于比伐卢定固相合成中。DMF沸点高达152.8 0C，工业生产中回收套用成本较高，如果直接排放，则会造成环境污染；甲醇洗涤效果不佳，无法单独作为洗涤剂使用，且甲醇毒性大，易对人身造成伤害，对环境造成污染；二氯甲烷的沸点过低(39.8°C)，在单独使用或与DMF混合使用时容易因挥发而损耗，不利于工业化生产，所以也不是理想的洗涤溶剂。尽管在实际生产中，洗涤效果也可以通过增加洗涤次数提高，但是多次洗涤树脂势必消耗大量的有机溶剂。所以寻找一种经济、低毒且高效的比伐卢定固相合成洗涤溶剂是需要解决的技术问题。
[0007]发明人从解决现有技术的不足出发，通过大量实验发现，采用固相合成法制备比伐卢定时，使用乙酸乙酯作为树脂洗涤剂可以明显提高反应收率，所得比伐卢定具有更高的纯度和纯肽含量。
【发明内容】
[0008]本发明的一个目的在于提供了一种用于比伐卢定固相合成中的洗涤剂及其使用方法，可以有效降低比伐卢定生产成本，所得比伐卢定的收率和纯度均高于现有技术的方法。
[0009]本发明通过使用3飞ml/g树脂的乙酸乙酯作为比伐卢定固相合成方法中的洗涤剂而实现上述有益效果，洗涤次数为1-9次。所述合成方法包括偶联反应步骤和脱保护步骤，在偶联反应步骤和脱保护步骤完成后，使用洗涤剂冲洗树脂，避免将剩余的反应物带入后续的反应中，如所用洗涤剂量过少，则可能导致洗涤效果差，残留的反应物会带入后续的反应中，进而影响反应收率和产品品质；而过多的洗涤量则会造成浪费，并增加产品生产成本。所述计量单位ml/g树脂是指:在所述固相反应每个步骤中每使用I克连接氨基酸的树月旨，对应的步骤所用溶剂量为I ml ;例如:在脱保护步骤中使用3飞ml/g树脂的乙酸乙酯指代:该脱保护步骤中每使用I克待脱保护的树脂，对应的脱保护步骤所用洗涤剂乙酸乙酯的量为:1~6 ml，优选的，所述洗涤剂乙酸乙酯的用量为4 ml/g树脂。尽管理论上，通过多次洗涤可以更有效的去除杂质，但是多次洗涤势必增加溶剂用量，延长总反应时间，进而提高生产成本。发明人通过大量实验出人意料的发现，在固相多肽法合成比伐卢定的反应中，相同条件下，使用乙酸乙酯作 为洗涤剂，比使用其他溶剂更能彻底洗去杂质，所使用的洗涤剂量也更少，在洗涤次数为1-9次，洗涤剂用量为:1~6 ml/g时，使用乙酸乙酯作为洗涤剂的优势尤为明显。所述的每步反应使用的洗涤剂的量和洗涤次数相互独立，所述的每步反应的洗涤次数是累积的，具体的，对于偶联反应步骤，对应的乙酸乙酯的洗涤次数优选为广3次，对于脱保护步骤，对应的乙酸乙酯的洗涤次数为优选为5、次。
[0010]比伐卢定固相合成反应使用的氨基酸原料，其端位氨基保护基可为有机化学反应中常见的保护基，如Boc、Fmoc、Moz等,优选的,所述氨基保护剂为Fmoc。
[0011]所述固相合成所用的树脂为Leu-Wang Resin树脂,负载量(SD)在0.5"! mmol/g之间，优选0.6 mmol/g。过低负载量的树脂尽管洗涤效率高，但反应产量低，进而生产总成本高；而过高负载量的树脂意味着负载的肽量高，则需要大量的洗涤溶剂，反应时也容易因肽链缠绕而导致产率降低，进而降低产品品质，增大后续提纯难度，生产总成本升高。
[0012]本发明的另一个目的在于提供了一种比伐卢定的生产方法，适用于以乙酸乙酯为洗涤剂的比伐卢定固相合成，该方法各步骤结合紧密，且经济环保，可用于比伐卢定的工业化生产中，所述方法包括下列步骤:
1)、以SD为0.5~1 mmol/g的Leu-Wang Resin树脂为原料，使用偶联剂和活化剂将树脂与端位氨基被保护的氨基酸Tyr-OH缩合；
2)、除去反应液，固相使用乙酸乙酯洗涤；
3)、使用哌啶DMF溶液脱保护；
4)、除去反应液，固相使用乙酸乙酯洗涤；
5)、参照I)至4)的步骤，将其余十八个端位氨基被保护的氨基酸按照比伐卢定氨基酸序列依次缩合；
6)、用裂解试剂切割比伐卢定肽树脂，收集裂解试剂，用乙醚沉淀粗肽；
7)、用反相高效液相法纯化粗肽，干燥得纯品。
[0013]所述比伐卢定的生产方法中，所使用的偶联剂为DCC、DIC、HBTU、TBTU、PyBOP的一种或多种的混合物；所使用的活化剂为HOAt、HOBt中的一种或两种的混合物；所使用的偶联反应溶剂为DMF ;所使用的裂解溶液为体积比为95:2.5:2.5的TFA、TIS、H2O混合溶液，使用量为6-12 ml/g树脂；乙醚的用量为8-10倍体积的裂解液量；对于本发明所述技术方案，在所述比伐卢定固相合成法的合理的原料用量及原料配比范围内，使用所述用量及洗涤次数的乙酸乙酯作为洗涤剂均可以实现有益效果，优选的，当所使用的偶联剂与氨基酸的比例在广1.1:1，所使用的活化剂与氨基酸的比例在广1.1:1时，洗涤效果尤为明显。
[0014]所述比伐卢定的生产方法中，使用的脱保护基试剂是用量为8-12 ml/g树脂的体积百分数为20%的哌啶DMF溶液，由于在实际生产中，为了更完全的脱除保护基，可以重复多次脱保护的操作，并将脱保护基试剂分配到每个操作中，所以所述脱保护试剂的用量是指累积用量。 例如，脱除同一个肽树脂保护基反应中，可将使用量为10 ml/g树脂的脱保护基试剂分成两份，重复进行两次脱保护操作，每次脱保护操作后均使用乙酸乙酯洗涤。
[0015]所述比伐卢定的生产方法的一个优选实施方式，包括下列步骤:
1)、以SD为0.6 mmol/g的Leu-Wang Resin树脂为原料，以DIC为偶联剂，HOBt为活化剂，DMF为溶剂，将树脂与氨基酸Fmoc-Tyr-OH偶联；所述偶联剂与氨基酸的摩尔比为1.1:1，所述活化剂与氨基酸的摩尔比为1.1:1 ;
2)、除去反应液，固相以4ml/g树脂比例的乙酸乙酯洗涤I次；
3)、加入5ml/g树脂的体积百分数为20%的哌啶DMF溶液脱保护；
4)、除去反应液，固相以4ml/g树脂比例的乙酸乙酯分2次洗涤；
5)、加入5ml/g树脂的体积百分数为20%的哌啶DMF重复脱保护；
6)、除去反应液，固相以4ml/g树脂比例的乙酸乙酯分5次洗涤；
7)、参照I)至6)的步骤，以DIC为偶联剂，HOBt为活化剂，DMF为溶剂，将其余十八个Fmoc保护的氨基酸按照比伐卢定氨基酸序列依次偶联，所述偶联剂与氨基酸的摩尔比为1.1:1，所述活化剂与氨基酸的摩尔比为1.1:1 ;
8)、用6-12ml/g树脂的裂解液切割比伐卢定肽树脂，收集裂解液，用8-10倍体积裂解液量的乙醚沉淀粗肽；
9)、用反相高效液相法梯度洗脱纯化粗品，洗脱剂《_):V(ill):V(7K)=1:250:75(Tl:400:600，收集洗脱剂，干燥后得纯品。
[0016]本发明的第三个目的在于提供了一种比伐卢定产品，采用上述制备方法制得，其具有生产成本低、纯度高、纯肽含量高、杂质数量少、杂质含量低的特点。
[0017]本发明提供了一种高纯度比伐卢定及其制备方法，其有益效果在于:
1、采用成本低廉、易于回收的乙酸乙酯作为比伐卢定固相合成洗涤剂，降低了生产成本，减少了废液排放；
2、提供了洗涤剂最优使用量范围，并据此设计了适用乙酸乙酯作为洗涤剂的比伐卢定固相合成方法，该方法具有经济、环保的特点，适用于比伐卢定工业化生产；
3、提供了一种比伐卢定产品，该产品具有生产成本低、纯度高、纯肽含量高、杂质数量少、杂质含量低的特点。
[0018]【专利附图】
【附图说明】
图1为实施例1所得比伐芦定粗品色谱图 图2为实施例1所得比伐芦定纯化品色谱图【具体实施方式】
[0019]下面结合具体的实例对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0020]
实施例1
采用本发明所述技术方案制备比伐卢定
1、称取I kg Leu-Wang Resin (SD=0.60 mmol/g)树脂置于硅烷化的玻璃反应器中,加入6 L DMF，使树脂完全浸入其中，搅拌30 min，抽滤DMF。室温下，将Fmoc-Tyr-OH (0.55kg, 1.2 mol)和HOBt (0.173 kg, 1.3 mol)溶解在3.3 L DMF里，加入到上述树脂里搅拌均匀，随即加入DIC (0.2 L,l.3 mol)，搅拌反应:3~4 h。经Kaiser试剂检测，树脂呈现无色后抽走反应液。
[0021]2、加入4 L乙酸乙酯搅拌5min,抽走洗漆液。
[0022]3、在树脂中加入5 L体积百分数为20%的哌啶DMF溶液，搅拌反应3-10 min，抽
滤掉反应液。
[0023]4、加入4 L乙 酸乙酯搅拌5min，抽走洗涤液，重复洗涤I次。
[0024]5、在树脂中加入5 L体积百分数为20%的哌啶DMF溶液，搅拌反应20 min,抽滤
掉反应液。
[0025]6、加入4 L乙酸乙酯搅拌5min，抽走洗涤液，重复洗涤5次。
[0026]7、参照上述1-6步，将C端第4-20个氨基酸的依次偶联；
其中第3-20个氨基酸的用量如下:
Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH: 0.51 kg,1.2mol
Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH: 0.51 kg,1.2mol
Fmoc-L-Pro-OH: 0.404 kg,1.2mol
Fmoc-L-1le-OH: 0.424 kg,1.2mol
Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH: 0.51 kg,1.2mol
Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH: 0.51 kg,1.2mol
Fmoc-L-Phe-OH: 0.464 kg,1.2mol
Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH: 0.494 kg,1.2mol
Fmoc-Gly-OH: 0.356 kg,1.2mol
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH: 0.716 kg,1.2mol
Fmoc-Gly-OH: 0.356 kg,1.2mol
Fmoc-Gly-OH: 0.356 kg,1.2mol
Fmoc-Gly-OH: 0.356 kg,1.2mol
Fmoc-Gly-OH: 0.356 kg,1.2mol
Fmoc-L-Pro-OH: 0.404 kg,1.2mol
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH: 0.776 kg,1.2mol
Fmoc-L-Pro-OH: 0.404 kg,1.2mol
Fmoc-D-Phe-OH: 0.464 kg,1.2mol脱保护完成并洗涤完毕后，真空干燥处理得到2 kg肽树脂；
8、裂解
室温下，将所得肽树脂分批加入到装有10 L裂解液(Vtfa =Vtis:VH20=95:2.5:2.5)的反应器中，维持搅拌2.5 h。抽滤裂解液，使用3 L裂解液分两次洗涤树脂，洗涤液并入到裂解液中，将该裂解液滴入到约120 L冷乙醚中并激烈搅拌，离心洗涤。干燥得粗品1.2 kg，经高效液相法检测，产品纯度93% (谱图如图1所示)。
[0027]9、提纯
将所得粗品采用反相高效液相色谱梯度洗脱纯化分离，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，洗脱剂 w(TFA):V(⑶):V(水)=1:250:750~1:400:600，流速 500 ml/min，检测波长 214nm。旋蒸收集到的洗脱液，冷冻干燥后得到比伐卢定0.54kg，纯度99.8%，总产率37%(谱图如图2所示)。
[0028]
对比实施例1
参照实施例1的合成工艺和投料比，将其中的洗涤剂乙酸乙酯改为DMF。反应粗品纯度84 %，纯化后纯度99.8 %，总产率26 %。
[0029]
对比实施例2
参照实施例1的合成工艺和投料比，将其中第2步和第4步的洗涤剂乙酸乙酯改为DMF，将第6步的洗涤剂改为使用DMF (5LX4次)、甲醇(5LX I次)、二氯甲烷(5LX I次)依次洗涤，并在第7步中其他氨基酸缩合、脱保护的洗涤剂也作出对应改变。反应粗品纯度86 %，纯化后纯度99.8 %，总产率28 %。
[0030]
本说明书中，各英文缩写对应的试剂名称如下:
【权利要求】
1.一种比伐卢定的固相合成方法，其特征在于所述合成方法包括偶联反应步骤和脱保护步骤，在偶联反应步骤和脱保护步骤完成后，使用3飞ml/g树脂的乙酸乙酯作为反应完成后的洗涤剂，洗涤次数为1-9次。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于所述偶联反应步骤后，对应的乙酸乙酯的洗涤次数为广3次；所述脱保护步骤后，对应的乙酸乙酯的洗涤次数为优选为5、次；所述乙酸乙酯的用量为4 ml/g树脂。
3.根据权利要求1-2任意一项所述的合成方法，其特征在于所述方法包括下列步骤: 1)、以SD为0.5~1 mmol/g的Leu-Wang Resin树脂为原料，使用偶联剂和活化剂将树脂与端位氨基被保护的氨基酸Tyr-OH缩合； 2)、除去反应液，固相使用乙酸乙酯洗涤； 3)、使用哌啶DMF溶液脱保护； 4)、除去反应液，固相使用乙酸乙酯洗涤； 5)、参照I)至4)的步骤，将其余十八个端位氨基被保护的氨基酸按照比伐卢定氨基酸序列依次缩合； 6)、用裂解试剂切割比伐卢定肽树脂，收集裂解试剂，用乙醚沉淀粗肽； 7)、用反相高效液相法纯化粗肽，干燥得纯品。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于所述合成方法使用的偶联剂为DCC、DIC、HBTU、TBTU、PyBOP的一种或多种的混合物，所述偶联剂的比例为I~1.1:1。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于所述合成方法使用的活化剂为HOAt、HOBt中的一种或两种的混合物，所述活化剂的比例为f 1.1:1。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于所述步骤3)中的哌啶DMF溶液为体积分数为20%的哌啶DMF溶液，使用量为8-12 ml/g树脂。
7.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于所述步骤6)的裂解试剂为TFA、TIS、H2O的混合溶剂，体积比为95:2.5:2.5，所述裂解试剂的用量为6_12 ml/g树脂。
8.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于所述步骤6)中乙醚的体积用量是裂解试剂的8-10倍。
9.根据权利要求4-8中任意一项所述的合成方法，其特征在于所述方法包括下列步骤: .1)、以SD为0.6 mmol/g的Leu-Wang Resin树脂为原料，以DIC为偶联剂，HOBt为活化剂，DMF为溶剂，将树脂与氨基酸Fmoc-Tyr-OH偶联；所述偶联剂与氨基酸的摩尔比为.1.1:1，所述活化剂与氨基酸的摩尔比为1.1:1 ; 2)、除去反应液，固相以4ml/g树脂比例的乙酸乙酯洗涤I次； 3)、加入5ml/g树脂的体积百分数为20%的哌啶DMF溶液脱保护； 4)、除去反应液，固相以4ml/g树脂比例的乙酸乙酯分2次洗涤； 5)、加入5ml/g树脂的体积百分数为20%的哌啶DMF重复脱保护； 6)、除去反应液，固相以4ml/g树脂比例的乙酸乙酯分5次洗涤； 7)、参照I)至6)的步骤，以DIC为偶联剂，HOBt为活化剂，DMF为溶剂，将其余十八个Fmoc保护的氨基酸按照比伐卢定氨基酸序列依次偶联，所述偶联剂与氨基酸的摩尔比为.1.1:1，所述活化剂与氨基酸的摩尔比为1.1:1 ;8)、用6-12ml/g树脂的裂解液切割比伐卢定肽树脂，收集裂解液，用8-10倍体积裂解液量的乙醚沉淀粗肽； 9)、用反相高效液相法梯度洗脱纯化粗品，洗脱剂《_):V(ill):V(7K)=1:250:75(Tl:400:600，收集洗脱 剂，干燥后得纯品。
10.一种比伐卢定产品，其特征在于采用权利要求1-9中任意一项所述的合成方法制备得到。
【文档编号】C07K1/06GK103965293SQ201310045298
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月5日 优先权日:2013年2月5日
【发明者】田茂奎, 陈艳 申请人:深圳信立泰药业股份有限公司