博卡病毒(HBoV)共有的特异性表位、其应用及其抗体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了博卡病毒(HBoV)共有的特异性表位肽、其应用及其抗体。具体地，所述特异性表位肽为MSDTDIQDQQPDTVDAPQNT或EHAYPNASHPWDEDVMPDL。
【专利说明】博卡病毒（HBoV)共有的特异性表位、其应用及其抗体
【技术领域】
[0001] 本发明涉及博卡病毒，特别是可用于该病毒所致疾病诊断的表位，其应用及其抗 体。
【背景技术】
[0002] 人博卡病毒（huamn bocavirus，HBoV)是近年新发现的病毒，是目前已知的感染人 类的第二种细小病毒。HBoV已发现四种基因型（HBoVl-4)，HBoVl于2005年在瑞典一位急 性呼吸道感染儿童的鼻咽样本中发现。随后，又有三种博卡病毒（HBoV2-4)于2009?2010 年在粪便样本中陆续被发现。
[0003] 人博卡病毒的感染呈世界性分布，病毒不仅可以在呼吸道、粪便样本中检出，而且 在血清、扁桃体、唾液和尿液中均有检出。对呼吸道样本的PCR检测结果分析显示，根据国 家、地区、检测方法和人群的不同，HBoVl的检出率约为2-19%，其中在6个月?2岁的婴 幼儿中检出率最高，而在其他年龄组儿童和成人中检出率较低。因为HBoVl经常在上下呼 吸道感染的样本中检出，被认为是与呼吸道感染有关的潜在的致病因子。与HBoVl不同， HBoV2-4经常在粪便标本中检出，极少会在呼吸道感染样本中检出，因此HBoV2和HBoV3 可能与胃肠炎有关。在儿童肠道样本中，HBoV2检出率达26%，其次是HBoV3(5% )和 HBoV4(2% ) 〇
[0004] 博卡病毒经常与其它病毒共检出，而且可以在鼻咽部持续存在，因此博卡病毒与 疾病的关系一直受到争议。近年来，严重和致死性的博卡病毒感染陆续被报道。Mitui 等在2009-2010年四例严重脑炎患者（其中两例死亡）的脑脊液和血清样本中检测到 HBoVl和HB〇V2的核酸，而在脑脊液中没有检测到其它任何病原体[参见：Mitui MT， Tabib SM，Matsumoto T，et al. Detection of human bocavirus in the cerebrospinal fluid of children with encephalitis. Clin Infect Dis，2012,54 :964-7. ] ;2010 年， 斯洛维尼亚一位20岁急性呼吸道感染患者发展为急性呼吸衰竭和气胸，在支气管抽吸 物、鼻咽拭子和血浆样本中均检出高拷贝的HBoVIDNA，博卡病毒被证明为该患者唯一的 病原体（参见：Ursic T，Steyer A, Kopriva S，et al. Human bocavirus as the cause of a life-threatening infection. J Clin Microbiol，2011,49 :1179-81) ；2011 年， 德国一位严重呼吸道感染的婴儿也被证明为急性HBoVl的感染（参见： KiirnerRW， Sodcrliind-Vcncrmo M, van Koningsbruggen-Rietschel S，et al. Severe human bocavirus infection，Germany. Emerg Infect Dis，2011，17 :2303-5.)。这些证据强烈 支持博卡病毒可以单独作为致病因子。此外，荷兰的一项对从婴幼儿到青春期健康儿童的 纵向研究也进一步证明HBoVl的感染与急性呼吸道疾病和耳炎具有高度相关性（参见 ： Meriluoto M，Hedman L，Tanner L，et al. Association of human bocaviruslinfection with respiratory disease in childhood follow-up study, Finland. Emerg Infect Dis. 2012,18:264-71.)。
[0005] 博卡病毒属线性单股DNA病毒，其基因组大小约为5kb，含有三个开放阅读框，分 别编码非结构蛋白NS1、NP1和两个有重叠的衣壳蛋白VP1和VP2。NS1基因最早被转录、翻 译，与病毒DNA的复制相关；VP1和VP2蛋白是病毒的结构蛋白，具有良好的抗原性，而非结 构蛋白NP1的功能目前尚不清楚。VP2蛋白含有博卡病毒的主要抗原并可以形成病毒样颗 粒（VLP)，博卡病毒VLP具有和病毒体相似的形态和抗原性，已经作为抗原成功地用于博卡 病毒抗体的检测。
[0006] 对HBoVl-4的主要结构蛋白VP2的氨基酸序列比对结果显示，几种不同的博卡病 毒VP2蛋白序列之间存在较高的同源性，例如，HB 〇VlVP2与HB〇V2-4VP2的序列同源性约为 77-78%，HBoV2VP2 与 HBoV3-4VP2 的序列同源性约为 88_90%，HB〇V3VP2 与 HBoV4VP2 的序 列同源性约为90. 7%。近来的研究也证明HBoVl-4VP2VLPs之间存在血清学交叉反应（参 见 Kantola K,Hedman L,Arthur J,et al. Seroepidemiology of human bocavirusesl-4. J Infect Dis,2011,204 ： 1403-12 ；Guo L, Wang Y, Zhou H, et al. Differential seroprevalence of human bocavirus speciesl_4in Beijing，China. PLoS One，2012,7 : e39644)。这说明在HBoVl-4VP2之间可能存在共同的抗原表位。
[0007] 目前，对博卡病毒的血清学诊断主要是利用VLP作为抗原进行ELISA分析，但是 VLP的制备需要细胞培养过程，相对费力，而且耗时较长，制备不方便，不适合于大规模研 究。而来源于博卡病毒主要结构蛋白VP2的抗原表位具有高度保守性和特异性。因此源于 表位基础的ELISA方法可以对博卡病毒进行快速而简单的血清学诊断。然而，对于博卡病 毒VP2蛋白的抗原表位研究没有相关报导。
[0008] 在本研究中，我们成功鉴定了两个在HB〇Vl-4中高度保守的特异性表位。在此基 础上，我们建立了基于所述特异性表位的博卡病毒IgMELISA检测方法，该方法与基于VLP 的博卡病毒IgM ELISA检测方法具有良好的相关性。
【发明内容】
[0009] 在本研究中，我们利用博卡病毒VP2基因片段噬菌体库对HBOV1-3VP2蛋白的抗体 及博卡病毒阳性人血清进行筛选，获得四簇反应性较强的抗原表位，结合序列分析，合成2 条优势抗原表位多肽，与KLH偶联后免疫小鼠，获得抗血清。通过酶联免疫吸附法和免疫印 迹鉴定、序列比对等方法，确定了 2条在HBoVl-4中通用的博卡病毒特异性抗原表位，并建 立了基于所述特异性表位的博卡病毒IgM检测方法。
[0010] 本发明第一方面提供HBoVl-4中通用的博卡病毒特异性抗原表位肽，其序列为 SEQ ID N0 :1 或 SEQ ID N0 :2。
[0011] 本发明第二方面提供一种检测博卡病毒抗体的非诊断方法，包括：
[0012] 1)使样本与本发明第一方面所述的博卡病毒特异性抗原表位肽接触；
[0013] 2)检测抗原-抗体反应，结果为阳性说明存在博卡病毒抗体。
[0014] 在一个实施方案中，所述样本是人血清。
[0015] 在另一个实施方案中，所述检测抗原-抗体反应的过程为：先加入辣根过氧化物 酶山羊抗人IgM孵育，再加入TMB显色，最后检测吸光值。
[0016] 在又一个实施方案中，上述要检测的吸光值是0D450。
[0017] 本发明第三方面提供一种博卡病毒检测试剂盒，其包含本发明第一方面所述的博 卡病毒特异性抗原表位肽。
[0018] 在一个实施方案中，所述试剂盒还包含辣根过氧化物酶山羊抗人IgM和TMB。
[0019] 本发明第四方面提供本发明第一方面所述的博卡病毒特异性抗原表位肽用于检 测博卡病毒抗体的非诊断用途。
[0020] 本发明第五方面提供针对本发明第一方面所述的特异性抗原表位肽的博卡病毒 抗体。
[0021] 在一个实施方案中，所述博卡病毒抗体是通过将本发明第一方面所述的特异性抗 原表位肽与KLH偶联再免疫小鼠而制备的。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为博卡病毒VP2蛋白免疫优势表位筛选图。其中图最上面所示543个氨基酸 的序列是HBoVl 111-BJ07株（GenBank号JQ240469) VP2蛋白的氨基酸序列。
[0023] 图2为合成肽抗血清anti-Pl、anti_P2的滴度（A)及其与HBoVl-4、人细小病毒 B19和PARV4的VLP的反应⑶。
[0024] 图3为表位P1和P2关键氨基酸分析。其中"肽抑制物"是指实施例3中所述的 各合成短肽。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合优选实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规实验 条件和方法，如分子克隆实验室手册（Sambrook，et al. New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述方法或试剂制造商提供的方法。
[0026] 实施例1.博卡病毒VP2蛋白免疫优势表位的鉴定
[0027] 本文中所用的HBoVl_3VP2基因源自博卡病毒阳性腹泻粪便样本111-BJ07， 211-BJ07 和 46-BJ07(Genbank 号分别为 JQ240469, JQ240470 和 HM132056)。依据文献公 开的方法分别构建HB〇Vl-3VP2基因的随机噬菌体库，分别命名为库HB 〇Vl-VP2，HB〇V2-VP2 和HB〇V3-VP2。然后分别利用 申请人:制备的鼠抗HB 〇Vl-3VP2抗体和博卡病毒阳性人血清 对HB〇Vl-3VP2基因随机噬菌体库进行亲和筛选（随机噬菌体库制备方法及筛选方法参见 Khurana S,Suguitan AL Jr, Rivera Y,et al. Antigenic fingerprinting of H5Nlavian influenza using convalescent sera and monoclonal antibodies reveals potential vaccine and diagnostic targets. PLoS Med，20096:el000049)。图 1 所不为分别用鼠抗 HB〇Vl-3VP2抗体和博卡病毒阳性人血清通过亲和筛选获得的阳性克隆的表位分布情况， 筛选出的抗原表位可以进一步分为四个簇（I，II，III，IV)。由图中所示结果可以看出，在 l-20aa和162_180aa附近存在优势表位。
[0028] 实施例2.免疫优势表位的免疫原性和抗原特征
[0029] 2. 1肽与KLH的偶联
[0030] 根据博卡病毒抗原表位分布情况和HB〇VlVP2蛋白序列分析，合成P1和P2两条优 势抗原表位肽（序列分别如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示），并分别与KLH偶联以增 加多肽的免疫原性（表1)，用于免疫小鼠。肽的合成及与KLH的偶联委托上海生物工程技 术有限公司完成。
[0031 ] 表1.免疫所用肽-KLH偶联物的序列
[0032]
【权利要求】
1. 在HB0V1-4中通用的博卡病毒特异性抗原表位肽，其序列为SEQIDNO:1或SEQID NO :2。
2. -种检测博卡病毒抗体的非诊断方法，包括： 1) 使样本与权利要求1的博卡病毒特异性抗原表位肽接触； 2) 检测抗原-抗体反应，结果为阳性说明存在博卡病毒抗体。
3. 权利要求2的方法，其中所述样本是人血清。
4. 权利要求2或3的方法，其中所述检测抗原-抗体反应的过程为：先加入辣根过氧 化物酶山羊抗人IgM孵育，再加入TMB显色，最后检测吸光值。
5. 权利要求4的方法，其中所述吸光值是0D450。
6. -种博卡病毒检测试剂盒，其包含权利要求1所述的博卡病毒特异性抗原表位肽。
7. 权利要求6所述的试剂盒，还包含辣根过氧化物酶山羊抗人IgM和TMB。
8. 权利要求1所述的博卡病毒特异性抗原表位肽用于检测博卡病毒抗体的非诊断用 途。
9. 针对权利要求1所述的特异性抗原表位肽的博卡病毒抗体。
10. 权利要求9的博卡病毒抗体，其是通过将权利要求1所述的特异性抗原表位肽与 KLH偶联再免疫小鼠而制备的。
【文档编号】C07K16/08GK104151399SQ201310176723
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月14日 优先权日:2013年5月14日
【发明者】王健伟, 郭丽, 王雅英, G·弗奈特 申请人:中国医学科学院病原生物学研究所