减毒肠毒素c2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：减毒肠毒素c2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体的说是一种减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
超抗原(superantigen, SAg)是一组由细菌或病毒编码的，并在极低浓度下对人体或其他哺乳动物T淋巴细胞产生极强免疫刺激活性的蛋白质分子。不像传统的抗原，超抗原不需要抗原递呈细胞的加工处理，在抗原递呈细胞外侧的抗原结合区与MHC II (组织相容性复合物)分子和T细胞V β区结合形成复合物，从而激发大量的T淋巴细胞增殖，进而导致在体外或体内释放产生大量的细胞因子和其它效应分子。正因为超级抗原存在这种特殊的生物活性和作用机理，所以致使其可以作为一种临床上的免疫调节剂和抗肿瘤药物，用于表达MHC II分子的肿瘤治疗。金黄色葡萄球菌肠毒素C2 (Staphylococcal enterotoxin C2, SEC2)是一类具有代表性的微生物外毒素。由于其极强的T细胞激活功能，成为一类典型微生物超抗原，近年来受到人们的广泛关注。但是，由于肠毒素C2超抗原的作用必须依赖于与免疫系统中的MHC II分子相结合，这必然会导致其在人体中可能与来自正常组织或细胞的MHC II分子的结合，从而对正常细胞也产生一定的毒性作用；此外，由于金黄色葡萄球菌肠毒素是一种细菌外毒素，因此在对人体会产生一定的毒素综合症(TSS)和食物中毒症状，并在临床上表现为呕吐、腹泻、以及致热等症状，因此限制了其临床应用和治疗可得效果。

因此,为减少肠毒素C2作为细菌外毒素所带来的边际效应和对人体的毒副作用，进而提高肠毒素C2在未来抗肿瘤方面的开发潜力，本发明通过基因定点突变技术对SEC2中与毒性相关的位点进行突变，从而达到减毒的目的。

发明内容
本发明目的在于提供一种减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用。为实现上述目的，本发明的技术方案如下:减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白:所述减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白具有序列表SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11、SEQID NO: 13或SEQ ID NO: 15中碱基序列。所述减毒肠毒素C2超抗原突变编码蛋白具有序列表SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:16中氨基酸序列。减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2 (C93A) -R: 5’ -GATGAAAAATATG CGTTTACATAG-3’ ; sec2 (C93A) _F: 5’ -ATGTAAACGCATATTTTTCATCCAA-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTT GTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO:1中碱基序列sec2(C93A)突变基因；以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 ’和 sec2(D83A)-R:5 ’-TCCATACACAGCA ACTACTTCATCT-3 ’；sec2(D83A)-F:5 ’-GATGAAGTAGTTGCTGTGTATGGAT CAAAT-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 3中碱基序列sec2(D83A)突变基因；以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2(H47A)-R:5，-GTTATAAATTAA ATCTGCTGCCAAA-3，；sec2(H47A)-F:5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATA AC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 5中碱基序列Sec2(H47A)突变基因；以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F: 5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和 sec2(H118A)-R:5’-GGTTTCCTTCAGC TTTTGTTATTCC3’；sec2(H118A)_F:5’_GGAATAACAAAAGCTGAAGGAAAC CAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 7中碱基序列sec2(H118A)突变基因；以具有序列表SEQ ID N0:1中碱基序列sec2(C93A)突变基因为模板，采用引物对 sec2-F:5，-CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2 (C93A/C110A)-R:5，-CCTCCATACATAGCAGTTTTACCAC-3’ ； sec2 (C93A/C110A)_F:5，-TGGTAAAACTGCTA TGTATGGAGGA-3，和sec2-R:5’ -TCGCTCGAGT TATCCATTCTTTGTTG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2_R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ IDNO: 9中碱基序列sec2 (C93A/C110A)突变基因;以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F: 5’CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2(H122A)-R:5’-CCATTATCAAAGGCGTT TCCTTC-3’ ;sec2(H122A)_F:5’-GGAAACgCCTTTGATAATGGGAAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 11中碱基序列Sec2(H122A)突变 基因；
以SEQ ID N0:7中碱基序列Sec2(H118A)突变基因为模板，采用引物对sec2-F:5’ -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2 (H118A/H122A)-R: 5’ -CCATTATCAAAGGCGTTTCCTTC-3，；sec2(H118A/H122A)-F:5，-GGAAACGCCTTTGATAATGGGAAC-3J 和 sec2_R:5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 13中碱基序列sec2 (H118A/H122A)突变基因；以序列表SEQ ID NO: 13中碱基序列sec2 (H118A/H122A)突变基因为模板，采用引物对 sec2-F:5，-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2 (H47A)-R: 5，-GTTATAAATTAAATCT GCTGCCAAA-3，； sec2 (H47A) -F: 5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATAAC-3，和 sec2_R: 5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2_F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 15中碱基序列sec2 (H47A/H118A/H122A)突变基因；而后将具有序列表SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID N0:13和SEQ ID NO: 15中碱基序列中的碱基序列分别克隆入表达载体pET-28a，以大肠杆菌BL21 (DE3)为宿主菌，分别构建成异源表达减毒肠毒素C2突变蛋白的基因工程菌，经诱导后在培养基中异源表达得具有序列表SEQ ID NO:2, SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO: 16中氨基酸序列中的碱基序列的减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白。所述的诱导方法 是通过以IPTG为诱导物进行诱导表达。所述将所得蛋白分离纯化的纯蛋白。所述离纯化方法为Ni亲和层析法，所用的介质为琼脂糖凝胶树脂。减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白的应用:具有序列表SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 15中碱基序列的减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白可作为抗肿瘤免疫的药物或作为防止催吐、腹泻的药物。本发明所具有如下优点:1.本发明为人工构建的系列编码超抗原突变蛋白的核苷酸序列，获知其基因全序列的组成。2.本发明利用基因工程技术，突变构建了一系列编码减毒超抗原突变蛋白的核苷酸基因，并在大肠杆菌中表达，表达获得的一系列超抗原突变蛋白经检验具有超抗原活性(如图3和图4所示)。3.本发明构建并获得的系列超抗原突变蛋白由于显著降低了其催吐、腹泻活性，因此更适合用于将来的临床免疫治疗；此外突变位点还涉及到MHC II结合区，因此降低了其对人体表达MHC II分子的正常组织的毒性，从而降低了其对人体的毒副作用。4.本发明提供的表达及制备大量减毒超抗原肠毒素C2突变蛋白的方法能使该系列蛋白达到高效表达及纯化，能满足工业化生产的需要。5.本发明通过基因工程技术对野生型SEC2进行定点改造，并结合细胞生物学实验和体内动物试验筛选获得具有超抗原活性，并且毒性作用降低的肠毒素C2突变蛋白，使其有可能开发为一种新的临床抗肿瘤药物。


图1为本发明野生型SEC2和八种肠毒素C2突变蛋白基因的PCR产物核酸电泳图谱(其中M代表DL2000marker，1、2、3、4、5、6、7、8、9依次代表野生型SEC2基因和序列表SEQID NO: 1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:1USEQ IDNO: 13、SEQ ID NO: 15八种突变基因的PCR产物)。图2为本发明野生型SEC2和八种突变蛋白基因编码蛋白纯品的电泳图谱(其中M代表蛋白marker, 1、2、3、4、5、6、7、8、9依次代表野生型SEC2和具有序列表SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:16序列的八种编码蛋白)。图3为本发明八种超抗原SEC2突变蛋白基因编码蛋白的超抗原活性检测实验结果图(其中图3.A为与二硫环相关的两种突变蛋白SEC2(C93A)和SEC2 (C93A/C110A)与野生型SEC2刺激小鼠T淋巴细胞结果比较图(其中横坐标为本发明活性检测中超抗原突变蛋白的检测剂量，纵坐标为增值指数)；其中图3.B为与MHC II分子结合相关的六种突变蛋白 SEC2(H47A)、SEC2(D83A)、SEC2 (H118A)、SEC2 (H122A)、SEC2 (H118A/H122A)、SEC2(H47A/H118A/H122A)与野生型SEC2刺激小鼠T淋巴细胞结果比较图(其中横坐标为本发明活性检测中超抗原突变蛋白的检测剂量，纵坐标为增值指数。))。图4为本发明八种超抗原SEC2突变蛋白基因编码蛋白的抑瘤活性检测结果图。(其中纵坐标为阴性对照牛血清白 蛋白(BSA)、系列突变蛋白和阳性对照SEC2 ;横坐标为抑
瘤率。)。图5A和B为本发明超抗原SEC2突变蛋白基因编码蛋白的抑瘤活性检测结果图。
具体实施例方式实施例1具有序列表SEQID NO: USEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15中碱基序列的八种减毒超抗原突变蛋白基因序列和具有序列表 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 16氨基酸序列的八种减毒超抗原突变蛋白基(参见序列表):具有序列表SEQ ID NO:1碱基序列的超抗原突变蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt051tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt15ltataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga201gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg251tgtatggatc aaattactat gtaaacgcct atttttcatc caaagataat301gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa35lacatgaagga aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa401gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat45laagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt
501aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag551gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta651caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.1的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:717碱基对*类型:核酸*链型:双链*拓扑结构:线性(b)分子类型:cDNA(C)假设:否(d)反义:否(e)最初来源:金 黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID N0:3碱基序列的超抗原突变蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt051tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt151tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga201gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgctg251tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat301gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa351acatgaagga aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa401gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat45laagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt501aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag551gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta651caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.3的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:717碱基对*类型:核酸*链型:双链*拓扑结构:线性(b)分子类型:cDNA(C)假设:否
(d)反义:否(e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO:5碱基序列的超抗原突变蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctacgccagatgag ttgcacaaatcaagtgagtt051tactggtacg atgggtaatatgaaatattt atatgatgatcattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtctgtagataaat ttttggcagcagatttaatt151tataacatta gtgataaaaaactaaaaaat tatgacaaagtgaaaacaga201gttattaaat gaagatttagcaaagaagta caaagatgaagtagttgatg251tgtatggatc aaattactatgtaaactgct atttttcatccaaagataat301gtaggtaaag ttacaggtggtaaaacttgt atgtatggaggaataacaaa351acatgaagga aaccactttgataatgggaa cttacaaaatgtacttataa401gagtttatga aaataaaagaaacacaattt cttttgaagtgcaaactgat
45laagaaaagtg taacagctcaagaactagac ataaaagctaggaatttttt
501aattaataaa aaaaatttgtatgagtttaa cagttcaccatatgaaacag551gatatataaa atttattgaaaataacggca atactttttggtatgatatg601atgcctgcac caggcgataagtttgaccaa tctaaatatttaatgatgta651caacgacaat aaaacggttgattctaaaag tgtgaagatagaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.5的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:717碱基对*类型:核酸*链型:双链*拓扑结构:线性(b)分子类型:cDNA(C)假设:否(d)反义:否(e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID N0:7碱基序列的超抗原突变蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctacgccagatgag ttgcacaaatcaagtgagtt051tactggtacg atgggtaatatgaaatattt atatgatgatcattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtctgtagataaat ttttggcacatgatttaatt151tataacatta gtgataaaaaactaaaaaat tatgacaaagtgaaaacaga201gttattaaat gaagatttagcaaagaagta caaagatgaagtagttgatg251tgtatggatc aaattactatgtaaactgct atttttcatccaaagataat301gtaggtaaag ttacaggtggtaaaacttgt atgtatggaggaataacaaa351agctgaagga aaccactttgataatgggaa cttacaaaatgtacttataa401gagtttatga aaataaaagaaacacaattt cttttgaagtgcaaactgat45laagaaaagtg taacagctcaagaactagac ataaaagctaggaatttttt
501aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag551gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta651caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.7的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:717碱基对*类型:核酸*链型:双链*拓扑结构:线性(b)分子类型:cDNA(C)假设:否(d)反义:否(e)最初来源 :金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID N0:9碱基序列的超抗原突变蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt051tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt151tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga201gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg251tgtatggatc aaattactat gtaaacgcct atttttcatc caaagataat301gtaggtaaag ttacaggtgg taaaactgct atgtatggag gaataacaaa351acatgaagga aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa401gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat45laagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt501aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag551gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta651caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.9的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:717碱基对*类型:核酸*链型:双链*拓扑结构:线性(b)分子类型:cDNA(C)假设:否
(d)反义:否(e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO: 11碱基序列的超抗原突变蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctacgccagatgag ttgcacaaatcaagtgagtt051tactggtacg atgggtaatatgaaatattt atatgatgatcattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtctgtagataaat ttttggcacatgatttaatt151tataacatta gtgataaaaaactaaaaaat tatgacaaagtgaaaacaga201gttattaaat gaagatttagcaaagaagta caaagatgaagtagttgatg251tgtatggatc aaattactatgtaaactgct atttttcatccaaagataat301gtaggtaa ag ttacaggtggtaaaacttgt atgtatggaggaataacaaa351acatgaagga aacgcctttgataatgggaa cttacaaaatgtacttataa401gagtttatga aaataaaagaaacacaattt cttttgaagtgcaaactgat45laagaaaagtg taacagctcaagaactagac ataaaagctaggaatttttt501aattaataaa aaaaatttgtatgagtttaa cagttcaccatatgaaacag551gatatataaa atttattgaaaataacggca atactttttggtatgatatg601atgcctgcac caggcgataagtttgaccaa tctaaatatttaatgatgta651caacgacaat aaaacggttgattctaaaag tgtgaagatagaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.11的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:717碱基对*类型:核酸*链型:双链*拓扑结构:线性(b)分子类型:cDNA(C)假设:否(d)反义:否(e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO: 13碱基序列的超抗原突变蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctacgccagatgag ttgcacaaatcaagtgagtt051tactggtacg atgggtaatatgaaatattt atatgatgatcattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtctgtagataaat ttttggcacatgatttaatt151tataacatta gtgataaaaaactaaaaaat tatgacaaagtgaaaacaga201gttattaaat gaagatttagcaaagaagta caaagatgaagtagttgatg251tgtatggatc aaattactatgtaaactgct atttttcatccaaagataat301gtaggtaaag ttacaggtggtaaaacttgt atgtatggaggaataacaaa351agctgaagga aacgcctttgataatgggaa cttacaaaatgtacttataa401gagtttatga aaataaaagaaacacaattt cttttgaagtgcaaactgat45laagaaaagtg taacagctcaagaactagac ataaaagctaggaatttttt
501aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag551gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta651caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.13的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:717碱基对*类型:核酸*链型:双链*拓扑结构:线性(b)分子类型:cDNA(C)假设:否Cd)反义:否(e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO: 15碱基序列的超抗原突变蛋白基因:OOlgagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt051tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtatIOlcagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcagc agatttaatt151tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga201gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg251tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat301gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa351agctgaagga aacgcctttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa401gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat
45laagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt501aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag551gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta651caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc70lttacaacaaa gaatggaSEQ ID N0.15的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:717碱基对*类型:核酸*链型:双链*拓扑结构:线性(b)分子类型:cDNA(C)假设:否
(d)反义:否(e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:
10、SEQID NO:12, SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16中氨基酸序列的八种减毒超抗原突变蛋白基因编码蛋白:
具有序列表SEQ ID NO:2氨基酸序列的超抗原突变蛋白基因编码蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIahdli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vnayfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkheg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.2的信息(参见序列表)(a)序列特征:
*长度:239个氨基酸*类型:肽链*链型:单链(b)分子类型:成熟肽链(C)假设:否(d)反义:否(e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID N0:4氨基酸序列的超抗原突变蛋白基因编码蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIahdli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvavygsnyy vncyfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkheg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.4的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:239个氨基酸*类型:肽链*链型:单链(b)分子类型:成熟肽链(C)假设:否(d)反义:否(e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID N0:6氨基酸序列的超抗原突变蛋白基因编码蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIaadli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkheg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd
151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.6的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:239个氨基酸*类型:肽链*链型:单链(b)分子类型:成熟肽链(C)假设:否(d)反义:否(e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID N0:8氨基酸序列的超抗原突变蛋白基因编码蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIahdli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkaeg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.8的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:239个氨基酸*类型:肽链*链型:单链(b)分子类型:成熟肽链(C)假设:否(d)反义:否具有序列表SEQ ID NO: 10氨基酸序列的超抗原突变蛋白基因编码蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIahdli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vnayfsskdnIOlvgkvtggkta myggitkheg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.10的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:239个氨基酸*类型:肽链*链型:单链(b)分子类型:成熟肽链(C)假设:否(d)反义 :否
(e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO: 12氨基酸序列的超抗原突变蛋白基因编码蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIahdli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkheg nafdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.12的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:239个氨基酸*类型:肽链*链型:单链(b)分子类型:成熟肽链(C)假设:否(d)反义:否 (e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO: 14氨基酸序列的超抗原突变蛋白基因编码蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIahdli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkaeg nafdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.14的信息(参见序列表)(a)序列特征:*长度:239个氨基酸
*类型:肽链*链型:单链(b)分子类型:成熟肽链(C)假设:否(d)反义:否(e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO: 16氨基酸序列的超抗原突变蛋白基因编码蛋白:OOlesqpdptpde lhksseftgt mgnmkylydd hyvsatkvms vdkfIaadli051ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdnIOlvgkvtggktc myggitkaeg nafdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd151kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm20lmpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID N0.16的信息(参见序列表)(a)序列特征:
*长度:239个氨基酸*类型:肽链*链型:单链(b)分子类型:成熟肽链(C)假设:否(d)反义:否(e)最初来源:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)实施例2减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法:①金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取接种金黄色葡萄球菌单菌落于5ml液体LB培养基中，37°C摇床过夜培养，取1.5ml的培养物离心收集菌体 。提取金黄色葡萄球菌基因组DNA(基因组DNA提取操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John ffiley&Sons出版社1995年第三版P39-40)。②PCR引物设计及反应条件:分别设计合成PCR引物用来扩增八种超抗原突变蛋白基因片断，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板；以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2_F: 5’_CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2 (C93A) -R: 5’ -GATGAAAAATATG CGTTTACATAG-3’ ; sec2 (C93A) _F: 5’ -ATGTAAACGCATATTTTTCATCCAA-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTT GTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO:1中碱基序列sec2(C93A)突变基因；以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F: 5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2 (D83A)-R:5，-TCCATACACAGCA ACTACTTCATCT-3，；sec2(D83A)-F:5，-GATGAAGTAGTTGCTGTGTATGGAT CAAAT-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 3中碱基序列sec2(D83A)突变基因；以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2(H47A)-R:5，-GTTATAAATTAA ATCTGCTGCCAAA-3，；sec2(H47A)-F:5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATA AC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 5中碱基序列Sec2(H47A)突变基因；以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2_F: 5’_CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和 sec2(H118A)-R:5’-GGTTTCCTTCAGC TTTTGTTATTCC3’；sec2(H118A)_F:5’_GGAATAACAAAAGCTGAAGGAAAC CAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 7中碱基序列sec2(H118A)突变基因；以具有序列表SEQ ID NO:1中碱基序列sec2 (C93A)突变基因为模板，采用引物对 sec2-F:5， -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2(C93A/C110A)-R:5， -CCTCCATACATAGCAGTTTTACCAC-3’ ； sec2 (C93A/C110A)-F:5，-TGGTAAAACTGCTA TGTATGGAGGA-3，和sec2-R:5’ -TCGCTCGAGT TATCCATTCTTTGTTG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2_R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID N0:9中碱基序列Sec2(C93A/C110A)突变基因；以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2_F: 5’CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2(H122A)-R:5’-CCATTATCAAAGGCGTT TCCTTC-3’ ;sec2(H122A)_F:5’-GGAAACgCCTTTGATAATGGGAAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 11中碱基序列Sec2(H122A)突变基因；以SEQ ID NO: 7中碱基序列sec2 (H118A)突变基因为模板，采用引物对sec2-F:5’ -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2 (H118A/H122A)-R: 5’ -CCATTATCAAAGGCGTTTCCTTC-3， ；sec2(H118A/H122A)-F:5， -GGAAACGCCTTTGATAATGGGAAC-3，和 sec2_R:5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 13中碱基序列sec2 (H118A/H122A)突变基因；以序列表SEQ ID NO: 13中碱基序列sec2 (H118A/H122A)突变基因为模板，采用引物对 sec2-F:5 ，-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2 (H47A)-R: 5，-GTTATAAATTAAATCT GCTGCCAAA-3，； sec2 (H47A) -F: 5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATAAC-3，和 sec2_R: 5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2_F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 15中碱基序列sec2 (H47A/H118A/H122A)突变基因；各基因片断的PCR反应体系均为:10XPfu DNA聚合酶反应缓冲液10 μ 1、dNTP8uL、上下游引物各20pmol、模板金黄色葡萄球菌基因组DNA50ng、Pfu DNA聚合酶2U，无菌超纯水补齐体积至loo μ I。各基因片断的PCR反应条件均为:第一阶段95°C，5分钟；第二阶段94°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，90 秒；共 30 个循环；第三阶段72 °C，10分钟；③SEC2八种超抗原突变蛋白基因的鉴定:各片断PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析并分离(参见图1，如图所示，经PCR扩增和定点突变，获得了特异性的八种突变蛋白基因，经电泳检测其大小与野生SEC2基因大小一致。进一步的序列测定确认突变基因构建成功，可用于下一步表达载体的构建。)，分别切下大小为717bp的基因片段，按博大泰克生物技术公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；回收产物分别与PGEM-T克隆载体连接，构建成八种减毒超抗原突变蛋白基因克隆载体PGEM-T-SEC2-SEQ ID NO: 1、PGEM-T-SEC2-SEQ ID NO: 3、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 5、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 7、PGEM-T-SEC2-SEQ ID N0:9、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 11、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 13、PGEM-T-SEC2-SEQ ID NO: 15。连接反应按Promega公司产品pGEM_T试剂盒使用说明书。连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，(转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.Ε.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John ffiley&Sons出版社1995年第三版P39-40),筛选阳性克隆并以Sanger双脱氧末端终止法测定DNA序列。超抗原突变蛋白的表达I)八种超抗原肠毒素C2突变蛋白表达载体的构建:分别将基因克隆载体PGEM-T-SEC2-SEQ ID NO: 1、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 3、pGEM_T-SEC2_SEQ ID N0:5、PGEM-T-SEC2-SEQ ID NO:7、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO:9、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 11、PGEM-T-SEC2-SEQ ID NO: 13、pGEM_T-SEC2_SEQ ID NO: 15 质粒 DNA 以 EcoR1、XhoI 双酶切，胶回收试剂盒分别回收序列表SEQ ID NO: K SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15 中的八种肠毒素 C2 突变蛋白基因。以T4DNA连接酶分别连接入经同样双酶切的pET-28a表达载体，构建成表达载体pET-28a-SEC2-SEQ ID NO: 1、pET_28a-SEC2_SEQ ID NO:3、pET_28a-SEC2_SEQ ID NO:5、pET-28a-SEC2-SEQ ID NO:7、pET_28a-SEC2_SEQ ID N0:9、pET_28a-SEC2_SEQ ID NO: 11、pET-28a-SEC2-SEQ ID NO: 13、pET_28a-SEC2_SEQ ID NO: 15。转化 E.coli BL21(DE3)感受态细胞，经Sanger双脱氧末端终止法测序鉴定正确重组克隆。2)超抗原突变蛋白 的诱导表达和纯化:分别接种转化了各表达载体质粒的BL21(DE3)单菌落于含50μ g/ml卡那霉素的液体LB培养基中，过夜活化培养，以1% (V/V)接种量转接下一级，37°C摇床培养至OD6tltl为0.5，加入终浓度1.0mmoI/L的IPTG (购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，30°C诱导表达4小时。分别离心收集菌体，并将各收集的菌体重悬于1/5体积的平衡缓冲液(IOmMTirs-HCl, 0.5M NaCl, 20mM咪唑，pH7.9)，分别采用Ni亲和层析柱对各目的产物进行纯化，即获得具有序列表SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16中氨基酸序列的八种肠毒素C2减毒突变蛋白；纯化时以0.5ml/min速度上样于预先平衡好的Ni亲和层析柱；以含40mM咪唑的平衡缓冲液洗涤10个柱体积，洗去非特异性结合的杂蛋白；最后以洗脱缓冲液(20mMTirs-HCl, 0.5M NaCl,250mM咪唑，pH7.9)洗脱下目的产物，并对洗脱产物经透析法除盐浓缩。通过SDS-PAGE电泳鉴定蛋白大小及纯度(参见图2，如图所示，大肠杆菌BL21(DE3)重组表达菌株经过IPTG诱导，并经N1-亲和层析柱纯化后，获得了高纯度的突变蛋白，能够满足进一步的实验需要。)。实施例3超抗原活性检测取SPF级纯系小鼠Balb/c，通过颈椎处死后在无菌条件下取其脾脏，轻轻压碎后过200目筛网。然后将过筛网后的细胞悬液在1000rpm/min转速下离心5min收集细胞沉淀，用5mL红细胞裂解液重悬细胞，静置5min后于1000rpm/min离心5min。再以不含血清的1640培养基(购自Gibco公司)清洗细胞1-2次，最后用含10%小牛血清的RPM1-1640培养液(购自Gibco公司)调节细胞浓度，以8X IO5Cells/孔加到96孔板中。分别将经纯化的各具有序列表 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6 和 SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 16中氨基酸序列的八种超抗原突变蛋白基因编码蛋白分别以 lng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml 的终浓度加入各孔。以 BSA作为阴性对照，SEC2标准品作为阳性对照，每个浓度设3个复孔。培养72h后，加入25ul/孔的MTT液(购自Sigma公司)。继续培养4h，1500r/min离心5分钟后弃上清培养液，收集细胞，加入浓度为120ul/孔的二甲基亚砜溶液(DMSO)，溶解15min后，酶标仪上以570nm测定各孔的吸光值(参见图3，八种突变蛋白在不同浓度范围均能够有效地刺激小鼠T细胞增殖。除SEC2(H118A)、SEC2 (H122A)、SEC2 (H118A/H122A)三种突变蛋白刺激能力与野生型SEC2活性接近外，其他五中突变蛋白的T细胞刺激活性均有不同程度的下降，在体外能有效刺激小鼠T淋巴细胞增殖，并呈现一定的剂量依赖性)。本发明所用到小鼠为SPF级BALB/c纯系小鼠，是一种体内外均无寄生虫和特殊病原菌的近交系小鼠，实验结果精度高，可比性好，应激反应均一。实施例4SEC2突变蛋白的抗肿瘤活性检测将小鼠肝癌细胞H印al-6传代培养后用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用含10%FBS的1640培养基稀释成浓度为5X 105cellS/mL的单细胞悬液，然后以2.5X IO4Cells/孔培养在96孔板。将按实施例3中方法分离获得的小鼠脾淋巴细胞以5X 105cells/well加入到上述含有H印al-6细胞的96孔板 中，使效靶比达到20:1。然后将经纯化的各具有序列表SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16中氨基酸序列的八种超抗原突变蛋白基因编码蛋白分别以100、1000、10000ng/mL的终浓度加入各孔。以BSA作为阴性对照，SEC2野生蛋白作为阳性对照，并设肿瘤细胞对照孔、淋巴细胞自然释放孔、空白对照孔及调零孔，每个浓度设3个复孔，按常规条件培养72h，加入20ul/孔的MTT液(购自Sigma公司)，继续培养4h，IOOOr/min离心收集细胞，加入120ul/孔的二甲基亚砜溶液(DMS0)，溶解15min后，酶标仪上以570nm测定各孔的吸光值。肿瘤抑制瘤计算公式如下:100-[(蛋白实验孔吸光值-淋巴细胞自然释放孔吸光值)/ (肿瘤细胞对照孔吸光值-空白对照孔吸光值)]X 100%。实验结果如图4所示。结果显示所有突变蛋白与阴性对照BSA相比均有显著的抗肿瘤活性，但抗肿瘤活性有不同程度的下降。其中SEC2(H118A)、SEC2(H122A)、SEC2(H118A/H122A)三种突变蛋白的抑瘤活性与野生型SEC2接近。实施例5以健康大白兔(体重约2.0-2.5kg)作为热源活性试验模型。试验前每只兔子体温连续保持稳定90分钟，且起始体温不超过38.6to39.5° C的个体方可用于进一步的试验。将经纯化的各具有序列表 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:6 和 SEQ ID N0:8、SEQID NO: 10,SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 16中氨基酸序列的八种超抗原突变蛋白基因编码蛋白分别经0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌后，用无菌PBS溶液分别稀释至10 μ g/ml,以10μ g/kg的剂量分别通过耳缘静脉进行注射。通过热源试验测定仪观察每组兔子体温在4小时以内的变化情况，并计算温度变化差异(Λ Temperature)。以野生SEC2及无菌PBS缓冲液分别作为阳性和阴性对照，每组测试3只兔子。结果如图5.A和B所示，显示本发明突变蛋白的热源活性均有不同程度的降低，其中SEC2(H118A)和SEC2(H122A)两种突变蛋白在保留较高超抗原活性基础上(见实施例3和4)，其致热毒性有显著的降低。因此具有进一步开发低毒性超抗原SEC2的潜力。实施例6SEC2突变蛋白的体内催吐活性研究以健康幼猫(8-10周，约500g)作为催吐活性试验模型。将纯化获得的肠毒素突变蛋白分别经0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌后，用无菌PBS溶液稀释至相同浓度，然后以每只猫2mg的剂量进行腹腔注射，然后观察6小时以内的反应，并记录期催吐及腹泻反应(参见表I)。试验过程中尽量减少对其的干扰。表I为野生型SEC2和八种SEC2点突变蛋白的体内催吐活性试验。如表I所示，与野生型SEC2相比较，八种肠毒素催吐活性和腹泻活性均有显著的下降，本发明构建的突变蛋白毒性有显著的下降。表1.幼猫腹腔注射不同SEC2突变体蛋白催吐活性比较
权利要求
1.一种减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白，其特征在于:所述减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白具有序列表 SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO:1USEQ ID N0:13 或 SEQ ID N0:15 中碱基序列。
2.—种权利要求1所述的减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白，其特征在于:所述减毒肠毒素C2超抗原突变编码蛋白具有序列表SEQ ID N0:8、SEQ IDNO:12,SEQ ID NO: 14或SEQ IDNO: 16中氨基酸序列。
3.一种按权利要求1所述的减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法，其特征在于: 以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3 ’ 和 sec2(HI18A)-R:5 ’-GGTTTCCTTCAGCTTTTGTTATTCC3’;sec2(HI18A)-F:5 ’-GGAATAACAAAAGCTGAAGGAAAC CAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 7中碱基序列Sec2(H118A)突变 基因； 以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’ CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和 sec2 (H122A)-R:5’-CCATTATCAAAGGCGTTTCCTTC-3’;sec2(H122A)-F:5’-GGAAACgCCTTTGATAATGGGAAC-3’ 和 sec2_R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ IDNO: 11中碱基序列sec2(H122A)突变基因； 以SEQ ID N0:7中碱基序列Sec2(H118A)突变基因为模板，采用引物对sec2-F:5’ -CGGAA TTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2 (H118A/H122A)-R: 5’ -CCATTATCAAAGGCGTTTCCTTC-3， ；sec2(H118A/H122A)-F:5， -GGAAACGCCTTTGATAATGGGAAC-3，和 sec2_R:5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ IDNO: 13中碱基序列sec2 (H118A/H122A)突变基因； 以序列表SEQ ID勵:13中碱基序列8况2 011184/!11224)突变基因为模板，采用引物对sec2-F:5，-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 sec2 (H47A)-R: 5，-GTTATAAATTAAATCT GCTGCCAAA-3，; sec2 (H47A) _F: 5，-TTTGGCAGCAGATTTAATTTATAAC-3，和 sec2_R: 5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2_F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ IDNO: 15中碱基序列sec2 (H47A/H118A/H122A)突变基因； 而后将具有序列表 SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 13 和 SEQID NO: 15 中碱基序列中的碱基序列分别克隆入表达载体pET-28a，以大肠杆菌BL21 (DE3)为宿主菌，分别构建成异源表达减毒肠毒素C2突变蛋白的基因工程菌，经诱导后在培养基中异源表达得具有序列表 SEQ ID N0:8、SEQID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16 中氨基酸序列中的碱基序列的减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白。
4.按权利要求3减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法，其特征在于:所述的诱导方法是通过以IPTG为诱导物进行诱导表达。
5.按权利要求3所述的减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法，其特征在于:所述将所得蛋白分离纯化的纯蛋白。
6.按权利要求5所述的减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法，其特征在于:所述离纯化方法为Ni亲和层析法，所用的介质为琼脂糖凝胶树脂。
7.一种按权利要求1所述的减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白的应用，其特征在于:具有序列表 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID N0:13 或 SEQ ID NO: 15 中碱基序列的减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白可 作为抗肿瘤免疫的药物或作为防止催吐、腹泻的药物。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，具体的说是一种减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用。所述减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白具有序列表SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15中碱基序列。以金黄色葡萄球菌DNA为模板，以引物对进行PCR扩增，然后以sec2-F和sec2-R为引物，以获得PCR产物为模板进行PCR扩增得到突变基因，将其克隆入pET-28a，构建减毒肠毒素C2突变蛋白的基因工程菌。本发明所述突变蛋白在保持一定超抗原活性的基础上，其催吐和致热活性较野生型肠毒素C2蛋白有显著的降低，达到了降低毒副作用的目的。
文档编号C07K14/31GK103214562SQ20131007878
公开日2013年7月24日 申请日期2008年9月19日 优先权日2008年9月19日
发明者王小刚, 徐明恺, 张惠文, 刘昌孝, 陈艳, 陈巨余 申请人:沈阳协合集团有限公司