专利名称：一种链霉亲和素突变体及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程、蛋白质工程和发酵工程领域，涉及一种DNA分子的合成、克隆、突变和重组技术，尤其涉及一种链霉亲和素突变体及其制备方法。
背景技术：
链霉亲和素(Streptavidin,SA)是由链霉菌(Streptomyces avidinii)培养过程中分泌的一种小分子非糖基化蛋白质，分子量15kD，其天然形式为同源四聚体，分子量60kD，SA的成熟活性结构为127个氨基酸的多肽。1963年，Stapley在筛选抗菌素时首先发现，并予以报道。本世纪以来，SA由于其与生物素(Biotin，一种性能稳定的小分子化合物，又称维生素H、辅酶R)有非凡的亲和力和极高的特异性而受到国际生物学和医学界的高度重视。SA-Biotin复合物可以耐受变性剂(如盐酸胍)、去垢剂(如SDS)、蛋白水解酶、极端温度(4 90°C)和宽广pH环境(pH2 8)。1993年，在德国杜邦-墨克制药公司的L.D.Thompson和P.C.Weber (DuPontMerck Pharmaceutical C0., Wilmington, DE)两人公开发表了他们人工合成的、密码子优化的SA核心序列(从13 140aa的SA人工核酸和野生型氨基酸序列)，并克隆进IPTG诱导的pET3a原核表达载体，在大肠杆菌中进行了表达和制备[Gene，1993，Dec 22; 136(1-2):243-6]ο1998年,意大利Anna Gallizia等人用链霉菌cDNA重组克隆了 Streptavidin的核心序列(从15 159aa的SA野生型核酸和野生型氨基酸序列)，并且在T7-标签下游实现了可溶性表达[Protein Expression and Purification, 1998,14 (20): 192-6]。2012年，肖齐世等人(上海普欣生物技术有限公司)，人工合成并优化了 SA的核心氨基酸序列(从13 139aa的SA人工核酸和野生型氨基酸序列，见序列表中SEQ ID No:1和SEQ ID No: 2)，同样进行了 pET原核表达载体构建和IPTG诱导的原核表达、蛋白质纯化制备,表达产物为包涵体,制备产物为变性失活的SA,需要体外复性恢复活性,专利(申请号:201210159677.9)中未提到从变性蛋白到复性蛋白的几个关键指标:复性回收率，复性SA的比活性，与野生可溶性SA的对比亲和力等。然而，野生型SA (WtSA)分子的理化特性不是目前某些应用领域的最佳选择，因为其结合力不够稳定持久，这对需要连续长时间观察的动态实验(如细胞生物学领域)与影像研究较为不利。很多检测研究中也希望结合-解离的平衡左移，并能保持较长时间。因而，WtSA目前有被各种分子改造的稳定结合型突变体SA (mtSA)取代的迹象。尽管已经报道有200多种突变型SA，但关于SA突变后提高结合稳定性的研究很少。Mark Howarth, Oxford (GB)公开了稳定性结合 SA 突变体研究(US 2012/0214970 Al),提出并测试和保护了 3个双位点突变体S52G/R53D，S52G/R53N, S52G/R53S (见序列表中的SEQ ID No: 3，SEQ ID No: 4，SEQ ID No: 5)，其主体序列必须在第 23、27、43、45、49、79、88、90、92、108、110、120、128 与野生型 SA 相同。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种全人工基因合成加定点突变与随机突变获得的链霉亲和素突变体SA122m5及其制备方法。本发明的目的将通过以下技术方案得以实现:
一种链霉亲和素突变体，所述链霉亲和素突变体的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:6所示,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:7所示。优选的，上述的一种链霉亲和素突变体，其中:所述链霉亲和素突变体包含5个氨基酸的突变，分别为 E14D、T42Y、Y43T、S52G、R53D。一种上述的链霉亲和素突变体的制备方法，包括以下步骤:
O已知的具有159个氨基酸 的链霉亲和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQID N0:8所示，取其中的121个氨基酸(13 133)作为合成对象，并且引入两个氨基酸的突变:S52G、R53D，得到的121个氨基酸的突变序列如序列表中的SEQ ID N0:9所示；
2)将所述121个氨基酸的突变序列经DNAWorks逆翻译成核苷酸序列，所述核苷酸序列的密码子经DNAWorks优化(E.coli class II)，并且添加了起始密码ATG和终止密码TAA ；
3)添加了起始密码ATG和终止密码TAA的所述核苷酸序列通过PCR合成人工DNA序列，所述人工DNA序列命名为SA122m2，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:10所示，该人工DNA序列编码122个氨基酸的定点突变型链霉亲和素，所述定点突变是S52G、R53D ；
4)通过随机突变PCR改造SA122m2，获取其它氨基酸改变对其结合生物素功能的影响，从随机突变产生的DNA文库，选取了 I株突变体，命名为SA122m5，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，包含了 5个密码子突变，产生了 5个天然氨基酸的改变，分别为E14D、T42Y、Y43T、S52G、R53D ；
5)构建原核表达工程载体pET28a-SA122m5；
6)构建原核表达工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA122m5 ；
7)原核表达工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA122m5的扩增、诱导表达；
8)SA122m5的提取与纯化；
9)SA122m5的生物活性测定，所述SA122m5的突变包含T42Y，Y43T，由于Y43是SA-Biotin的重要结合位点之一，T42与Y43相邻，故Y42、T43的改变可能影响SA122m5对配体生物素或其衍生物的结合能力。本发明的突出效果为:本发明提供了一种链霉亲和素突变体及其制备方法，链霉亲和素突变体SA122m5提高了对生物素衍生物(如2-亚氨基生物素)的亲和力，有利于生物素化产物的检测；延长了与生物素结合的半寿期，有利于需要长时间观察的实验与影像研究。以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式
作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
图1是本发明实施例的重组表达载体pET28a_SA122m5的物理结构 图2是本发明实施例的链霉亲和素突变体SA122m5的SDS-PAGE，其中:1:蛋白分子量标志；2:空载体包含菌株；3:SA122m5菌株全菌裂解液；4:SA122m5菌株裂解液上清液。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例:
本实施例提供一种链霉亲和素突变体及其制备方法。1.全人工基因合成和定点突变引入
1.1已知的具有159个氨基酸的链霉亲和素成熟氨基酸(SEQ ID NO:8)，取其中的121个氨基酸(13 133)作为合成对象，并且引入两个氨基酸的突变:S52G、R53D，得到的121个氨基酸的突变序列(SEQ ID N0:9)；
1.2将上述121个氨基酸的突变序列的N端加Met氨基酸作为起始密码安置，形成122个氨基酸的序列，经美国国家生化信息中心(NCBI)网上软件DNAWorks逆翻译成核苷酸序列，上述核苷酸序列的密码子经DNAWorks优化(E.coli class II),在优化后的核苷酸序列的3’ -端添加终止密码TAA;
1.3添加了起始密码ATG和终止密码TAA的上述核苷酸序列通过PCR法人工合成，上述人工DNA序列命名为SA122m2(SEQ ID NO: 10)，该人工DNA序列编码122个氨基酸的定点突变型链霉亲和素，定点突变是S52G、R53D，将其克隆进盘古基因科技(苏州)有限公司的5分钟快速连接克隆测序载体TopFast pACK4a-Bs，通过DNA序列分析获得了序列正确的SA122m2 克隆(命名为 pACK4a_SA122m2)。2.随机突变PCR引入新的突变
以上述克隆pACK4a-SA122m2的SA122m2编码区为模板，用盘古基因科技(苏州)有限公司的rTaq加高浓度金属离子作随机突变PCR，将PCR产物再次克隆进pACK4a_Bs载体，挑取50个阳性克隆送DNA测序分析，挑取其中I个克隆pACK4a-SA122m5用于表达分析。3.亚克隆进pET28a原核表达载体
设计PCR引物，5’ -引物添加NcoI内切酶识别位点，3’ -引物添加XhoI酶切位点，PCR产物用Ncol/Xhol双酶切，同样用Ncol/Xhol处理pET28a载体，连接转化，挑取克隆，经测序分析，取得pET28a-SA122m5重组表达载体(如图1所示)，用该载体转化BL21 (DE3)感受态菌，取得表达菌株BL21-pET28a-SA122m5。4.测试表达
2XYT扩增细菌，IPTG诱导表达，诱导条件:IPTG 0.1mMole/L, 25°C诱导4小时，取ImL菌液，离心收集菌体，PBS洗涤I次，0.5mL PBS重悬浮，超声裂解菌体，离心保留上清和沉淀，分别上样SDA-PAGE，考马斯亮蓝染色-脱色，观察表达，结果如图2所示。5.SA122m5蛋白质纯化
LB+M9培养基2L，摇瓶扩菌，加IPTG，25°C诱导表达4小时，收集菌体，超声破碎菌体，离心收集上清，饱和硫酸铵(加至80%)共沉淀`,Sephadex G50分级分离和脱盐,Mono-S阳离子交换，Mono-Q阴离子交换，Sephadex G-200脱盐分离,超滤浓缩。6.SA122m5 活性测定BioCORE 100 生物传感器测定亲和力，SA122m5 与 Biotin 的 Kd = 1.2X 1(T14M/L，与2-亚氨基生物素的Kd = 2.2X 1(T8M/L。SA122m5 的比活性(Specific Activity)达到 15U/mg (wtSA 的比活性为 13 16U/mg, IU 结合 Biotin lM-g)0SA122m5与生物素结合的半寿期为11小时(据报道，wtSA为6.6小时，单体SA(Monomeric SA)为 3 分钟)。本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明 的保护范围之内。〈110〉盘古基因科技(苏州)有限公司〈120〉一种链霉亲和素突变体及其制备方法〈160〉 10
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<211>381
<212>DNA
〈213〉链霉亲和素127个核心氨基酸<400>1
gcagaagcgg gcattaccgg tacctggtat aaccagctgg gcagcacgtt cattgtgact 60gcaggcgcgg atggtgcgct gaccggcacc tatgaaagcg cggtgggcaa cgcggaaagc 120cgttatgtgc tgaccggccg ttacgatagc gcaccggcga ccgatggtag cggcaccgcg 180ctgggctgga ccgtggcgtg gaagaacaac tatcgtaacg cgcatagcgc gaccacctgg 240agcggccagt atgttggcgg tgcggaagcg cgcatcaaca cccagtggct gctgaccagc 300ggcaccaccg aagcgaacgc gtggaagagc accctggtgg gccatgatac ctttaccaaa 360gtgaaaccga gcgcggcgag c381
<210>2
<211>127
<212>PRT
〈213〉链霉亲和素127个核心氨基酸<400>2
Ala Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser151015
Thr Phe He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr202530
Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr354045
Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala505560
Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His657075
Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala808590
Arg He Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala 95100105
Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys
权利要求
1.一种链霉亲和素突变体，其特征在于:所述链霉亲和素突变体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:7所示。
2.根据权利要求1所述的一种链霉亲和素突变体，其特征在于:所述链霉亲和素突变体包含5个氨基酸的突变，分别为E14D、T42Y、Y43T、S52G、R53D。
3.一种基于权利要求1所述的链霉亲和素突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤: O已知的具有159个氨基酸的链霉亲和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQID N0:8所示，取其中的121个氨基酸(13 133)作为合成对象，并且引入两个氨基酸的突变:S52G、R53D，得到的121个氨基酸的突变序列如序列表中的SEQ ID N0:9所示； 2)将所述121个氨基酸的突变序列经DNAWorks逆翻译成核苷酸序列，所述核苷酸序列的密码子经DNAWorks优化，并且添加了起始密码ATG和终止密码TAA ； 3)添加了起始密码ATG和终止密码TAA的所述核苷酸序列通过PCR合成人工DNA序列，所述人工DNA序列命名为SA122m2，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示； 4)通过随机突变PCR改造SA122m2，获取其它氨基酸改变对其结合生物素功能的影响，从随机突变产生的DNA文库，选取了 I株突变体，命名为SA122m5，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，包含了 5个密码子突变，产生了 5个天然氨基酸的改变，分别为E14D、T42Y、Y43T、S52G、R53D ； 5)构建原核表达工程载体pET28a-SA122m5； 6)构建原核表达工 程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA122m5 ； 7)原核表达工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA122m5的扩增、诱导表达； 8)SA122m5的提取与纯化； 9)SA122m5的生物活性测定。
全文摘要
本发明揭示了一种链霉亲和素突变体及其制备方法，所述链霉亲和素突变体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:6所示，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:7所示，包含5个氨基酸的突变，分别为E14D、T42Y、Y43T、S52G、R53D。本发明提供了一种链霉亲和素突变体及其制备方法，链霉亲和素突变体SA122m5提高了对生物素衍生物(如2-亚氨基生物素)的亲和力，有利于生物素化产物的检测；延长了与生物素结合的半寿期，有利于需要长时间观察的实验与影像研究。
文档编号C07K14/36GK103172713SQ20131006897
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者李万波, 陕婧婧, 黄勇, 管春爱, 贾翔 申请人:盘古基因科技(苏州)有限公司