专利名称：具有抑制肿瘤微环境血管再生和激活适应性免疫应答双功能的融合蛋白及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域。本发明涉及一种具有抑制肿瘤微环境血管再生和激活适应性免疫应答双功能的融合蛋白CD137L-Tumstatin及其基因，以及含有该基因的表达载体与由该载体转化得到的菌株，还涉及该融合蛋白的制备方法，同时涉及具有⑶137L和Tumstatin双功能的蛋白在制备抑制肿瘤微血管再生以及相关肿瘤学疾病(如，黑色素瘤、直肠癌、肺癌等)和激活适应性免疫应答功效药物方面的应用，另外涉及给药途径方面的应用(如，口服给药、喷雾给药途径等)。
背景技术：
癌症发生是一个多基因合作、不同信号途径参与的过程。就其本质而言，癌症是一种分子病症。当前，靶点单一的分子治疗策略逐渐显示出诸多弊端，而多靶点、多机制联合用药的治疗方法显示出更好的治疗效果。1971年哈佛大学Folkman教授提出“肿瘤的生长和转移依赖于微环境血管再生”学说。该理论认为，通过抑制肿瘤微环境血管再生，切断肿瘤的营养和氧气供应能够抑制肿瘤细胞的生长和转移。自发表至今，该学说在世界范围内已得到了大量实验室和临床上的数据支持，因而成为了近来肿瘤治疗领域内的新策略。人肿瘤抑制素(Tumstatin)是一个源于血管基底膜IV型胶原α 3链羧基C末端的肿瘤血管再生抑制因子，由244个氨基酸组成。在所有血管基底膜中，IV型胶原蛋白形成的三维网状骨架结构是起支架作用的主要成分，可促进细胞的黏附、迁移、分化和生长。它由6个独特的基因分别编码产生6条链α α 6，并以不同或相同的α链形成三聚体，进一步形成网状结构。IV型胶原蛋白的每条α 3链都由3部分功能区组成(7S结构域、三螺旋区、非胶原肽NCl结构域)，分布于肾小球、肺泡毛细血管、耳蜗、晶状体囊、卵巢和睾丸的基底膜。新生血管的形成是肿瘤生长和转移的关键性步骤，包含了一系列复杂的过程。肿瘤组织内由于低氧，使血管形成刺激因子合成增加，从而刺激肿瘤组织微环境新生血管的生成。近来研究表明，Tumstatin可特异性地抑制肿瘤血管内皮细胞蛋白的合成,导致内皮细胞凋亡，使血管生成受到抑制，从而抑制肿瘤生长和转移。另外，Tumstatin还具有直接作用于肿瘤细胞并抑制其增殖的特性。其作用机制为通过与整合素受体ανβ 3结合，特异地抑制肿瘤微环境血管内皮细胞蛋白的合成，进而阻断血管再生，抑制肿瘤的生长和转移。目前学术界就抗肿瘤免疫已达成共识，即在人和动物体内对恶性肿瘤存在着某种程度的免疫反应。肿瘤患者免疫系统的细胞能够识别肿瘤细胞表达的抗原，如组织分化抗原、癌胚抗原以及突变基因的产物等等。随着对肿瘤抗原识别及免疫应答机制的了解，研究已经表明通过辅助分子提供免疫共刺激信号可以提高抗肿瘤免疫应答。由于肿瘤抗原特异性T细胞需要协同刺激来辅助第一抗原信号激发效应细胞的功能，因而，协同刺激分子的辅助治疗可用于调节针对恶性 肿瘤的免疫反应。
共刺激分子在免疫应答中起了极其重要的作用。一般而言，激活T淋巴细胞需要两个信号的参与，分别是T细胞受体(T cell receptor, TCR)接受抗原递呈细胞(AntigenPresenting Cells, APC)传导的主要组织相容复合体-抗原肽信号(第一信号)，和细胞膜表面黏附分子提供的协同刺激信号(亦即第二信号)。增强T细胞介导的抗肿瘤免疫的重要方法之一即是提供T淋巴细胞活化所需要的协同刺激信号。CD137与其配体CD137L是继CD28/B7之外新发现的另一对重要的T细胞协同刺激信号分子。根据结构可将共刺激分子分为两类:肿瘤坏死因子受体超家族(Tumor NecrosisFactor Rec印tor，TNFR)和免疫球蛋白超家族。CD137是肿瘤坏死因子受体家族的成员。它在调节细胞增殖、分化、凋亡中发挥着重要作用。其配体CD137L也是TNF家族的成员，系细胞表面II型跨膜蛋白，与其他TNF家族有相似的C-端氨基酸。编码人CD137L的基因位于19p3.3，其产物为254个氨基酸，其中胞浆区28个氨基酸，跨膜区21个氨基酸，胞外区205个氨基酸。CD137L首先由Goodwin等人利用表达筛选技术在小鼠胸腺瘤细胞中分离提出，随后又在人CD4+T细胞克隆中分离得到。⑶137与其配体⑶137L之间的相互作用(⑶137/⑶137L)对T细胞活化的重要作用已得到充分认可。在鼠和人T细胞中均可观察到，在CD3抗体(第一信号)存在下，CD137便可诱导T细胞增殖、合成细胞因子(如IFN-α )，以及延长活化细胞的生存期。协同刺激信号可通过提高抗原特异性和效应CD8+T细胞的数量来增强效应功能；但在缺乏CD3抗体信号时，⑶137分子的刺激并不能改变T细 胞的功能，表明⑶137与⑶137L相互作用所提供的只是一种协同刺激信号。Kim等对T细胞及细胞因子的研究显示，⑶137单克隆抗体介导的抗肿瘤免疫依赖于CD4+T、CD8+T细胞的共同参与。CD137介导NF_kB的活化，进而上调bcl_xL和bfl_l分子的表达，延长⑶8+T、⑶4+T细胞的生存并促进其增殖。Melero等人利用激活型鼠源⑶137单克隆抗体来开展CD137靶向免疫治疗。结果表明CD137单抗能够消除小鼠体内已接种的P815实体瘤。与激活型CD137单克隆抗体的抗肿瘤效果一致，CD137L可协同激发细胞毒性T淋巴细胞效应(Cytotoxic lymphocyte, CTL)和抗肿瘤效应。OH37L-/-小鼠很好地说明了 CD137/CD137L系统在T细胞介导的对病毒和肿瘤免疫应答中所起的重要作用。对⑶137或⑶137L缺陷型小鼠的研究表明⑶137/⑶137L的协同刺激作用对移植物抗宿主病、T细胞的抗病毒细胞性应答很重要。综上所述，⑶137/⑶137L提供的刺激信号能协同⑶28/B7分子对进一步活化T细胞，维持⑶8+T细胞的增殖和生存。而Tumstatin可以有效抑制肿瘤血管的生成，对肿瘤细胞的存活、转移起阻滞作用。所以本发明中的融合蛋白Tumstatin-CD137L可以从抑制血管生成与增强抗肿瘤免疫应答两个方面共同抑制肿瘤的生长和转移，从而避免单一治疗引起的药物耐受，为治疗肿瘤患者提供新的策略。
发明内容
本发明通过短的柔性连接肽将Tumstatin抗血管生成活性片段与⑶137L胞外区蛋白合成一个同时具有增强T细胞免疫与抗血管生成的双功能、双靶点的分子；并且在本发明中选取了 Tumstatin不同的相关活性位点(Tumstatinl第45位至第98位氨基酸片段，Tumstatin2第60位至第132位氨基酸片段，Tumstatin3第60位至第98位氨基酸片段，Tumstatin7第74位至第98位氨基酸片段)与CD137L胞外区蛋白氨基酸序列(CD137L1第46位至第254位氨基酸片段，⑶137L5第83位至第254位氨基酸片段，⑶137L6第45位至第85位氨基酸和第167位至第254位氨基酸的接合片段，示意图如图2所示)通过连接肽相连接，利用原核或真核表达系统制备，此方法具有制备简单及避免了全长Tumstatin和全长CD137L的副作用问题，本发明将在制备血管生成抑制剂、各种肿瘤相关疾病(如黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、大肠癌、肾癌、膀胱癌等)、视网膜病变、细胞增殖、机体细胞因子合成与分泌、调节机体免疫力等药物，以及在制备以口服或注射等相关剂型药物中有很好的应用前景与市场价值。本发明的目的是提供一个兼有Tumstatin和⑶137L功能的蛋白。本发明的另一个目的是提供编码上述具有Tumstatin和⑶137L功能的蛋白的基因。本发明的另一个目的是提供上述具有Tumstatin和⑶137L功能的蛋白的制备方法。本发明的另一个目的是提供上述具有Tumstatin和⑶137L功能的蛋白及其基因在治疗肿瘤学相关疾病(如，黑色素瘤、直肠癌、肺癌等)和给药途径方面(如，口服给药、喷雾给药途径等)的应用。本发明技术方案具体如下:
一种具有Tumstatin和CD137L双功能重组蛋白，具有Tumstatin活性片段氨基酸序列和CD137L胞外区蛋白片段氨基酸序列，所述CD137L胞外区蛋白片段氨基酸序列和Tumstatin活性片段氨基酸序列通过柔性连接肽融合而成,所述Tumstatin活性片段氨基酸序列选自SEQ ID N0.52或SEQ ID N0.55，所述CD137L胞外区蛋白片段氨基酸序列选自SEQ IDN0.64至SEQ ID N0.66所示的氨基酸序列中的一种。上述连接肽氨基酸序列可采用本领域常规技术手段进行设计，优选SEQ ID N0.56至SEQ ID N0.63中的一种。本发明所述双功能重组蛋白氨基酸序列优选SEQ ID N0.19-SEQ ID N0.36所述中的一种，所述重组蛋白结构示意图如图1所示。本发明还提供了编码上述具有Tumstatin和⑶137L双功能重组蛋白基因，包括编码CD137L胞外区蛋白片段的基因、编码连接肽的基因和编码tumstatin活性片段的基因，其中所述编码CD137L胞外区蛋白片段的基因选自SEQ ID N0.49-SEQ ID N0.51中的一种，所述编码Tumstatin活性片段的基因选自SEQ ID N0.37-SEQ ID N0.40中的一种。上述编码连接肽的基因优选SEQ ID N0.41-SEQ ID N0.48中的一种。上述重组蛋白基因，其优选具有SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.18之一的核苷酸序列。本发明还提供了一种编码上述重组蛋白Tumstatin-⑶137L的基因，与上述的核苷酸序列相比具有70%及以上的同源性，能编码本发明所述重组蛋白或其保守性变异多肽或其活性片段或其活性衍生物。本发明还提供了上述具有Tumstatin和⑶137L双功能重组蛋白的制备方法,包括如下步骤:
(!)设计得到本发明所述编码具有Tumstatin活性与⑶137L活性的重组蛋白基因序列；
(2)构建含上述基因序列表达系统，包括构建表达载体再将表达载体转化入宿主细胞，形成可表达本发明所述具有Tumstatin活性与⑶137L活性的重组蛋白的重组细胞；
(3)培养步骤(2)重组细胞；
(4)分离纯化得到本发明所述具有Tumstatin活性与⑶137L活性的重组蛋白。上述表达系统可选用原核表达系统或真核表达系统，原核表达系统优选大肠杆菌表达系统或枯草芽孢杆菌表达系统，这两个表达系统普遍适应于本发明所述重组蛋白的表达，其中大肠杆菌系统中表达载体优选pET-1 la、pET-22b，枯草芽孢杆菌表达系统表达载体优选pP43 ;真核表达系统优选酵母表达系统，表达载体优选pPIC9K、pPICZ α Α,酵母宿主细胞优选 GSl 15 或 SMDl 168。上述制备方法的一种优选方案为:将编码上述具有Tumstatin活性与⑶137L活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L的基因通过Ndel及Nhel双酶切，然后连接至表达载体pET-1 Ia的相应酶切位点，再转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经液体培养工程菌获得包涵体形式的目的蛋白。通过将包涵体进行稀释复性的方法，即用含低浓度尿素的溶液多次洗涤包涵体蛋白，然后用含8M尿素的变性液在50°C溶解包涵体，最后用含0.4M L-Arg的复性液稀释复性包涵体(目的产物纯度达80%以上)，得到本发明所述重组蛋白。上述制备方法的一种优选方案为:将编码上述具有Tumstatin活性与⑶137L活性的重组蛋白Tumstatin-⑶137L的基因通过PstI及HindIII双酶切，然后连接至表达载体PP43的相应酶切位点，再电转枯草杆菌WB800，经液体培养工程菌获得分泌至胞外可溶形式的目的蛋白。利用DEAE阴离子交换的方法进行纯化，纯度达80%以上，得到本发明所述重组蛋白。上述制备方法的一种优选方案为:将编码上述具有Tumstatin活性与⑶137L活性的重组蛋白Tumstatin-⑶137L的基因通过EcoRI及NotI双酶切，然后连接至表达载体pPICZ a A的相应酶切位点，再电转毕赤酵母GSl 15，经液体培养工程菌获得分泌至胞外可溶形式的目的蛋白。通过DEAE阴离子交换的方法进行纯化，纯度达90%以上，得到本发明所述重组蛋白。本发明还提供了上述具有Tumstatin和⑶137L双功能重组蛋白在制备抑制肿瘤微环境血管再生以及相关肿瘤学疾病(如，黑色素瘤、直肠癌、肺癌等)、调节机体免疫力、T细胞增殖和机体细胞因子的合成与分泌的药物中的应用。本发明还提供了上述具有Tumstatin和⑶137L双功能重组蛋白基因在制备抑制肿瘤微环境血管再生以及相关肿瘤学疾病(如，黑色素瘤、直肠癌、肺癌等)、调节机体免疫力、T细胞增殖和机体细胞因子的合成与分泌的药物中的应用。上述应用中，本发明所述的重组蛋白可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明所述的重组蛋白和可药用载体。较佳的，药物组合物有0.1-99.9%重量百 分比的作为活性成分本发明所述的重组蛋白。“可药用载体”不会破坏本发明重组蛋白的药学活性，同时其有效用量，即能够起药物载体作用时的用量对人体
母O“可药用载体”包括但不限于:离子交换材料、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物传递系统(SEDDS^n d-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐温或其他类似聚合介质等药物制剂用的表面活性剂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、硅酸镁等。聚乙烯吡咯酮、纤维素物质、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、环糊精如α-、β_、Y-环糊精或其经化学修饰的衍生物如2-和3-羟丙基-β -环糊精等羟烷基环糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促进本发明所述重组蛋白的药物传递。其他可药用辅料如填充剂(如无水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合剂(如微晶纤维素)、崩解剂(如交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素和交联PVP)、润滑剂(如硬脂酸镁)、吸收促进剂、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、溶剂、增溶剂和着色剂等也可加入本发明的药物组合物中。在上述的药物组合物中，没有限制可以任选使用的任何剂型。例如，可举例说明的有口服给药形式如片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂或液体制剂，或胃肠外给药形式如注射、局部产品或栓剂，他们可以以常规方法配制或非常规方法如脂质体等。当使用本发明所述重组蛋白作为治疗剂时，其使用量对于成人大致每天0.0lmg至Ig的范围内，这取决于各患者的年龄、性别、体重和症状程度，并且日剂量可分为几个剂量。本发明所述的重组蛋白还包括采用现有技术领域常规方法对本发明所述重组蛋白进行修饰的修饰蛋白。对于蛋白质和 肽类药物，在多数情况下，机体内的氨肽酶及羧肽酶很容易从常见的直链肽的两端进行逐步的切割分解，使直链肽被降解。多肽修饰是改变肽链主链结构和侧链基团的重要手段，已有大量文献表明经过修饰后的多肽药物可以显著降低免疫原性、减少毒副作用、增加水溶性、延长体内作用时间、改变其生物分布状况等等，明显改善药物的疗效。本发明所述重组蛋白常用修饰方法包括中间残基的修饰、氨基酸替换、糖基化修饰及PEG修饰等，基本原理都是增加多肽分子的相对分子量和空间位阻，提高其对多肽水解酶的稳定性，减少肾小球的滤过作用。替换肽链中的某几个氨基酸是另一种推迟酶降解使多肽药物的半衰期延长的方式，替换对象通常为肽链中的易酶解的氨基酸。具体的说，可对重组蛋白中间残基进行糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化、硝基化、磺酸化或者连接PEG修饰或者偶联蛋白质，其中:
糖基化修饰最常用的为N-糖基化和O-糖基化。糖基化修饰肽优选在本发明所述重组蛋白氨基酸序列中的一个或多个Tyr、Ser或Thr残基上的氧与糖相连或本发明所述重组蛋白的氨基酸序列中的一个或多个天冬酰胺侧链的酰胺氮与糖相连。磷酸化修饰肽优选在本发明所述重组蛋白氨基酸序列中的一个或多个Tyr、Ser或Thr位点进行磷酸化。甲基化修饰肽包括侧链甲基化修饰肽和N端甲基化修饰肽，侧链甲基化优选在本发明所述重组蛋白氨基酸序列中的一个或多个Lys、Tyr或Arg侧链上进行甲基化,如Lys (For), Lys(Me), Lys(Me)2, Lys(Me)3, Arg(Me)2symmetrical, D-Tyr(Me), D-Tyr (Et)；
乙酰化修饰肽优选在本发明所述重组蛋白氨基酸序列中的一个或多个Lys或Ser侧链进行乙酰化，如Ser (Ac)或Lys (Ac)。
硝基化或磺酸化修饰肽优选在本发明所述重组蛋白氨基酸序列中的一个或多个Tyr侧链上进行硝基化或磺酸化，Tyr(3-N02)，Tyr(SO3H2)。中间残基的PEG修饰优选在本发明所述重组蛋白氨基酸序列中的一个或多个Lys侧链的氨基进行PEG修饰，PEG分子量优选为2000-10000。或者，将本发明所述重组蛋白或其上述修饰蛋白的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸替换成相应的氨基酸衍生物或特殊氨基酸，如将丙氨酸替换成β -丙氨酸、高苯丙氨或萘基丙氨酸，将脯氨酸替换成羟脯氨酸，亮氨酸替换成正亮氨酸，缬氨酸替换成正缬氨酸，苏氨酸替换成别苏氨酸，异亮氨酸替换成别异亮氨酸，天冬酰胺替换成2-乙酰氨基-2-脱氧-β -D-吡喃葡萄糖基天冬酰胺(Asn (GlcNac (Ac) 3- β _D))，赖氨酸替换成Lys(palmitoyl)。或者，将本发明所述重组蛋白或其上述修饰蛋白的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸替换成相应的D型氨基酸。本发明中编码上述具有Tumstatin活性与⑶137L活性的双功能重组蛋白的基因(NCBI中Gene ID:1285与Gene ID:8744)使用常规策略通过全基因合成、PCR方法或其两者结合的方法获得，其中⑶137L全长序列载体模板可参考文献(Wang shuzhen.J IndMicrobiol Biotechnol.2012Mar;39(3):471-6.do1:10.1007/sl0295-011-1045_l.)中公开的方法制备得到。本发明构建了含有上述编码具有Tumstatin和⑶137L双功能的蛋白基因的表达载体，即通过常规PCR技术及酶切、连接将Tumstatin-连接肽-⑶137L胞外区基因片段经NdeI和NheI双酶切后，连接入原核表达载体pETl Ia的相应酶切位点之间，经过测序验证得到正确的表达载体。本发明构建了含上述表 达载体的基因工程菌，即通过将目的基因转化BL21，通过液体培养基小量培养筛选表达目的蛋白的阳性工程菌。本发明提供了获得具有Tumstatin和⑶137L双功能的蛋白的方法，该方法是将阳性工程菌种进行培养发酵并经常温诱导使其高效表达具有Tumstatin和⑶137L双功能的蛋白，再收集菌体，高压破碎细胞、离心得到的菌体沉淀经变性溶解和稀释复性获得具有Tumstatin和OH37L双功能的重组蛋白。本发明对具有Tumstatin和⑶137L双功能的重组蛋白的活性测定是通过开展人脐静脉内皮细胞活性试验(HUVEC assay)和小鼠T细胞激活试验来进行的。其中，人脐静脉内皮细胞活性试验结果显示，对内皮细胞的增殖有显著的抑制作用。小鼠T细胞激活试验表明，所述重组蛋白能保持⑶137L的生物活性，可协同抗⑶3和抗⑶28单克隆抗体刺激T细胞的增殖。本发明的有益效果:
本发明表明，采用原核表达系统表达由Tumstatin和⑶137L胞外区活性片段重组蛋白，可以产生兼具Tumstatin和⑶137L双活性的蛋白。利用本发明生产的Tumstatin-连接肽-⑶137L重组蛋白(兼具Tumstatin和⑶137L功能的蛋白)，具有表达效率高、表达量大、表达周期短，易于纯化等优点。同时，本发明提供的融合蛋白对人脐静脉内皮细胞的增殖有显著的抑制作用，并且具有剂量依赖性，同时也可协同抗CD3和抗CD28单克隆抗体刺激小鼠T细胞的增殖。因此，本发明为大规模生产Tumstatin和⑶137L重组蛋白提供了新的、安全的途径，为进一步研究和开发成为新一代抗肿瘤药物奠定了扎实的基础，在制药行业具有广阔的应用前景。
图1为本发明所述具有Tumstatin和⑶137L双功能的重组蛋白结构示意图。柔性连接肽氨基酸序列选自SEQ ID N0.56-SEQ ID N0.63中的一种。图 2 为 CD137L1 (SEQ ID N0.64)、CD137L5 (SEQ ID N0.65)和 CD137L6 (SEQ IDN0.66)在⑶137L氨基酸全长序列中的区域示意图。图3为氨基酸序列如SEQ ID N0.19-SEQ ID N0.36所示的重组蛋白Tumstatin-连接肽-CD137L在大肠杆菌中的表达。泳道1-18分别对应SEQ ID N0.19-36。图4为代表性Tumstatin-连接肽-CD137L蛋白氨基酸序列(SEQ ID N0.23-SEQID N0.30)在枯草芽孢杆菌中的表达。泳道1-8分别对应SEQ ID N0.23、24、25、26、27、28、29、30。图5为代表性Tumstatin-连接肽-CD137L蛋白氨基酸序列(SEQ ID N0.23-SEQID N0.30)在酵母菌中的表达。泳道1-8分别对应蛋白氨基酸序列SEQ ID N0.23、24、25、26、27、28、29、30。图6为代表性Tumstatin-连接肽-⑶137L蛋白样品经稀释复性后进行的SDS-PAGE电泳结果图。其中，第I泳道样品氨基酸序列为SEQ ID N0.19 ;第2泳道样品氨基酸序列为SEQ ID N0.20 ;第3泳道样品氨基酸序列为SEQ ID N0.21 ;第4泳道样品氨基酸序列为SEQ ID N0.31 ;第5泳道样品氨基酸序列为SEQ ID N0.32 ;第6泳道样品氨基酸序列为 SEQ ID N0.35。图7为代表性Tumstatin-连接肽-⑶137L蛋白样品对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。图8为代表性Tumstatin-连接肽-⑶137L蛋白样品对小鼠T淋巴细胞增殖的影响。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
本发明共设计18种具有Tumstatin活性与⑶137L活性的双功能重组蛋白，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.18所示序列，翻译编码氨基酸序列为SEQ ID N0.19至SEQ ID N0.36所示序列。该组蛋白具有Tumstatinl第45位至第98位氨基酸片段、Tumstatin2第60位至第132位氨基酸片段、Tumstatin3第60位至第98位氨基酸片段或Tumstatin7第74位 至第98位氨基酸片段与CD137L胞外区蛋白氨基酸序列(CD137L1第46位至第254位氨基酸片段，⑶137L5第83位至第254位氨基酸片段，⑶137L6第45位至第85位氨基酸和第167位至第254位氨基酸的接合片段中的一种，两者通过柔性连接肽连接融合而成，其中连接肽氨基酸序列如SEQ ID N0.56至SEQ ID N0.63所示。本发明在连接有上述Tumstatin活性片段基因和连接肽基因的核苷酸序列的(如SEQ ID N0.76-SEQ IDN0.80所示)的5’端和3’设计EcoRI和BamHI酶切位点，交由上海捷瑞生物工程有限公司进行全合成，并连入具有相应酶切位点pBluescriptll SK(+)载体,重组载体由上海捷瑞生物工程有限公司提供。各类表达载体由Novagen公司购得，ToplO和BL21 (DE3)菌株由Invitrogen公司购得。PMD18-T载体、溶液I (货号:D103A)、逆转录酶、T4DNA连接酶和Ndel、NheI等限制性内切酶均购自TAKARA公司。引物的合成和核苷酸序列测序由上海英骏生物技术有限公司完成。变性溶解和稀释复性所采用的尿素(分析纯)购自南京试剂化学品有限公司。人脐静脉内皮细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司。小鼠T细胞增殖试验所使用的EasySep Negative Selection Kit 购自 Stem Cell 公司。抗 CD3 和抗 CD28 单克隆抗体购自Santa Cruz公司。其他试剂均为国产分析纯。实施例1:具有Tumstatin活性与OH37L活性的重组蛋白Tumstatin-Q)137L在大肠杆菌表达系统中的表达
1.表达系统的构建
共设计了 18种具有Tumstatin活性与⑶137L活性的双功能重组蛋白，该蛋白为Tumstatinl/ Tumstatin2/Tumstatin3/Tumstatin7 和 CD137L1/CD137L5/CD137L6 与连接肽融合而成(图1)。其中，CD137L1、CD137L5、CD137L6分别来自CD137L全长氨基酸序列的46-254位氨基酸、83-254位氨基酸，以及45-85位氨基酸和167-254位氨基酸(图2)。该蛋白核苷酸序列为SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.18所示序列，翻译编码氨基酸序列为SEQ IDN0.19至SEQ ID N0.36所示序列，连接肽选自SEQ ID N0.56至SEQ ID N0.63所示序列中的一种。编码⑶137L胞外区蛋 白(⑶137L1第46位至254位氨基酸片段，⑶137L5第83位至第254位氨基酸片段，⑶137L6第45位至第85位氨基酸和第167位至第254位)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.49-SEQ ID N0.51所示，采用PCR方法扩增得到，其中，⑶137L全长序列模板参考文献(Wang shuzhen.J Ind MicrobiolBiotechnol.2012Mar; 39 (3):471-6.do1:10.1007/sl0295-011-1045-l.)中公开的方法制备得到。以上述文献中提及方法制备本专利所用的⑶137L模板。以SEQ ID N0.49的上游引物(SEQ ID N0.81)和SEQ ID N0.49的下游引物(SEQ ID N0.82)为引物，rTaqDNA聚合酶催化扩增得到⑶137L1(SEQ ID N0.49)基因片段(此时该基因两端酶切位点分别为5’BamHI和3’NotI)，并将该产物连至pMDlS-Τ载体。随后通过酶切连接等常规分子生物学手段，将⑶137L4基因片段从pMD18-T载体上切下连接至由捷瑞公司全合成的已含有Tumstatin和连接肽(SEQ ID N0.73-SEQ ID N0.80)的 pBluescriptll SK(+)载体上。到这一步，已将完整的融合蛋白基因(SEQ ID N0.5-SEQ ID N0.12)整合在pBluescriptll SK(+)载体上。之后选用上游引物SEQ ID N0.83，下游引物SEQ ID N0.84，通过PCR的方法扩增该融合蛋白基因，产物5’酶切位点为Nhel，产物3’酶切位点为NdeI，最终连接至表达载体pETl la。以上述文献中提及方法制备本专利所用的⑶137L模板。以SEQ ID N0.50的上游引物(SEQ ID N0.85)和SEQ ID N0.50的下游引物(SEQ ID N0.86)为引物，rTaqDNA聚合酶催化扩增得到⑶137L5(SEQ ID N0.50)基因片段(此时该基因两端酶切位点分别为5’BamHI和3’ NotI),并将该产物连至pMDlS-Τ载体。随后通过酶切连接等常规分子生物学手段，将⑶137L5基因片段从pMD18-T载体上切下连接至由捷瑞公司全合成的已含有Tumstatin和连接肽(SEQ ID N0.67-SEQ ID N0.72)的 pBluescriptll SK(+)载体上。到这一步，已将完整的融合蛋白基因(SEQ ID N0.K SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.13-SEQ ID N0.16)整合在 pBluescriptll SK(+)载体上。之后选用 SEQ ID N0.1 上游引物 SEQ ID N0.87、SEQ IDN0.3 上游引物 SEQ ID N0.88、SEQ ID N0.13-SEQ ID N0.14 上游引物 SEQ ID N0.89、SEQID N0.15-SEQ ID N0.16 上游引物 90，SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.13-SEQ IDN0.16下游引物SEQ ID N0.91，通过PCR的方法扩增该融合蛋白基因，产物5’酶切位点为Nhel，产物3’酶切位点为NdeI，最终连接至表达载体pETl la。以上述文献中提及方法制备本专利所用的⑶137L模板。以SEQ ID N0.51的上游引物 I (SEQ ID N0.92)和 SEQ ID N0.51 的下游引物 I (SEQ ID N0.93)为引物，以 SEQ IDN0.51的上游引物2 (SEQ ID N0.94)和SEQ ID N0.51的下游引物2 (SEQ ID N0.95)为弓丨物，rTaqDNA聚合酶催化扩增得到CD137L6 (SEQ ID N0.51)的两个基因片段，琼脂糖电泳切胶回收该两段基因。随即使用分子生物学OverlapPCR技术，将回收得到的两段基因用做模板，
以 CD137L6 的上游引物 I (SEQ ID N0.92)和 CD137L6 的下游引物 2 (SEQ ID N0.95)为引物，扩增出最终的CD137L6 (SEQ ID N0.51)片段(两端酶切位点5’BamHI和3’NotI)并连接至PMD18-T载体。随后将CD137L6(SEQ ID N0.51)基因片段从pMD18_T载体上切下连接至由上海捷瑞公司合成的已含有Tumstatin和连接肽(SEQ ID N0.67、SEQ ID N0.68、SEQ ID N0.70,SEQ ID N0.72)的 pBluescriptll SK(+)载体上。到这一步，已把完整的融合蛋白基因(SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.17-18)整合在 pBluescriptll SK(+)载体上。之后分别选用 SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.4 上游引物 SEQ ID N0.96、SEQ ID N0.17上游引物 SEQ ID N0.97、SEQ ID N0.18 上游引物 SEQ ID N0.98, SEQ ID N0.2, SEQ IDN0.4,SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.18下游引物SEQ ID N0.99，通过PCR的方法扩增该融合蛋白基因(SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.17、SEQ IDN0.18)，并连接至最终表达载体pETlla。上述实验操作过程中涉及到的引物有:
权利要求
1.一种具有Tumstatin和OH37L双功能重组蛋白，其特征在于该蛋白具有Tumstatin活性片段氨基酸序列和CD137L胞外区蛋白片段氨基酸序列，所述CD137L胞外区蛋白片段氨基酸序列和Tumstatin活性片段氨基酸序列通过柔性连接肽融合而成,所述Tumstatin活性片段氨基酸序列选自SEQ ID N0.52至SEQ ID N0.55中的一种，所述⑶137L胞外区蛋白片段氨基酸序列选自SEQ ID N0.64至SEQ ID N0.66所示的氨基酸序列中的一种。
2.如权利要求1所述双功能重组蛋白，其特征在于所述连接肽氨基酸序列选自SEQIDN0.56 至 SEQ ID N0.63 中的一种。
3.如权利要求2所述双功能重组蛋白，其特征在于具有SEQID N0.19至SEQ ID N0.36所述的氨基酸序列。
4.编码如权利要求1-3任一项所述的具有Tumstatin和⑶137L双功能重组蛋白基因，其特征在于包括编码CD137L胞外区蛋白片段的基因、编码连接肽的基因和编码tumstatin活性片段的基因，其中所述编码CD137L胞外区蛋白片段的基因选自SEQ ID N0.49-SEQ IDN0.51中的一种或几种，所述编码tumstatin活性片段的基因选自SEQ ID N0.37或SEQ IDN0.40。
5.如权利要求4所述的双功能重组蛋白基因，其特征在于所述编码连接肽的基因选自SEQ ID N0.41-SEQ ID N0.48。
6.如权利要求5所述的双功能重组蛋白基因，其特征在于具有SEQID N0.1-SEQ IDN0.18之一的核苷酸序列。·
7.一种具有Tumstatin和⑶137L双功能重组蛋白的基因，其特征在于与权利要求4_6任一项所述的核苷酸序列相比具有70%及以上的同源性。
8.一种如权利要求1-3任一项所述的具有Tumstatin和⑶137L双功能重组蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)设计得到如权利要求4-6任一项所述的核苷酸序列； (2)构建含如权利要求4-6任一项所述的核苷酸序列表达系统,包括构建表达载体并将表达载体转化入宿主细胞，形成可表达如权利要求1-3任一项所述的具有Tumstatin活性与⑶137L活性的重组蛋白的重组细胞； (3)培养步骤(2)重组细胞； (4)分离纯化得到如权利要求1-3任一项所述的具有Tumstatin和⑶137L双功能重组蛋白。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述表达系统为原核表达系统或真核表达系统，所述原核表达系统选自大肠杆菌表达系统或芽孢杆菌表达系统；所述真核表达系统选自酵母表达系统。
10.如权利要求1-3任一项所述的具有Tumstatin和⑶137L双功能重组蛋白在制备抑制肿瘤微环境血管再生、各种肿瘤相关疾病、调节机体免疫力、T细胞增殖和机体细胞因子的合成与分泌药物中的应用。
11.如权利要求4-6任一项所述的具有Tumstatin和⑶137L双功能重组蛋白基因在制备抑制肿瘤微环境血管再生、各种肿瘤相关疾病、调节机体免疫力、T细胞增殖和机体细胞因子的合成与分泌药物中的应用。
全文摘要
具有抑制肿瘤微环境血管再生和激活适应性免疫应答双功能的融合蛋白及其基因和应用。本发明公开了一组具有Tumstatin和CD137L双功能重组蛋白，其特征在于该蛋白具有Tumstatin活性片段氨基酸序列(SEQ ID NO.52至SEQ ID NO.55中的一种)和CD137L胞外区蛋白片段氨基酸序列(SEQ ID NO.64至SEQ ID NO.66中的一种)和，两者通过柔性连接肽融合而成。该蛋白及编码蛋白的基因可应用于肿瘤血管生成抑制剂、各种肿瘤学相关疾病、机体免疫调节药物的研究与应用。
文档编号C07K19/00GK103214584SQ201310162738
公开日2013年7月24日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者刘楠, 马超, 何东洋, 陈依军 申请人:中国药科大学