专利名称：核桃降血压活性肽及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核桃降血压活性肽及其制备方法与应用。
背景技术：
核桃为胡桃科胡桃属植物，是世界四大干果之一。核桃油中饱和脂肪酸总量一般小于10%，不饱和脂肪酸主要有油酸、亚油酸和亚麻酸，总量约90%，为人体必需的脂肪酸，对调节生理机能有重要作用。核桃仁中蛋白的含量约为15%，其中含有18种氨基酸，8种人体必需氨基酸，且含量合理，接近联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)规定的标准，是一种很好的木本植物蛋白。核桃制油剩余的核桃柏占核桃仁重量的40%-60%，其中蛋白含量在30%以上，多被用作动物饲料原料，造成资源浪费。因此对核桃进行深加工，通过提取核桃蛋白对其进行再利用，既可提高核桃加工的附加值，又可以充分利用核桃蛋白资源。核桃多肽一般由3-20个氨基酸组成，采用适当的蛋白酶对核桃蛋白进行水解，可获得具有一定生物活性的核桃蛋白肽，其活性主要包括抗氧化、提高免疫力、降血压活性等。已有发明专利涉及酶解核桃蛋白制备核桃肽的技术，但对核桃肽的具体生物活性未作明确界定。制备小分子多肽的方法主要包括化学水解法和生物酶解法。生物酶解法与化学水解法制备核桃肽相比，具有反应条件温和，氨基酸受损较少，可以获得特定肽段的优势，但同时存在水解时间较长，短肽得率较低等缺点。酶解之后得到核桃混合多肽，多具有较重的苦味，影响了在食品加工中的应用。根据前面述及的核桃蛋白肽制备中存在的问题，选用合适的蛋白酶和酶解工艺，结合辅助方式提高核桃肽得率，脱除核桃肽的苦味，提高核桃肽的生物活性，对核桃产品多样化和保健食品及药品的开发具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种核桃降血压活性肽及其制备方法与应用。本发明所提供的核桃降血压活性肽的制备方法，包括如下步骤:将核桃蛋白变性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；将所述核桃肽经分子量分级后脱苦，获得核桃降血压活性肽；为了提高酶解效率和短肽得率，所述变性按照包括如下步骤的方法进行:将所述核桃蛋白配制成浓度为30— 80g/L(如30、50或80g/L)的水溶液，得到核桃蛋白液；将所述核桃蛋白液依次进行微波处理和超声波处理；在所述微波处理中，微波的频率为2450MHz，功率为每升所述核桃蛋白液100-1000W (如100,500或1000W)，处理时间为10-15分钟(如
10、12或15分钟);在所述超声波处理中，超声波的频率为40— 60kHz (如40、50或60kHz)，处理时间为20— 50分钟(如20、30或50分钟)；所述核桃蛋白液在进行所述微波处理时的起始温度为25°C。在上述方法中，为了较少地引入盐离子，所述蛋白酶为中性蛋白酶，具体可为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶；所述酶解按每克所述核桃蛋白使用1000— 2000U (如1000、1500或2000U)的所述蛋白酶进行；所述酶解的温度为45°C—55°C (如45、48或55°C);所述酶解的pH值为6.0—6.8 (如6.0,6.4或6.8);所述酶解的时间为2—4小时(如2、3或4小时)；所述酶解的pH值使用Imo I/L氢氧化钠溶液调节。在上述方法中，所述分子量分级按照包括如下步骤的方法进行:将所述核桃肽依次通过0.45 i! m微滤膜、SkD超滤膜和IkD超滤膜，收集透过所述IkD超滤膜的核桃肽；所述超滤膜具体可为再生纤维素膜。在上述方法中，所述脱苦按照包括如下步骤的方法进行:45°C—60°C (如45、50或60°C)条件下，将所述透过所述IkD超滤膜的核桃肽与P -环状糊精以100: (16—20)(如100:16、100:18或100:20)的质量比混合包埋处理10—20分钟(如10、15或20分钟)。所述透过所述IkD超滤膜的核桃肽在所述混合包埋的体系中的浓度为20—80g/L(如 20、50 或 80g/L)。所述脱苦后的产物可通过真空冷冻干燥，制成核桃肽粉，以方便储运、用作其他剂型和相关广品的加工；所述真空冷冻干燥按照包括如下步骤的方法进行:将所述脱苦后的产物于-50°C -45°C条件下预冻5小时后，于物料隔板温度10°C，真空度为5 — 30Pa条件下进行真空冷冻干燥，直至物料温度升至5°C 10°C，得到粉状的所述核桃降血压活性肽，包装后得到成品。在上述方法中，所述核桃蛋白可通过商业途径购买，也可按照包括如下步骤的方法制备:取质量比为(5—10): 100 (如5:100、8:100或10:100)的核桃柏和水混合，浸泡30分钟后打浆，用 0.1—0.9mol/L(如 0.1、0.8 或 0.9mol/L)的 NaOH 溶液调 pH 值至 7.5—8.4(如7.5、8.0或8.4)，于55°C下搅拌1.5—2小时(即进行碱溶)，离心，去油层，取上清液，用3mol/L柠檬酸溶液将所述上清液的pH值调至4.6—6.5 (如4.6、5.0或6.5)，离心后收集沉淀，得到所述核桃蛋白； 将所述沉淀用水溶解后，进行冷冻干燥，得到核桃蛋白粉。本发明保护上述任一所述方法制备得到的核桃降血压活性肽。本发明保护所述核桃降血压活性肽在制备降血压产品(或药物)中的应用。实验证明，本发明所提供的核桃降血压活性肽为浅黄色粉末，分子量在300-1200Da之间，精氨酸的摩尔百分比为14.72%，谷氨酸摩尔百分比为17.29%。该活性肽具有良好的血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性和体内降血压活性。在核桃降血压活性肽浓度为1.0mg/mL时，ACE抑制率为84.26%，一次给药剂量为150— 300mg/kg即对SHR(原发性高血压大鼠)有显著降血压效果，且对SHR的心率无影响；多次给药剂量以每天150mg/kg、300mg/kg、900mg/kg剂量喂养的SHR大鼠在9天后，SBP (尾动脉收缩压)与空白对照组相比有极显著降低，300mg/kg以上剂量喂养的SHR大鼠在21天后，SBP与空白对照组相比有显著降低。本发明所提供的核桃降血压活性肽制备方法与其他方法相比，采用了微波结合超声波预处理方式，使核桃蛋白适度变性，提高了核桃蛋白水解程度，增加了核桃肽得率，提高了制备效率。通过超滤分级，使降血压活性较高的肽段得到富集，使该分子量肽段比例显著增加，纯度提高。本发明方法制备核桃肽具有显著的体内、体外降血压活性，容易吸收，感官品质良好，可广泛地应用到功能食品、保健品、食品添加剂中。
图1为本发明核桃降血压肽的质谱图。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的结果如无特别说明，均为三次重复的平均值。下述实施例中的核桃柏为核桃制油后的剩余物，其蛋白含量为70% — 75%，购自北京绿湖工贸公司，也可用螺旋榨油机榨油后收集。实施例1、核桃降血压肽的制备 将核桃蛋白变性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；将所述核桃肽经超滤分级后脱苦，获得核桃降血压肽；具体步骤如下:1、核桃蛋白的制备取质量比为5:100的核桃柏和水混合，浸泡30分钟后打浆，用0.lmol/L的NaOH溶液调PH值至7.5，于55°C下搅拌1.5小时(即进行碱溶)，离心，去油层，取上清液，用3mol/L柠檬酸溶液将所述上清液的PH值调至6.5，离心后收集沉淀，得到所述核桃蛋白；将所述沉淀用水溶解后，进行冷冻干燥，得到核桃蛋白粉。2、核桃蛋白的变性(酶解预处理)将步骤I得到的所述核桃蛋白或核桃蛋白粉配制成浓度为30g/L的水溶液，得到核桃蛋白液；将所述核桃蛋白液依次进行微波处理和超声波处理；在所述微波处理中，微波的频率为2450MHz，功率为每升所述核桃蛋白液100W，处理时间为15分钟；在所述超声波处理中，超声波的频率为40kHz，处理时间为50分钟；所述核桃蛋白液在进行所述微波处理时的起始温度为25°C。3、核桃蛋白的酶解将经步骤2预处理的核桃蛋白液用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(购自北京奥博兴生物技术有限公司，产品目录编号:01-080)进行酶解；所述酶解按每克所述核桃蛋白使用1000U的所述中性蛋白酶进行；所述酶解的温度为45°C;所述酶解的pH值为6.0 ;所述酶解的时间为2小时；所述酶解的pH值使用lmol/L氢氧化钠溶液调节。经上述酶解后的酶解液升温至90°C灭酶10分钟，冷却，调pH至4.5，离心去掉未分解蛋白及杂质，取上清液，即核桃肽液。4、核桃肽的分子量分级将步骤3得到的核桃肽液依次通过0.45 U m微滤膜、SkD再生纤维素膜和IkD再生纤维素膜，收集透过所述IkD再生纤维素膜的核桃肽液，真空冷冻干燥，得到分子量在IkD左右及以下的核桃肽粉。5、核桃肽的脱苦将步骤4获得的核桃肽粉配成50g/L的溶液，加入核桃肽粉质量16%的P -环状糊精，45°C下搅拌均匀，包埋处理IOmin。6、核桃降血压肽产品的获得将经步骤5脱苦的核桃肽于_50°C _45°C冷阱中预冻5小时，于物料隔板温度10°c，真空度为5 — 30Pa的条件下进行真空冷冻干燥，直至物料温度升至5 10°C，得到核桃降血压肽粉，真空包装得到核桃降血压肽产品。结果:在本实施例条件下，微波加热及超声波处理后酶解核桃肽得率为65.83% ；在核桃肽浓度为1.0mg/mL时，步骤4获得的透过IkD超滤膜的核桃肽的血管紧张素转换酶(ACE)抑制率由步骤3获得的未分级核桃肽的62.04%提高到77.19%, ACE抑制活性显著提高；步骤4获得的透过IkD超滤膜的核桃肽经步骤5的包埋后，苦味值由未包埋的5降低到2，ACE抑制率与未包埋的相比降低了 2.8%。上述核桃肽得率的测定方法为三氯乙酸可溶性氮(TCA-NSI)法，具体如下:取步骤3的核桃肽液20ml，与10 %三氯乙酸(TCA)溶液震荡混合均匀，静置IOmin, 4000rmp/min下离心20min,取上清液进行消化处理，即将液体样品移入干燥的专用消煮管中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于管口放一小漏斗，放置在下有电加热的石棉网上加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入IOOml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀，用全自动凯氏定氮仪测定在10% TCA中可溶性氮的含量(记为NI);取酶解前的核桃蛋白液20ml，进行消化处理，消化方法、步骤同前所述，用全自动凯氏定氮仪测定原料中的总氮含量(记为NO)，根据公式TCA-NSI = (N1/N0) X 100%，计算得到核桃肽得率。上述血管紧张素转换酶(ACE)抑制率的测定方法如下:取步骤4获得的透过IkD超滤膜的核桃肽冷冻干燥，用超纯水配制成一定浓度，旋涡振荡混匀后作为待测液进行ACE抑制率的测定；或取步骤3获得的酶解液作为待测液进行ACE抑制率的测定:I)将HHL溶解于含0.3mol/L氯化钠的硼酸盐缓冲液(0.1mol / L，pH8.3)中，得到浓度为5mmol/L的HHL溶液；2)在2mL刻度离心管中依次加入80 y L的5mmol/L的HHL溶液、IOOy L去离子水和10 ii L待测液，将此混合液放入37°C恒温水浴中保温3min，然后加入10 uL(0.lU/mL)ACE酶液，开始反应。恒温保持30min，加入0.2mL的HCl (lmol/L)，中止反应，再加入1.2mL冷(_20°C )的乙酸乙酯,均勻混合大约15s,萃取被ACE所释放的马尿酸,3500r/min离心5min，将乙酸乙酯转入另一刻度试管中，在120°C的烘箱中烘干，重新溶于去离子水中，在228nm处测定吸光值。空白对照管除在反应前先加入0.2mL的HCl (lmol/L)中止反应外，其余操作相同。抑制率计算公式如下:
权利要求
1.一种核桃降血压活性肽的制备方法，包括如下步骤: 将核桃蛋白变性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；将所述核桃肽经分子量分级后脱苦，获得核桃降血压活性肽； 所述变性按照包括如下步骤的方法进行:将所述核桃蛋白配制成浓度为30— 80g/L的水溶液，得到核桃蛋白液；将所述核桃蛋白液依次进行微波处理和超声波处理；在所述微波处理中，微波的频率为2450MHz，功率为每升所述核桃蛋白液100— 1000W，处理时间为10—15分钟；在所述超声波处理中，超声波的频率为40— 60kHz，处理时间为20— 50分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 所述蛋白酶为中性蛋白酶；所述酶解按每克所述核桃蛋白使用1000— 2000U的所述蛋白酶进行；所述酶解的温度为45°C—55°C;所述酶解的pH值为6.0 — 6.8 ;所述酶解的时间为2— 4小时。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述中性蛋白酶为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶。
4.根据权利要求1一3中任一所述的方法，其特征在于: 所述分子量分级按照包括如下步骤的方法进行:将所述核桃肽依次通过0.45 y m微滤膜、SkD超滤膜和IkD超滤膜，收集透过所述IkD超滤膜的核桃肽。
5.根据权利要求1一4中任一所述的方法，其特征在于:所述脱苦按照包括如下步骤的方法进行:45°C—60°C条件下，将所述透过所述IkD超滤膜的核桃肽与￠-环状糊精以100: (16—20)的质量比混合包埋处理10 — 20分钟；所述混合包埋的体系中所述透过所述IkD超滤膜的核桃肽的浓度为20— 80g/L。
6.根据权利要求1一5中任一所述的方法，其特征在于:所述核桃蛋白按照包括如下步骤的方法制备:取质量比为(5—10): 100的核桃柏和水混合，浸泡30分钟后打浆，用0.1—0.9mol/L的NaOH溶液调pH值至7.5—8.4，于55°C下搅拌1.5—2小时，离心，去油层，取上清液，用3mol/L柠檬酸溶液将所述上清液的pH值调至4.6-6.5，离心后收集沉淀，得到所述核桃蛋白。
7.根据权利要求1一6中任一所述的方法，其特征在于:所述脱苦后还包括将所述脱苦后的产物进行真空冷冻干燥的步骤； 所述真空冷冻干燥按照包括如下步骤的方法进行:将所述脱苦后的产物于-50°C _45°C条件下预冻5小时后，于物料隔板温度10°C，真空度为5 — 30Pa条件下进行真空冷冻干燥，直至物料温度升至5°C 10°C，得到粉状的所述核桃降血压活性肽。
8.权利要求1-7中任一所述方法制备得到的核桃降血压活性肽。
9.权利要求8所述核桃降血压活性肽在制备降血压产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了核桃降血压活性肽及其制备方法与应用。所述方法包括将核桃蛋白变性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；将所述核桃肽经分子量分级后脱苦，获得核桃降血压活性肽；所述变性采用微波结合超声波的处理方式，使核桃蛋白适度变性，提高了核桃蛋白水解程度，增加了核桃肽得率，提高了制备效率；所述脱苦是在分子量分级后进行的，使降血压活性较高的肽段得到富集。本发明方法获得的核桃肽具有明确的体内和体外降血压活性，并用β-环状糊精有效掩盖了苦味，容易吸收，感官品质良好，可广泛地应用到功能食品、保健品、食品添加剂中。
文档编号C07K1/34GK103103244SQ20131005620
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者郝艳宾, 陈永浩, 齐建勋, 吴春林, 董宁光 申请人:北京市农林科学院