专利名称：一株针对h5亚型禽流感病毒的单抗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体为识别不同分支的H5N1亚型AIV的单克隆抗体。
背景技术：
高致病性禽流感(HighlyPathogenic Avian Influenza, HPAI)不仅对世界的养禽业危害重大，更重要的是它严重威胁了人类健康，由于它的存在，使得许多国家的动物产品进出口贸易受到限制。使用有效方法检测Al对其控制和预防有重大意义，目前确诊Al必须依赖实验室诊断，主要包括检测分离病毒和血清学试验等。病毒的分离，血凝抑制试验(HI)、间接免疫荧光法(IFA) ,ELISA方法等是较常用的方法，病毒鉴定主要依赖于H1、IFA、ELISA、PCR等方法。其中H1、IFA、ELISA试验所需的多抗血清的制备比较繁琐，而且其敏感性和特异性较差，不同批次的抗体质量差异大。但单抗具有均质性、敏感性、特异性好，不同批次的抗体质量差异小，具有其独特的优势。所以有必要开展相关研究以单抗建立检测方法，以满足现场和生产实践中的需求。概据WHO公布的HA遗传进化树的命名原则，禽流感的HA基因可分为多个clade。近年来研究表明，我国流行的H5N1亚型AIV血凝素(HA)基因分属于clade2.3.4、clade2.3.2和clade7.2，不同地区存在着不同的优势流行株。AIV属于单股负链RNA病毒，在疫苗和环境的选择压力下，AIV非常容易发生变异，病毒的抗原性容易发生改变，动物实验表明我国现行的Al疫苗对不同分支的病毒株保护效果不一致，对一些毒株完全没有保护效果，说明病毒变异的速度非常快。通常所研制的单抗只能识别一个clade病毒，而我们获得的这株单抗既能识别clade2.3.4分支中的病毒毒株，又能识别clade2.3.2分支中的病毒毒株，这株单抗具有广谱性，可以以此为基础建立检测H5N1亚型AIV的方法，为临床与实践的不同需要提供了建立快速、特异、敏感的检测方法的可能。
发明内容
本发明利用单克隆技术获得I株针对H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenzavirus, AIV)的单抗，具有良好的特异性，与H1、H9亚型AIV和新城疫病毒(NDV)无交叉反应，与clade2.3.2、clade2.3.4的H5N1亚型AIV的毒株反应，可以以此为基础建立检测H5N1亚型AIV的方法，为临床与实践的不同需要提供了建立快速、特异、敏感的检测方法的可能。本研究应用H5N1 亚型 AIV 优势代表株 A/Duck/Sheyang/2005 (SY, clade2.3.4)，纯化后免疫BALB/c小鼠，通过ELISA法结合血凝抑制法筛选阳性克隆，最终获得I株能稳定分泌抗体的单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为SYA9，保藏号为CGMCC N0.7401。特异性结果显示，该株单抗与Hl、H9亚型AIV和NDV无交叉反应。Western_blot结果显示，SYA9除与 SY (clade2.3.4)产生特异性条带外,还与 A/Chicken/NorthernChina/k0602/2010[1006(clade2.3.4) ]、A/Duck/Huadong/xool/2010[JY (clade2.3.2)]和 A/Chicken/Shandong/K0701/2010[1007(clade2.3.2)]产生反应，均在55kDa左右出现一条特异性条带，此条带为HAl所在位置。间接免疫荧光实验结果显示，SYA9 对 SY(clade2.3.4)、1006(clade2.3.4)、JY(clade2.3.2)、1007 (clade2.3.2)均有特异性荧光。因此，SYA9是一株反应谱较广的单抗，可用于检测clade2.3.4和clade2.3.2的AIV,具有较好的应用前景。该株单抗的获得为建立同时检测clade2.3.2、clade2.3.4的H5N1亚型的AIV的方法提供可能，具有较为广泛的应用价值，为临床与实践的不同需要提供建立快速、特异、敏感的检测方法的可能。
图1禽流感病毒的SDS-PAGE电泳图。M:预染蛋白分子量标准图2单抗Western-blot分析。M:预染蛋白分子量标准图3是单抗SYA9的免疫荧光试验。A: JY株，B:SY株，C: 1006株，D:1007株，E:DT株，F:MDCK细胞对照。本发明中所述的杂交瘤细胞株SYA9于2013年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为的保藏号为CGMCC N0.7401。
具体实施例方式本发明中涉及的JY 、DT、SY、1006和1007AIV由申请人保存，并能向公众提供。A/Duck/Huadong/xool/2010 (JY, clade2.3.2):仲书官，2011，华东地区2009-2010年禽流感、新城疫流行病学调查及H5N1和HlNl亚型AIV的遗传演化分析[M]，扬州大学硕士论文。A/Chicken/Dongtai/2008 (DT，clade7):Li Y, Zhang X, Xu Q, Fu Q, ZhuY, et al.(2013)Characterisation and haemagglutinin gene epitope mappingof a variant strain of H5Nlsubtype avian influenza virus.VeterinaryMicrobiology162:614-622.
A/Duck/Sheyang/2005 (SY, clade2.3.4): Tang Y, Wu P, Peng D, Wang X，Wan
H,et al.(2009)Characterization of duck H5N1influenza viruses with differingpathogenicity in mallard(Anas platyrhynchos)ducks.Avian Pathology38:457-467.
A/Chicken/NorthernChina/k0602/2010(1006, clade2.3.4):赵坤坤.2011，华东地区2009-2010禽流感病毒检测与H5亚型病毒的遗传进化分析[M]，扬州大学硕士论文。A/Chicken/Shandong/K0701/2010(1007, clade2.3.2):赵坤坤.2011，华东地区2009-2010禽流感病毒检测与H5亚型病毒的遗传进化分析[M]，扬州大学硕士论文。I抗原的制备1.1病毒的扩增和灭活将AIV SY株用无菌PBS分别进行IX 10_4稀释，然后接种9 11日龄SPF鸡胚，取200 μ L稀释好的病毒液，尿囊腔接种鸡胚，35.5°C孵育，将接种24h后死亡的鸡胚放入4°C过夜。收集尿囊液，0.1%福尔马林灭活，最后收集灭活好的病毒液备用。1.2抗原的纯化
采用PEG浓缩法对所收获的病毒液进行浓缩。取灭活好的病毒液500mL装入处理好的透析袋内，用PEG-12000包埋透析袋，4°C作用数小时，待透析袋内液体量浓缩至原来的1/5 1/10时将其吸出，_20°C保存备用。蔗糖密度梯度超速离心，纯化病毒，具体步骤:浓缩后的病毒以4°C 6000rpm离心30min,取上清，4°C 30000rpm超速离心2h，将沉淀用适量PBS重悬，将悬液慢慢加入静置过夜的蔗糖梯度离心管中的液面上，4°C 30000rpm离心2h，慢慢取出离心管，对光可见到乳白色蛋白带，吸取蛋白带，用PBS稀释。以30000rpm离心Ih去除鹿糖,沉淀以少量PBS进行溶解，-70°C保存备用。2动物免疫取适量的纯化病毒(100 μ g)与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射6周龄BALB/c小鼠；2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；3天后融合。3 融合加强免疫3天后，小鼠摘眼球采血作为阳性血清；处死无菌取脾脏，分离脾细胞，计数，制成脾细胞悬液。按6:1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞(2X IO7)混合，在PEG作用下进行细胞融合；融合细胞经洗涤后，用HAT选择培养基重悬，置37°C 5%C02培养箱内培养；5d后用HAT更换一半培养基；IOd后换用HT培养基；观察杂交瘤细胞的生长情况，待培养细胞上清变黄或杂交瘤细胞克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取100 μ L细胞上清进行抗体检测。4杂交瘤细胞的筛选以纯化的病毒作为检测抗原`，采用间接ELISA方法来筛选阳性克隆。同时测定其HI特性。加强免疫后小鼠的尾静脉采血，离心取血清，以方阵试验确定最佳抗原包被浓度和抗体稀释度，同时以非免疫小鼠的血清作为阴性对照，并设立空白调零孔。将纯化病毒用碳酸盐包被缓冲液做系列稀释，每一行为一个稀释度，从1:100开始倍比稀释，100 μ L/孔包被酶标板，37 °C水浴作用2h后4°C包被过夜；用PBST洗涤3遍，每次5min，在吸水纸上拍干；加封闭液200 μ L/孔，37°C水浴作用2h，洗涤同上；加入倍比稀释的阳性血清，阴性对照孔加100 μ L阴性血清，调零孔加100 μ L PBS，从1:400开始稀释，每个稀释度加一列，100 μ L/孔，37°C孵育lh，洗涤同上；加入工作浓度(1:8000稀释)的羊抗鼠HRP-1gGlOO μ L/孔，37°C孵育lh，洗涤同上；加入新鲜配制的TMB底物显色液100 μ L/孔，37°C反应10-15min ;加入2M H2S0450 μ L/孔终止反应。测定孔内的0D45(I。纯病毒抗原包被浓度经方阵确定为2.5 μ g/ml。以该浓度包被酶标板，检测杂交瘤上清，选择ELISA值较高的孔，再进行HI试验，确定单抗是否具有HI特性。获I株单抗SYA9，具有ELISA反应性，不具有HI反应性。5杂交瘤细胞的亚克隆挑选连续两次间接ELISA读值较高的或HI价较高的杂交瘤细胞孔，采用有限稀释法对其进行克隆化。将阳性孔中的杂交瘤细胞吹下，经计数后用HT培养基稀释，按0.5个细胞/孔、I个细胞/孔、3个细胞/孔加入到装有饲养细胞的96孔板中；37°C 5% CO2培养箱培养7 10天，对出现单个细胞克隆孔的上清再用间接ELISA方法进行检测；连续进行3 4次亚克隆，至每个细胞孔上清均为阳性时定株，扩大培养，冻存细胞。6腹水的制备取10周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射无菌液体石蜡，0.5mL/只；I周后注射生长状态良好的杂交瘤细胞，I X IO6CFU/只；待小鼠腹部凸起明显时，腹腔采集腹水，2500rpm离lOmin，取上清，_70°C保存备用。7单抗特性的鉴定7.1单抗特异性鉴定用H5亚型AIV SY (clade2.3.4)、H1亚型AIV、H9亚型AIV、NDV病毒尿囊液稀释后包被96孔酶标板，分别将对应单抗腹水进行稀释，腹水最先稀释倍数为1:100，依次10倍稀释。进行间接ELISA试验，并设PBS作为阴性对照。结果如表1，显示用病毒尿囊液1:10倍稀释包被酶标板，该株腹水仅与H5亚型AIV反应，不与Hl亚型AIV、H9亚型AIV和NDV反应。表I单抗特异性鉴定
权利要求
1.一株针对H5亚型禽流感病毒的单抗，其特征在于该单抗是由杂交瘤细胞株SYA9所分泌，杂交瘤细胞株SYA9的保藏号为`CGMCC N0.7401。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体为识别不同分支的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体。所述的针对H5亚型AIV的单抗，是由杂交瘤细胞株SYA9所分泌，杂交瘤细胞株SYA9的保藏号为CGMCC No.7401。该单抗具有良好的特异性，与H1、H9亚型AIV和新城疫病毒(NDV)无交叉反应，与clade2.3.2、clade2.3.4的H5N1亚型AIV的毒株反应，可以以此为基础建立检测H5N1亚型AIV的方法，为临床与实践的不同需要提供了建立快速、特异、敏感的检测方法的可能。
文档编号C07K16/10GK103204926SQ201310168309
公开日2013年7月17日 申请日期2013年5月8日 优先权日2013年5月8日
发明者彭大新, 陈素娟, 李树纯, 刘秀梵, 仲书官, 潘金金 申请人:扬州大学