专利名称：一种从链霉菌发酵液中提取多抗菌素的方法
技术领域：
本发明涉及一种从发酵液中提纯多抗菌素的工艺，属于生物工程领域，具体涉及生物制药，发酵产物的提取，分离的方法，特别涉及一种从链霉菌发酵液中提出多抗菌素的方法。
背景技术：
多抗菌素(Polyoxins)也被称为多效霉素、多抗霉素、多氧霉素，是一种肽嘧啶核苷酸类农用抗生素。研究发现，多抗菌素由结构相关的14个组分(polyoxin A_N)组成。他们没有固定的熔点，在200°C左右逐渐分解，且易溶于水，难溶于甲醇、乙醇、丁醇、丙酮乙醚等有机溶剂，在PH为1-8的范围内较为稳定。多抗菌素作为一种广谱性抗生素，具有良好的内吸性及高度的靶标生物选择性。多抗菌素作用机理是抑制几丁质合成酶的催化作用，导致真菌细胞壁的组成成份几丁质不能合成而起到杀菌作用。多抗菌素与几丁质合成酶的底物尿二磷-N-乙酰葡萄糖胺结构相类似，从而抑制由几丁质合成酶催化的，由尿二磷-N-乙酰葡萄糖胺到几丁质这一步反应，通过酶的动力学研究，证明多抗菌素是几丁质合成酶的竞争性抑制剂。其对防治灰霉病、霜霉病、早疫病、 叶霜病、白粉病、枯萎病等多种真菌性病害具有优良的作用。由于一般农作物和哺乳动物体内无几丁质组成部分，因此多抗菌素对人畜安全，无积累作用，无“三致作用”(致突变、致畸、致癌)。长期以来，多抗菌素为日本Kaken制药株式会社所垄断，中国以前虽然也有厂家生产，但无论是产品质量还是发酵单位上，都无法与日本抗衡，出口量很少，基本上是限于国内市场经济作物上应用。由于日本同类产品销售价格高，导致用药成本相对较高，主要作为一种高端杀菌剂在应用，从而阻碍了该品种的大规模推广应用。目前对多抗菌素大部分的研究主要集中在多抗菌素的发酵及检测方面，显少有多抗菌素分离的报导。因此，本领域迫切需要提供一种易于操作、成本低，安全，可靠的分离方法。
发明内容
本发明的目的是为了改进现有技术的不足而提供一种从链霉菌发酵液中提取多抗菌素的方法，采用离子交换技术和重结晶的方法从发酵液中提取多抗菌素的工艺，操作方便、工艺简单、降低成本、提高效率。本发明的技术方案为:一种从链霉菌发酵液中提取多抗菌素的方法，其具体步骤如下:(I)取链霉菌发酵液，用酸调节pH至1.0-4.0，将发酵液离心，收集上清液，过滤，得到澄清液体；(2)将步骤(I)所得的澄清液体倒入分液漏斗中，再向其中加入有机溶剂，振荡，静置0.5-2h，取上清液，旋蒸，得旋蒸液；(3)将步骤(2)所得的旋蒸液用酸调节pH至1.0-4.0，转移到装有阳离子交换树脂的床层上进行吸附，并用盐溶液进行洗脱，每2-5min收集一次洗脱液，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计没有检出峰为止；合并有检出峰的洗脱液，进行旋蒸，得浓缩液；(4)将步骤(3)所得的浓缩液转移至葡聚糖凝胶柱，用洗脱液进行洗脱，每5-10min收集一次，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计没有检出峰为止，合并有检出峰的洗脱液；(5)将步骤(4)所得的洗脱液旋蒸，浓缩；(6)将步骤(5)所得浓缩液用酸调节pH值至1.0-4.0，再加入有机溶剂，直至晶体不再析出，得到重结晶晶体；(7)将步骤(6)中的重结晶晶体用真空干燥箱进行干燥。优选步骤(I)中离心的转速为8000-10000rmp/min ;离心时间为15_25min。优选步骤(I)、(3)和(6)中所述的酸均为HCl、H2SO4或H3PO4溶液，其浓度均为2.0-6.0moI/L0优选步骤(2)中所述的有机溶剂为乙酸乙酯，有机溶剂与澄清液体的体积比为0.1-0.5:1 ;旋蒸后，旋蒸液与上清液的体积比为1:(50-100)。优选步骤(3 )中所述阳离子交换树脂的种类为001X4、001X7或110型阳离子交换树脂，离子柱径与高比为1:(8-12);盐溶液为NaCl或KCl溶液，其质量百分浓度为10-30%，盐溶液的流速为5-15mL/min ;旋蒸液其体积与洗脱液的体积比为1: (50-100)。优选步骤(3)和(4)中紫外分光光度计的多抗菌素检测峰范围在240_280nm之间。优选步骤(4)中所述的葡聚糖凝胶柱为G-15或G-25，凝胶柱径与高为1:(5_7)；洗脱液为去离子水或超纯水；洗脱液的流速为0.5-2mL/min。优选步骤(5)中所述的旋蒸液的体积与洗脱液的体积比为1: (50-100)。优选步骤(6)中所述的有机溶剂为无水乙醇或丙酮。优选步骤(7)中所述的真空干燥箱的温度为60 80°C，真空度为一 0.075 一0.0lMPa，干燥时间为12 24小时。
具体实施例方式以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1(I)取链霉菌发酵液，用浓度为2.0mol/L的HCl溶液调节pH至1.0，将发酵液以8000rmp/min的转速离心15min，收集上清液，使用布氏漏斗过滤，得到澄清液体；(2)取步骤(I)所得的澄清液，倒入分液漏斗中，再向其中加入乙酸乙酯，乙酸乙酯与澄清液的体积比为0.1:1，振荡，静置0.5h，取上清液，旋蒸，旋蒸液与上清液体积比为1:50。(3)将步骤(2)所得的旋蒸液用浓度为3.0mol/L的H2SO4溶液调节pH至3.0，转移到装有001 X 7型阳离子交换树脂的床层上进行吸附，离子柱径/高比1:8，并用质量百分数为10%的NaCl溶液以5mL/min的速率进行洗脱，用部分收集器收集洗脱液，每2min收集一次，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计检测，直至在240-270nm范围内没有检出峰。合并在240-270nm范围内有检出峰的洗脱液，进行旋蒸，旋蒸液与洗脱液的体积比为1:70，得浓缩液；
(4)将步骤(3)所得的浓缩液转移至葡聚糖凝胶柱G-25，凝胶柱径/高比1:5，用去离子水以0.5mL/min的速率进行洗脱，每5min收集一次，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计检测，直至在240-270nm范围内没有检出峰，合并在240_270nm范围内有检出峰的洗脱液；(5)将步骤(4)所得的洗脱液旋蒸，旋蒸液与洗脱液的体积比为1:50 ；(6)向步骤(5)所得浓缩液用浓度为6.0moI/L的HCl溶液调节pH值至4.0，再向其中加入无水乙醇，得到重结晶晶体；(7)将步骤(6)中的晶体放入真空度干燥箱，温度设定60°C，真空度为一0.075MPa，干燥12小时，得粉末，经HPLC检测，得到多抗菌素粉末；产率为81%，纯度为98.7%。实施例2(I)取链霉菌发酵液，用浓度为6.0mol/L的H2SO4溶液调节pH至4.0，将发酵液以10000rmp/min的转速离心25min，收集上清液，使用布氏漏斗过滤，得到澄清液体；(2)取步骤(I)所得的澄清液体，倒入分液漏斗中，再向其中加入乙酸乙酯，乙酸乙酯与澄清液的体积比为0.5:1，振荡，静置2h，取上清液，旋蒸，旋蒸液与上清液体积比为1:100。(3)将步骤(2)所得的旋蒸液用浓度为4.0mol/L的HCl溶液调节pH至1.0，转移到装有001 X4型阳离子交换树脂的床层上进行吸附，离子柱径/高比1:12，并用质量百分数为30%的KCl溶液以15mL/min的速率进行洗脱，用部分收集器收集洗脱液，每5min收集一次，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计检测，直至在250-280nm范围内没有检出峰。合并在250-280nm范围内有检出峰的洗脱液，进行旋蒸，旋蒸液与洗脱液的体积比为1:50，得浓缩液；(4)将步骤(3)所得的浓缩液转移至葡聚糖凝胶柱G-15，凝胶柱径/高比1:7，用去离子水以2mL/min的速率进行洗脱，每IOmin收集一次，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计检测，直至在250-280nm范围内没有检出峰，合并在250_280nm范围内有检出峰的洗脱液；(5)将步骤(4)所得的洗脱液旋蒸，旋蒸液与洗脱液的体积比为1:100 ;(6)向步骤(5)所得浓缩液用浓度为2.0mol/L的H2SO4溶液调节pH值至3.0，再向其中缓慢加入无水乙醇，得到重结晶晶体；(7)将步骤(6)中的晶体放入真空度干燥箱，温度设定80°C，真空度为一 0.0lMPa,干燥24小时，得粉 末，经HPLC检测，得到多抗菌素粉末；产率为87%，纯度为99.2%。实施例3(I)取链霉菌发酵液，用浓度为5.0mol/L的HCl溶液调节pH至3.0，将发酵液以9000rmp/min的转速离心18min，收集上清液，使用布氏漏斗过滤，得到澄清液体；(2)取步骤(I)所得的澄清液体，倒入分液漏斗中，再向其中加入乙酸乙酯，乙酸乙酯与澄清液的体积比为0.25:1，振荡，静置1.5h，取上清液，旋蒸，旋蒸液与上清液体积比为 1:100。(3)将步骤(2)所得的旋蒸液用浓度为2.0mol/L的H2SO4溶液调节pH至2.0，转移到装有110型阳离子交换树脂的床层上进行吸附，离子柱径/高比1:10，并用质量百分数为30%的NaCl溶液以lOmL/min的速率进行洗脱，用部分收集器收集洗脱液，每5min收集一次，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计检测，直至在240-280nm范围内没有检出峰。合并在240-280nm范围内有检出峰的洗脱液，进行旋蒸，旋蒸液与洗脱液的体积比为1:100，得浓缩液；(4)将步骤(3)所得的浓缩液转移至葡聚糖凝胶柱G-25，凝胶柱径/高比1:6，用去离子水以2mL/min的速率进行洗脱，每IOmin收集一次，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计检测，直至在250-280nm范围内没有检出峰，合并在250_280nm范围内有检出峰的洗脱液；(5)将步骤(4)所得的洗脱液旋蒸，旋蒸液与洗脱液的体积比为1:70 ；(6)向步骤(5)所得浓缩液用浓度为3.0mol/L的HCl溶液调节pH值至1.0，再向其中缓慢加入丙酮，得到重结晶晶体；(7)将步骤 (6)中的晶体放入真空度干燥箱，温度设定60°C，真空度为一
0.070MPa，干燥20小时，得粉末，经HPLC检测，得到多抗菌素粉末；产率为83%，纯度为98.3%。
权利要求
1.一种从链霉菌发酵液中提取多抗菌素的方法，其具体步骤如下: (1)取链霉菌发酵液，用酸调节PH至1.0-4.0，将发酵液离心，收集上清液，过滤，得到澄清液体； (2)将步骤(I)所得的澄清液体倒入分液漏斗中，再向其中加入有机溶剂，振荡，静置0.5-2h，取上清液，旋蒸，得旋蒸液； (3)将步骤(2)所得的旋蒸液用酸调节pH至1.0-4.0，转移到装有阳离子交换树脂的床层上进行吸附，并用盐溶液进行洗脱，每2-5min收集一次洗脱液，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计没有检出峰为止；合并有检出峰的洗脱液，进行旋蒸，得浓缩液； (4)将步骤(3)所得的浓缩液转移至葡聚糖凝胶柱，用洗脱液进行洗脱，每5-10min收集一次，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计没有检出峰为止，合并有检出峰的洗脱液； (5)将步骤(4)所得的洗脱液旋蒸，浓缩； (6)将步骤(5)所得浓缩液用酸调节pH值至1.0-4.0，再加入有机溶剂，直至晶体不再析出，得到重结晶晶体； (7)将步骤(6)中的重结晶晶体用真空干燥箱进行干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)中离心的转速为8000-10000rmp/min ;离心时间为 15_25min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)、(3)和(6)中所述的酸均为HC1、H2SO4或H3PO4溶液，其浓度均为2.0-6.0moI/Lο
4.根据权利要求1所 述的方法，其特征在于:步骤(2)中所述的有机溶剂为乙酸乙酯，有机溶剂与澄清液体的体积比为0.1-0.5:1 ;旋蒸后,旋蒸液与上清液的体积比为1:(50-100)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中所述阳离子交换树脂的种类为001X4、001X7或110型阳离子交换树脂，离子柱径与高比为1:(8-12);盐溶液为NaCl或KCl溶液，其质量百分浓度为10-30%，盐溶液的流速为5-15mL/min ;旋蒸液其体积与洗脱液的体积比为1: (50-100)。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)和(4)中紫外分光光度计的多抗菌素检测峰范围在240-280nm之间。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的葡聚糖凝胶柱为G-15或G-25，凝胶柱径与高为1:(5-7);洗脱液为去离子水或超纯水；洗脱液的流速为0.5-2mL/min0
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(5)中所述的旋蒸液的体积与洗脱液的体积比为1: (50-100)。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(6)中所述的有机溶剂为无水乙醇或丙酮。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(7)中所述的真空干燥箱的温度为60 80°C，真空度为一0.075 一0.0lMPa，干燥时间为12 24小时。
全文摘要
本发明公开了一种从链霉菌发酵液中提取多抗菌素的方法，属于生物工程领域。通过链霉菌发酵液的过滤、脱色、阳离子交换树脂吸附、洗脱、凝胶树脂除盐、重结晶及真空干燥技术得到多抗菌素。本发明是一种易于操作、成本低，安全，可靠的分离方法。
文档编号C07K1/18GK103232525SQ20131013509
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日
发明者胡永红, 杨文革, 曹峥, 开玉美, 李佼佼, 梁萌萌 申请人:南京工业大学