专利名称：一种罗丹明b人工抗原及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种罗丹明B人工抗原及其制备方法和应用。背景技术：
罗丹明B (Rhodamine B)俗称玫瑰红，花粉红，是一种邻苯二酚类的碱性荧光染料，由于其具有很好的荧光性质，目前已广泛应用于环境监测、有色玻璃、特色烟花爆竹和生物学染色等领域。罗丹明B的结构如图1所示。近些年来，实验研究表明:罗丹明B可以明显减少人纤维原细胞的数量，抑制其增殖；同时，它还可以抑制人血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖。另外，经动物试验发现:罗丹明B能引起皮下组织生肉瘤，具有潜在的致癌和致突变能力。欧美等国家和地区从1993年起明令禁止其在食品加工中使用。我国卫生部也在2008年将其列入首批食品中可能违法添加的非食用物质名单之中。但是由于其价廉易得、色泽鲜亮持久等特点，仍然有一些不法食品生产、加工商违规、违法使用罗丹明染料。这一方面给国家的食品安全带来了很大的隐患；另一方面，也给消费者的身心健康带来严重威胁。目前，国内外对食品中罗丹明B的常用检测方法是高效液相色谱法(HPLC)、高效液相-质谱联用法(HPLC-MS)。但是由于色谱法的样品前处理复杂繁琐，需要精密昂贵的检测器和质谱等仪器设备，同时还要有专门的技术人员操作仪器，很难达到快速、便捷的现场检测要求，因此限制了其在许多检测机构尤其是基层检测部门的大规模推广使用。酶联免疫检测分析(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)由于具有特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点，近些年来备受人们的关注。免疫分析是以抗体作为生物检测器的分析技术，而罗丹明B作为小分子物质，分子量为479，是半抗原，本身不具有诱导产生抗体的能力，不能直接通过它免疫动物而得到检测所必须的抗体，因此，合成罗丹明B的人工抗原便成为建立其ELISA分析方法的首要步骤和关键所在。从罗丹明B分子结构中可以看出:它本身含有羧基，因此不需要另行引入活性基团。本发明将罗丹明B分子直接以碳二亚胺为偶联剂，在N-羟基琥珀酰亚胺
存在的情况下与载体蛋白偶联从而得到罗丹明B的人工抗原。
发明内容
本发明要解决的技术问题是:
本发明主要是利用罗丹明B分子结构本身含有的活性基团一羧基，为罗丹明B提供了一种人工抗原及其制备方法和应用。本发明的技术方案是:
本发明所述的罗丹明B人工抗原为载体蛋白直接与罗丹明B分子中的羧基通过脱水缩合形成酰胺键而得，其结构如图1。将罗丹明B以碳二亚胺为偶联剂，在N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下与载体蛋白偶联从而得到罗丹明B的人工抗原，其结构如图2。
罗丹明B人工抗原的合成:1、将罗丹明B96mg、N, N-二环己基碳二亚胺41.2mg、N_轻基琥拍酰亚胺46mg混合,溶解于400ul经无水处理的N，N-二甲基甲酰胺中，室温密封搅拌过夜；
2、将混合液IOOOrpm,离心5分钟，后吸取上层反应液,将其缓慢逐滴加入到冰浴的IOuM的BSA溶液中，4°C搅拌反应过夜；
3、将反应液转移至透析袋中，以PBS为透析液4°C透析7天，每12小时换一次透析液，以除去未反应的罗丹明B等杂质；
4、透析结束后，将反应液离心，7000rpm，离心5分钟，得罗丹明B的人工抗原。罗丹明B人工抗原的合成路线见图3。本发明与已有技术相比其有益效果是:
目前所报道的罗丹明B人工抗原的制备方法中，主要是通过对罗丹明B的类似物一罗丹明123中的活性基团氨基进行修饰偶联而来。虽然罗丹明123与罗丹明B的结构相似，都具有苯环部分和羧基部分，但是与罗丹明B相比，罗丹明123结构中苯环上所连接的是氨基，而不是两个乙基，这样就导致了其空间结构在这一区域有着很大的不同；另一方面，由于罗丹明123结构中带有两个氨基而直接引起了两种物质带电情况具有很大的区另IJ，这两方面的原因可能直接导致抗原决定簇的改变和抗原递呈细胞对罗丹明B的识别和递呈能力，最终导致产生的抗体具有很大的差异。本发明的优势在于我们根据罗丹明B自身带有活性基团这一特点 ，不改变它的结构，直接对其进行与载体的偶联反应，从而最大程度上保持了结构的稳定性，因此将其免疫动物后有助于提高抗体的质量。本发明所述罗丹明B人工抗原可用于酶联免疫检测分析。四
图1罗丹明B结构式
图2罗丹明B人工抗原结构式
图3罗丹明B人工抗原的合成路线图
图4A罗丹明B与载体蛋白BSA偶联物的紫外扫描图谱
图4B罗丹明B与载体蛋白OVA偶联物的紫外扫描图谱
五具体实施例方式 实施例1罗丹明B-BSA偶联物
1、将罗丹明B96mg、N, N-二环己基碳二亚胺41.2mg、N_轻基琥拍酰亚胺46mg混合,溶解于400ul经无水处理的N，N-二甲基甲酰胺中，室温密封搅拌过夜；
2、将混合液IOOOrpm,离心5分钟，后吸取上层反应液,将其缓慢逐滴加入到冰浴的IOuM的BSA溶液中，4°C搅拌反应过夜；
3、将反应液转移至透析袋中，以PBS为透析液4°C透析7天，每12小时换一次透析液，以除去未反应的罗丹明B等杂质；
4、透析结束后，将反应液离心，7000rpm，离心5分钟，得罗丹明B的人工抗原。实施例2罗丹明B-OVA偶联物
1、将罗丹明B96mg、N, N-二环己基碳二亚胺41.2mg、N_轻基琥拍酰亚胺46mg混合,溶解于400ul经无水处理的N，N-二甲基甲酰胺中，室温密封搅拌过夜；
2、将混合液IOOOrpm,离心5分钟,后吸取上层反应液,将其缓慢逐滴加入到已经冰浴的IOuM的OVA溶液中，4°C搅拌反应过夜；3、将反应液转移至透析袋中，以PBS为透析液4°C透析7天，每12小时换一次透析液，以除去未反应的罗丹明B等杂质；
4、透析结束后，将反应液离心，7000rpm，离心5分钟，得罗丹明B的人工抗原。实施例3罗丹明B-BSA和罗丹明B-OVA偶联物的鉴定
首先，采用紫外分光光度扫描的方法分别对罗丹明B-BSA (图4A)和罗丹明B-OVA (图4B)偶联物进行鉴定，根据其特征吸收峰的变化及其峰形鉴定是否偶联成功。罗丹明B标准品在560nm处有一强的吸收峰，而BSA和OVA的最大吸收峰在280nm左右，但是偶联物在这两个波长下均有吸收，这是由于两种物质偶联后而引起的吸收峰叠加，表明两者偶联成功，计算得 出偶联比约为1:6。
权利要求
1.一种罗丹明B的人工抗原，其结构为:
2.根据权利要求1所述一种罗丹明B人工抗原的合成方法，其特征在于合成步骤为: (1)将罗丹明B96mg、N,N- 二环己基碳二亚胺41.2mg、N-轻基琥拍酰亚胺46mg混合，溶解于400ul无水N，N- 二甲基甲酰胺中，室温密封搅拌过夜； (2)将混合液离心，IOOOrpm,5分钟，然后吸取上层反应液，将其缓慢逐滴加入到冰浴的IOuM的BSA溶液中，4°C搅拌反应过夜； (3)将反应液转移至透析袋中，以PBS为透析液4°C透析7天，每12小时换一次透析液，以除去未反应的罗丹明B杂质； (4)透析结束后，将反应液离心，7000rpm，离心5分钟，得罗丹明B的人工抗原。
3.根据权利要求2所述一种罗丹明B人工抗原合成方法，其特征是偶联剂为N，N-二环己基碳二亚胺或1-乙基-3-3 (3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺或N，N- 二异丙基碳二亚胺(DIC)0
4.根据权利要求2所述一种罗丹明B人工抗原合成方法，其特征在于载体蛋白为牛血清白蛋白 Bovine serum albumin, BSA 或卵清蛋白 Ovalbumin, OVA。
5.权利要求1所述罗丹明B人工抗原在酶联免疫检测分析中的应用。
全文摘要
本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种罗丹明B人工抗原及其制备方法和应用。由于罗丹明B分子结构本身含有羧基，因此不需要另行引入活性基团。本发明将罗丹明B分子直接以碳二亚胺为偶联剂，在N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下与载体蛋白偶联从而得到罗丹明B的人工抗原。由于在最大程度上保持了其结构的稳定性，因此将其免疫动物后有助于提高抗体的质量。整个方法简单易行，操作简便，人工抗原得率和纯度高。
文档编号C07K1/107GK103145830SQ20131007271
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者沈萍萍, 徐加发 申请人:南京大学