专利名称：一种登革病毒简并疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种登革病毒简并疫苗及其制备方法和应用。
背景技术：
登革病毒(dengue virus, DV)是黄病毒属(Flaviviridae)有包膜的单股正链RNA病毒，以蚊虫为媒介，广泛流行于热带和亚热带地区。DV感染所致的人类登革热(classicaldengue fever, DF)和登革出血热 / 登革休克综合征(dengue hemorrhagic fever/dengueshock syndrome, DHF/DSS)严重危害人类健康。全球有25 30亿人生活在流行区内，每年有I亿以上的人遭受感染，DHF病例约50万，死亡率5 20%，如治疗不及时可达50%。近年来，随着全球气候变暖、人口流动、生态环境恶化、蚊媒分布区域扩展等诸多原因，登革热流行的范围和频率不断增加，WHO已将DHF/DSS、肝炎、疟疾、结核列为全球流行最严重的传染病(Murgue B.2010)。我国海南、广东、广西、福建、浙江和台湾等地区也都是重点流行区域，多次发生DF，DHF/DSS的爆发流行。但时至今日，对DV感染性疾病尚无特异的治疗手段，也无安全有效的疫苗问世(Mathew A.et al.2008)。自然界存在的登革病毒有四种血清型(DV-1-4)，感染其中的任何一型均可产生对此种血清型病毒的终身免疫，但不同型之间的交叉保护性免疫较为短暂，并且病毒感染产生的非中和抗体还可介导抗体依赖的感染增强现象(Antibody-dependent enhancement, ADE),导致严重的 DHF 和 DSS 的发生(MorensDM, et al.1987)。因此，对1_4型DV的有效免疫分子展开深入研究，并从中发掘有效的治疗策略和途径，研制出可同时针对四种血清型病毒的疫苗是当前登革热控制的当务之急。要认识DV的有效免疫分子，首先得从DV的结构入手。DV基因组(约Ilkb)可编码3种结构蛋白(衣壳蛋白C，基质蛋白M和包膜糖蛋白E)和7种非结构蛋白(NSl, NS2A，NS2B，NS3, NS4A，NS4B 和 NS5) (Leyssen P, et al.2000)。其中，糖蛋白 E 位于DV包膜上，是DV吸附靶细胞的重要功能蛋白(Modis Y, et al.2004)，由三个功能区构成:中心区(Domain I), 二聚体形成区(Domain II)和一个受体结合区(Domain III)。DV E蛋白D III区是决定病毒与受体结合的关键结构域，由E蛋白的295 392位残基构成，没有糖基化位点，但有一对二硫键(Cys302-Cys333)对维持其结构很重要，残基382-386形成一个受体结合Loop环，是DV识别和结合靶细胞上病毒受体的重要功能位点，决定着DV感染的靶细胞种类和组织嗜性(Matsui K, et al.2009)。虽然DV的受体尚未确定，但利用纯化的DV E蛋白D III区(EDIII)及其抗血清可在体外阻断DV的感染(Batra G, et al.2010)，证实了 E D III区是DV识别靶细胞上病毒受体的功能域，且有保护功能。古巴PCT/⑶2006/000015公开了 E蛋白的表面的保守区域用于预防和/或治疗由登革病毒1-4和其他黄病毒引起的感染，涉及嵌合蛋白质，其用作疫苗或用于针对登革病毒的4种血清型和其他黄病毒的预防性或治疗性治疗。但因血清型别的差异，交叉保护作用弱。 古巴PCT/⑶1998/000001公开了登革病毒的前M/M蛋白的表位、合成肽，涉及5种登革2型病毒前M/M蛋白的合成肽，能激发抗四种登革病毒血清型的中和抗体。但登革病毒的preM/M蛋白有很强的非中和表位(Dejnirattisai M, et al.Science, 2010),由此引发的抗体依赖的感染增强现象(ADE)不容忽视。印度Etemad B等(2008)和我国学者Chen S等(2007)将4种血清型登革病毒E蛋白的特定区域融合在一起，构建成4价重组蛋白疫苗，在动物水平有一定保护作用，中和滴度为1:47-1:588，对各型DV的保护力差异较大，不利于推广。美国Bowen等(2012)公开了一种用计算机根据671株DV EDIII蛋白序列设计的物理、化学一致性EDIII蛋白结合抗体的方法，产生的抗体虽然保护范围广，但特异性较差，可能对特异流行株感染的保护效果不佳，不利于推广。法国Sabchareon等(2012)报道 的首个登革热疫苗一 CYD-TDV重组减毒四价登革病毒疫苗能够对1，3和4型登革热病毒株具有免疫作用，但其整体效果并不理想，它对于在泰国最常见的2型登革热病毒株起不了任何防护作用。综上所述，本领域急切需求安全性好，对1-4型登革病毒均具有较好保护效力的优质疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全、新型、免疫效果好，适于产业化生产的疫苗。该疫苗融合了血清型为1，2，3，4型登革病毒保护性抗原组分，可刺激机体产生免疫应答，可以用于预防登革病毒感染性疾病。本发明提供的登革病毒简并疫苗，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。具体地，该氨基酸序列包含:I)血清型分别为1，2，3，4的登革病毒代表株进行序列比较分析后确定的抗原肽段；具体地为曾在世界广泛流行的1-4型登革病毒株进行序列比较分析后确定的抗原肽段；再依据此肽段进行人工设计；2)登革病毒包膜糖蛋白EDIII区以及与病毒毒力相关基因的中和表位；3)组成登革病毒包膜糖蛋白EDIII区基本结构的β片层及Loop环氨基酸。具体地，所述的EDIII区为1-4型登革病毒胞膜糖蛋白289-400位氨基酸残基之间的序列。具体地，所述的Loop环氨基酸为2型登革病毒胞膜糖蛋白382-386位氨基酸。本发明还提供编码上述登革病毒简并疫苗的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供一种重组表达载体，其含有上述的编码上述登革病毒简并疫苗的基因。本发明还提供一种转化体，其含有上述的重组表达载体。本发明提供的登革病毒简并疫苗能够用于制备预防登革病毒感染性疾病的制剂，该制剂包含药学上可接收的载体；本发明提供的登革病毒简并疫苗还能够用于制备抗登革病毒的抗体。 本发明提供的上述重组表达载体能够用于制备登革病毒简并疫苗。可预防的登革病毒病由如下四种血清型登革病毒中的至少一种引起:DV-1、DV_2、DV-3、DV-4。与现有技术相比，本发明具有以下优点:1.保护效力兼具广泛性和特异性I)以1-4型DV包膜糖蛋白EDIII序列为基础，比单一型其它的亚单位疫苗有更广泛的保护范围。2)针对在世界广泛流行的DV毒株设计DV简并性序列，提高了疫苗的特异性和有效性。2.保持了天然结构，提高了免疫的有效性I)保留组成DV包膜糖蛋白EDIII区基本结构的β片层及Loop环氨基酸位点，使疫苗结构更天然。2)设计的简并性序 列包含了病毒毒力相关基因，产生的免疫血清具有更高的保护效力。3.为成分单一的蛋白制剂，提高了疫苗的安全性。I)本发明的登革病毒简并性序列疫苗为一种重组的蛋白质制剂，不具有复制能力，也不会引起登革病毒导致的特异性细胞病变，可以最大程度地降低疫苗使用的风险。2)在疫苗的设计上，采用了 1-4型登革病毒E蛋白中重要的中和表位肽，摒弃了非中和表位，大大降低了疫苗使用后引发的抗体依赖性增强(ADE)现象，提高了使用安全性。4.生产成本低I)本发明所述的登革病毒简并性序列疫苗是以在大肠杆菌表达系统中表达进行的氨基酸优化，可在大肠杆菌中表达，其成本相对于酵母系统、哺乳动物细胞表达系统低，利于成本的控制。2)在构建了重组表达质粒后，转化靶细菌并筛选稳定的细菌克隆。在生产时，只需要培养稳定转化的细菌克隆、加入诱导剂诱导，即可产生大量的登革病毒简并性序列蛋白，经适当的纯化途径即可获得登革病毒简并性序列疫苗，缩短了疫苗生产流程，提高了疫苗的生产效率，产品生产成本降低。所述的登革病毒简并疫苗以大肠杆菌为表达宿主而进行了密码子优化设计，可在大肠杆菌中高效表达，成本低，产率高。为让本发明之上述和其它目的、特征和优点能更明确，下面结合具体实施实例，进一步阐明本发明。应当指出的是，这些实施实例仅用于进一步阐明本发明，而不用于限制本发明的适用范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版，科学出版社，2002)中所述的条件，或按试剂制造产家所建议的条件进行。实验证明，本发明的登革病毒简并疫苗免疫机体，可以激发机体产生体液免疫应答，对登革病毒强毒株感染的乳鼠有较高的保护效果。本发明对于预防人类登革病毒的感染具有重要的现实意义。下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图1为实施例4中登革病毒简并疫苗分子Western blot鉴定示意图。
图2为实施例5中登革病毒简并疫苗分子纯化结果的SDS-PAGE示意图。图3A至图3D显示了实施例7中登革病毒简并疫苗分子免疫小鼠血清中和病毒感染细胞的示意图。图4为对实施例1中列举的菌株中的病毒中和表位所在的区域进行分析，采用生物信息学软件BioEdit version7.0进行序列比对。
具体实施例方式实施例1登革病毒简并性序列疫苗分子的设计1.序列比对DV广泛流行于热带、亚热带地区，尤其是东南亚、非洲、中南美洲及西太平洋地区。本发明选取曾在世界流行的DV毒株，所述的DV毒株包括DV-1，DV-2, DV-3, DV-4四种血清型的代表菌株。DV-1选取西南印度洋和非洲地区流行株(GenBank登陆号DQ285558)，印度尼西亚流行株(GenBank登陆号AB189121 )，美洲流行株(GenBank登陆号GQ868530)和中国流行株(GenBank登陆号AY376738) ;DV_2选取在美国和日本流行的TR1751株(Trent, etal.1983)，非洲西部流行株(GenBank登陆号EF105386和EF105378)，美洲流行株(GenBank登陆号GQ199892)和太平洋地区流行株(GenBank登陆号HM582117) ;DV_3选取东南亚流行株(GenBank登陆号AY676353)，太平洋地区流行株(GenBank登陆号AY744678和FJ898455)，美洲流行株(GenBank登陆号FJ410176) ;DV_4选取美洲流行株(GenBank登陆号AF326573)，东亚、东南亚地区流行株(GenBank登陆号AY618990和FJ196850)和太平洋地区流行株(GenBank登陆号JQ650109)。以上DV流行株均选自NCBI数据库。对这些菌株中的病毒中和表位所在的区域进行分析，采用生物信息学软件BioEdit version7.0进行序列比对(见图4)。2.设计的简并序列包含DV毒力相关的抗原分子的中和表位I)受体结合Loop环:登革病毒包膜糖蛋白EDIII区残基382-386形成一个受体结合Loop环，是DV识别和结合靶细胞上病毒受体的重要功能位点，决定着DV感染的靶细胞种类和组织嗜性。2)重要的中和表位残基:DV-1 EDIII 区 K307, L308, E309, K310, E311, V312, L387，L389, W391 位残基和 DV_2 EDIII 区 G304, K305, K307, K310, P384 位残基被证实是 DV 中和表位。3.设计的简并序列包含构成EDIII区基本结构-β片层的氨基酸
DV-1:TSYVMCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSTQDEKGVTDV-2:MSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYE⑶GSPCKIPFEMDLEKRHDV-3:MSYAMCLNTFVLKKEVSETQHGTILIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKADV-4:MSYTMCSGKFSIDKEMAETQHGTTVVKVKYEGAGAPCKVPIEIRDVNKEKβ Iβ 2β 3 β 4 β 5aDV-1:QNGRLITANPIVTDKEKPVNIETEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFKKGDV-2:VLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGDV-3:HNGRLITANPVVTKKEEP VNIEAEPPFGESNIVIGI⑶KALKINWYKKGDV-4:VVGRVISSTPLAENTNSVTNIELEPPFGDSYIVIGVGNSALTLHWFRKG
β 5a β 5b β 6β 7β 8 Loop β 94.设计的登革病毒简并序列疫苗以大肠杆菌为表达宿主进行工程化制备，利用DNAfforks 2.4软件进行大肠杆菌使用密码子的优化设计(http://molbi0.1nf0.nih.gov/dnaworks/)。5.最终设计的简并序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，采用化学合成的方法获得该序列。实施例2登革病毒简并疫苗重组表达质粒的构建1.化学合成的简并序列DVIII的BamHI (TaKaRa公司)和XhoI (TaKaRa公司)双
酶切
权利要求
1.一种登革病毒简并疫苗，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.根据权利要求1所述的登革病毒简并疫苗，其特征在于，包含: 1)血清型分别为1，2，3，4的登革病毒代表株进行序列比较分析后确定的抗原肽段； 2)登革病毒包膜糖蛋白EDIII区以及与病毒毒力相关基因的中和表位； 3)组成登革病毒包膜糖蛋白EDIII区基本结构的β片层及Loop环氨基酸。
3.根据权利要求2所述的登革病毒简并疫苗，其特征在于，所述的EDIII区为1-4型登革病毒胞膜糖蛋白289-400位氨基酸残基之间的序列。
4.根据权利要求2所述的登革病毒简并疫苗，其特征在于，所述的Loop环氨基酸为2型登革病毒胞膜糖蛋白382-386位氨基酸。
5.一种编码权利要求1至4任一项所述的登革病毒简并疫苗的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。
6.—种重组表达载体,其特征在于,含有权利要求5所述的基因。
7.一种转化体，其特征在于，含有权利要求6所述的重组表达载体。
8.权利要求1所述的登革病毒简并疫苗在制备预防登革病毒感染性疾病的制剂中的应用。
9.权利要求1所述的登革病毒简并疫苗在制备抗登革病毒的抗体中的应用。
10.权利要求6所述的重组表达载体在制备登革病毒简并疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种登革病毒简并疫苗及其应用。所述登革病毒简并疫苗的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，具备包含血清型分别为1,2,3,4的登革病毒代表株进行序列比较分析后确定的抗原肽段；登革病毒包膜糖蛋白EDIII区以及与病毒毒力相关基因的中和表位；保留组成登革病毒包膜糖蛋白EDIII区基本结构的β片层及Loop环氨基酸。本发明的登革病毒简并疫苗免疫机体，可以激发机体产生体液免疫应答，能够用于预防登革病毒感染性疾病。
文档编号C07K14/18GK103193870SQ201310140259
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月22日 优先权日2013年4月22日
发明者饶贤才, 杨杰, 胡珍, 胡晓梅, 陈炜 申请人:中国人民解放军第三军医大学