香豆素衍生物及其制备方法以及弹性蛋白酶活性检测方法和检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种香豆素衍生物，该香豆素衍生物如式（1）所示，其中，R1为五氟乙基和七氟丙基中的一种，R2为三氟甲基、甲基、氰基、吡啶环和苯并噻唑环中的一种；本发明还提供了香豆素衍生物在检测弹性蛋白酶的活性中的应用，以及一种弹性蛋白酶的检测方法，和一种弹性蛋白酶的活性的检测试剂盒。本发明提供的香豆素衍生物荧光探针用于与弹性蛋白酶活性检测有关的应用时的灵敏度高、与酶的亲和力高、原子利用率高，并且本发明的香豆素衍生物为非肽类的荧光探针，相比于肽类荧光探针稳定性更高、使用更方便、价格更低廉。式（1）
【专利说明】香豆素衍生物及其制备方法以及弹性蛋白酶活性检测方法和检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种香豆素衍生物及其制备方法和在检测弹性蛋白酶的活性中的应用。
【背景技术】
[0002]现有技术测定弹性蛋白酶(EC号:3.4.21.37)活性的方法主要有三种。第一种是传统的高效液相色谱法(HPLC)，该方法可以直接用于检测中性粒细胞弹性蛋白酶介导的水解纤维蛋白原反应。但是，高效液相色谱法实验过程繁琐、周期长、并且很难做到弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的高通量筛选。第二种是紫外吸收光谱法，该方法操作简单、反应快速，目前已获得广泛的使用，但是这种方法存在以下两方面的缺陷:首先，紫外吸收光谱法的背景干扰大导致分析的灵敏度低。其次，用于分析的底物均为多肽衍生物或蛋白质，底物的制备成本高。目前普遍应用的第三种弹性蛋白酶活性的检测方法是荧光发射光谱法，该方法以多肽类为荧光探针，检测的灵敏度高、操作方法简单、并且可以用于高通量筛选。该方法的缺陷在于多肽类探针在常规条件下大都稳定性差，储存和运输条件苛刻，原子利用率低。
[0003]目前国内外还没有非肽荧光探针用于检测弹性蛋白酶活性及其抑制剂或促进剂筛选的报道。因此，设计开发基于非肽荧光探针的灵敏、性质稳定、操作简便、成本低廉的检测方法是非常迫切和必要的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有弹性蛋白酶活性检测技术中存在的缺陷，提供一种灵敏度高、性质稳定、操作简便、易于储运并且成本低廉的非肽弹性蛋白酶活性检测荧光探针和弹性蛋白酶活性检测方法。
[0005]为达到上述目的，本发明提供一种香豆素衍生物，该香豆素衍生物具有式(I)所示结构，其中，R1为五氟乙基和七氟丙基中的一种，R2为三氟甲基、甲基、氰基、吡啶环和苯并噻唑环中的一种；
【权利要求】
1.一种香豆素衍生物，该香豆素衍生物如式(I)所示，其中，R1为五氟乙基和七氟丙基中的一种，R2为三氟甲基、甲基、氰基、吡啶环和苯并噻唑环中的一种；
2.权利要求1所述的香豆素衍生物的制备方法，其特征在于，该方法包括在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式(2)所示的化合物与酰氯或酸酐接触；
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，相对于I毫摩尔的式(2)所示结构化合物，所述酰氯或酸酐的用量为1-3毫摩尔，所述缚酸剂的用量为1-3毫摩尔，所述有机溶剂的用量为10-20毫升。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中，所述亲核反应条件包括:温度为零下5°C至 30°C，时间为 10-120min。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中，所述缚酸剂为三乙胺、二乙胺、二异丙基胺、吡唆、N，N-二甲氨基吡啶、2，6-二甲基吡唆、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种，所述有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、四氯化碳、乙腈、丙酮、乙二醇二甲醚、N, N-二甲基甲酰胺和1，2-二氯乙烷中的至少一种。
6.权利要求1所述的香豆素衍生物在检测弹性蛋白酶的活性中的应用。
7.一种弹性蛋白酶的活性的检测方法，其特征在于，该方法包括: 将待测样品与权利要求1中所述的香豆素衍生物接触，得到接触后的物料； 检测接触后的物料在激发光下发出的荧光强度的增加值，所述荧光强度的增加值指示了待测样品中弹性蛋白酶的活性；所述激发光的波长为340-430nm，所述荧光的发射波长为 450_520nm。
8.权利要求7所述的检测方法，其中，相对于Iμ M的弹性蛋白酶，所述香豆素衍生物的用量为1-100 μ Μ。
9.权利要求7或8所述的检测方法，其中，接触的条件包括:温度为25-37°C，pH值为6-8，时间为 5-30min。
10.一种弹性蛋白酶的活性的检测试剂盒，该检测试剂盒包括:权利要求1所述的香豆素衍生物、弹性蛋白酶标准品以及反应缓冲液。
【文档编号】C07D311/18GK104031014SQ201310086356
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年3月18日 优先权日:2013年3月8日
【发明者】杨光富, 杨文超, 李俊, 孙琦, 张春芳 申请人:华中师范大学