一种从海马提取短肽的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从海马提取短肽的方法，该方法包括：提取海马蛋白粗品、从海马蛋白粗品中提取海马短肽。本发明的短肽提取率高达70%；成本低、操作简单、反应条件温和且环境友好。
【专利说明】一种从海马提取短肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提取短肽的方法，更具体的说，涉及一种从海马提取短肽的方法。
【背景技术】
[0002] 海马为海龙科动物，性温、味甘，是我国名贵的强壮补益中药材。中国历版药典收 藏的海马药材有5个品种：线纹海马、刺海马、大海马、三斑海马和小海马的干燥体，具有温 肾壮阳，散结消肿的功效。海马具有较高的营养价值，蛋白质含量高达70%，含有7种氨基 酸，七种7种为人体必需氨基酸；还含有大量的DHA，是前列腺和精子的主要物质基础；海马 含有丰富的磷脂与补益作用有关，海马中Mn、Zn含量高与补肾壮阳作用吻合，并富含Fe，与 其滋补肝肾补血生精作用相关。现代药理学研究证明，海马具有很多方面的药理作用。
[0003] 短肽在胃肠道中消化吸收比蛋白质、游离氨基酸消化吸收均好，速度快，而且短肽 比蛋白质在肠胃滞留的时间短，胃下垂感与腹部涨满感频度低，对小肠吸收面积减少。短肽 在生命过程中所起的作用比氨基酸更加积极，人体内蛋白质合成分解代谢过程。作为蛋白 质补充方式，对健康人而言，主要是从膳食的蛋白质中获得各种短肽和L-氨基酸，提供体 内合成激素、酶、蛋白质。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种从海马提取短肽的方法。
[0005] 为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
[0006] -种从海马提取短肽的方法，该方法包括以下步骤：
[0007] (1)提取海马蛋白粗品
[0008] 1)将海马内脏除去，清洗干净，晒干粉碎备用；
[0009] 2)将粉碎的海马放入15倍海马体积的5%的氯化钠溶液中，于3°C连续搅拌20? 50小时，用尼龙纱过滤，弃去滤液；滤渣用15倍海马体积的蒸馏水洗涤，重复三次，即得到 去除非蛋白的海马；
[0010] 3)向步骤2)得到去除非蛋白的海马中加入海马质量10倍的蒸馏水和海马质量 3?8倍的异丙醇，在45°C下加热6分钟，以脱去脂肪；
[0011] 4)回收含异丙醇的废液，并分馏回收用于3)的脱脂；
[0012] 5)于脱脂后的海马中加入5倍蒸馏水，且在60?90°C加热处理10?60分钟，冷 却至60°C以下，每100克海马加5克酶酶解40?50小时；
[0013] 6)将5)酶解后的物料离心，上层溶液中和至中性后，喷雾干燥得蛋白粗品。
[0014] 分离出的沉淀加入到5)的物料中。
[0015] (2)从海马蛋白粗品中提取海马短肽
[0016] 1)将由步骤（1)提取的海马蛋白粗品加入12倍海马蛋白粗品体积的水成pH值 7. 0?8. 0,在常温下搅拌20分钟；
[0017] 2)用7500转/分的蝶式分离机分离，得到含有蛋白浆液和细纤维；
[0018] 3)将含有蛋白的浆液在反应器中与粉状含量90-95%海马分离蛋白调至浓度为6% 的蛋白浆液；
[0019] 4)采用色埋法和交联法将蛋白酶I、II固定，制成直径l-5mm的颗粒，成为固定化 酶，将其装入间歇或连续式反应器中，海马蛋白浆液以1-5倍床体积/小时流进反应器，反 应温度50-60°C，pH值控制在8-10,流出液为海马蛋白的水解液；
[0020] 5)将海马蛋白水解液通过超滤膜过滤，膜下物为MW小于2000的海马短肽超滤液， 膜上物为丽大于2000的海马蛋白、海马肽的混合固形物；
[0021] 6)将混合固形物返回海马蛋白浆液中重新调浆，继续水解；
[0022] 7)将海马短肽超滤液通过大孔强酸性阳离子柱脱盐，脱盐后料液电解率为 l〇-20us/cm2 ；
[0023] 8)脱盐后的料液浓缩至固形物9-11%，经活性炭脱色，炭液比为0.5-1:10，pH值为 4-7,温度为 30-70°C ;
[0024] 9)脱色后的料液经瞬间高温灭菌喷雾干燥得出精制海马短肽。
[0025] 在本发明的一优选实施例中，所述步骤（1)中的步骤5)中的酶为酸性蛋白酶、 AS. 1398蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味酶或中性蛋白酶中的一种或两种以上的混合 物。
[0026] 本发明具有以下优点：1、短肤的提取率商达70% ;
[0027] 2、本发明成本低、操作简单、反应条件温和且环境友好。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1
[0029] 海马提取短肽的步骤
[0030] (1)提取海马蛋白粗品
[0031] 1)将海马内脏除去，清洗干净，晒干粉碎备用；
[0032] 2)将粉碎的海马放入15倍海马体积的5%的氯化钠溶液中，于3°C连续搅拌30小 时，用尼龙纱过滤，弃去滤液；滤渣用15倍海马体积的蒸馏水洗涤，重复三次，即得到去除 非蛋白的海马；
[0033] 3)向步骤2)得到去除非蛋白的海马中加入海马质量10倍的蒸馏水和海马质量5 倍的异丙醇，在45°C下加热6分钟，以脱去脂肪；
[0034] 4)回收含异丙醇的废液，并分馏回收用于3)的脱脂；
[0035] 5)于脱脂后的海马中加入5倍蒸馏水，且在70°C加热处理20分钟，冷却至60°C以 下，每100克海马加5克AS. 1398蛋白酶酶解45小时；
[0036] 6)将5)酶解后的物料离心，上层溶液中和至中性后，喷雾干燥得蛋白粗品。
[0037] 分离出的沉淀加入到5)的物料中。
[0038] (2)从海马蛋白粗品中提取海马短肽
[0039] 1)将由步骤（1)提取的海马蛋白粗品加入12倍海马蛋白粗品体积的水成pH值 7. 0?8. 0,在常温下搅拌20分钟；
[0040] 2)用7500转/分的蝶式分离机分离，得到含有蛋白浆液和细纤维；
[0041] 3)将含有蛋白的浆液在反应器中与粉状含量90-95%海马分离蛋白调至浓度为6% 的蛋白浆液；
[0042] 4)采用色埋法和交联法将蛋白酶I、II固定，制成直径l_5mm的颗粒，成为固定化 酶，将其装入间歇或连续式反应器中，海马蛋白浆液以3倍床体积/小时流进反应器，反应 温度50-60°C，pH值控制在8-10,流出液为海马蛋白的水解液；
[0043] 5)将海马蛋白水解液通过超滤膜(截留MW2000以上)过滤，膜下物为MW小于2000 的海马短肽超滤液，膜上物为海马蛋白、海马肽(MW大于2000)的混合固形物；
[0044] 6)将混合固形物返回海马蛋白浆液中重新调浆，继续水解；
[0045] 7)将海马短肽超滤液通过大孔强酸性阳离子柱脱盐，脱盐后料液电解率为 l〇-20us/cm2 ；
[0046] 8)脱盐后的料液浓缩至固形物9-11%，经活性炭脱色，炭液比为0.5-1:10，pH值为 4-7,温度为40°C ;
[0047] 9)脱色后的料液经瞬间高温灭菌（135°C 5s)喷雾干燥得出精制海马短肽。
[0048] 实施例2
[0049] 海马提取短肽的步骤
[0050] (1)提取海马蛋白粗品
[0051] 1)将海马内脏除去，清洗干净，晒干粉碎备用；
[0052] 2)将粉碎的海马放入15倍海马体积的5%的氯化钠溶液中，于3°C连续搅拌40小 时，用尼龙纱过滤，弃去滤液；滤渣用15倍海马体积的蒸馏水洗涤，重复三次，即得到去除 非蛋白的海马；
[0053] 3)向步骤2)得到去除非蛋白的海马中加入海马质量10倍的蒸馏水和海马质量5 倍的异丙醇，在45°C下加热6分钟，以脱去脂肪；
[0054] 4)回收含异丙醇的废液，并分馏回收用于3)的脱脂；
[0055] 5)于脱脂后的海马中加入5倍蒸馏水，且在80°C加热处理20分钟，冷却至60°C以 下，每100克海马加5克AS. 1398蛋白酶和风味酶，两者以1:1 (w/w)组成的复合酶，酶解 45小时；
[0056] 6)将5)酶解后的物料离心，上层溶液中和至中性后，喷雾干燥得蛋白粗品。
[0057] 分离出的沉淀加入到5)的物料中。
[0058] (2)从海马蛋白粗品中提取海马短肽
[0059] 1)将由步骤（1)提取的海马蛋白粗品加入12倍海马蛋白粗品体积的水成pH值 7. 0?8. 0,在常温下搅拌20分钟；
[0060] 2)用7500转/分的蝶式分离机分离，得到含有蛋白浆液和细纤维；
[0061] 3)将含有蛋白的浆液在反应器中与粉状含量90-95%海马分离蛋白调至浓度为6% 的蛋白浆液；
[0062] 4)采用色埋法和交联法将蛋白酶I、II固定，制成直径l-5mm的颗粒，成为固定化 酶，将其装入间歇或连续式反应器中，海马蛋白浆液以2倍床体积/小时流进反应器，反应 温度50-60°C，pH值控制在8-10,流出液为海马蛋白的水解液；
[0063] 5)将海马蛋白水解液通过超滤膜(截留MW2000以上)过滤，膜下物为MW小于2000 的海马短肽超滤液，膜上物为海马蛋白、海马肽(MW大于2000)的混合固形物；
[0064] 6)将混合固形物返回海马蛋白浆液中重新调浆，继续水解；
[0065] 7)将海马短肽超滤液通过大孔强酸性阳离子柱脱盐，脱盐后料液电解率为 l〇-20us/cm2 ；
[0066] 8)脱盐后的料液浓缩至固形物9-11%，经活性炭脱色，炭液比为0.5-1:10，pH值为 4-7,温度为50°C ;
[0067] 9)脱色后的料液经瞬间高温灭菌（135°C 5s)喷雾干燥得出精制海马短肽。
[0068] 实施例3
[0069] 海马提取短肽的步骤 [0070] (1)提取海马蛋白粗品
[0071] 1)将海马内脏除去，清洗干净，晒干粉碎备用；
[0072] 2)将粉碎的海马放入15倍海马体积的5%的氯化钠溶液中，于3°C连续搅拌35小 时，用尼龙纱过滤，弃去滤液；滤渣用15倍海马体积的蒸馏水洗涤，重复三次，即得到去除 非蛋白的海马；
[0073] 3)向步骤2)得到去除非蛋白的海马中加入海马质量10倍的蒸馏水和海马质量4 倍的异丙醇，在45°C下加热6分钟，以脱去脂肪；
[0074] 4)回收含异丙醇的废液，并分馏回收用于3)的脱脂；
[0075] 5)于脱脂后的海马中加入5倍蒸馏水，且在65°C加热处理13分钟，冷却至60°C以 下，每100克海马加5克酸性蛋白酶酶解45小时；
[0076] 6)将5)酶解后的物料离心，上层溶液中和至中性后，喷雾干燥得蛋白粗品。
[0077] 分离出的沉淀加入到5)的物料中。
[0078] (2)从海马蛋白粗品中提取海马短肽
[0079] 1)将由步骤（1)提取的海马蛋白粗品加入12倍海马蛋白粗品体积的水成pH值 7. 0?8. 0,在常温下搅拌20分钟；
[0080] 2)用7500转/分的蝶式分离机分离，得到含有蛋白浆液和细纤维；
[0081] 3)将含有蛋白的浆液在反应器中与粉状含量90-95%海马分离蛋白调至浓度为6% 的蛋白浆液；
[0082] 4)采用色埋法和交联法将蛋白酶I、II固定，制成直径5mm的颗粒，成为固定化 酶，将其装入间歇或连续式反应器中，海马蛋白浆液以1-5倍床体积/小时流进反应器，反 应温度50-60°C，pH值控制在8-10,流出液为海马蛋白的水解液；
[0083] 5)将海马蛋白水解液通过超滤膜(截留MW2000以上)过滤，膜下物为MW小于2000 的海马短肽超滤液，膜上物为海马蛋白、海马肽(MW大于2000)的混合固形物；
[0084] 6)将混合固形物返回海马蛋白浆液中重新调浆，继续水解；
[0085] 7)将海马短肽超滤液通过大孔强酸性阳离子柱脱盐，脱盐后料液电解率为 l〇-20us/cm2 ；
[0086] 8)脱盐后的料液浓缩至固形物9-11%，经活性炭脱色，炭液比为0.5-1:10，pH值为 4-7,温度为65°C ;
[0087] 9)脱色后的料液经瞬间高温灭菌（135°C 5s)喷雾干燥得出精制海马短肽。
【权利要求】
1. 一种从海马提取短肽的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 提取海马蛋白粗品 1) 将海马内脏除去，清洗干净，晒干粉碎备用； 2) 将粉碎的海马放入15倍海马体积的5%的氯化钠溶液中，于3°C连续搅拌20?50 小时，用尼龙纱过滤，弃去滤液；滤渣用15倍海马体积的蒸馏水洗涤，重复三次，即得到去 除非蛋白的海马； 3) 向步骤2)得到去除非蛋白的海马中加入海马质量10倍的蒸馏水和海马质量3?8 倍的异丙醇，在45°C下加热6分钟，以脱去脂肪； 4) 回收含异丙醇的废液，并分馏回收用于3)的脱脂； 5) 于脱脂后的海马中加入5倍蒸馏水，且在60?90°C加热处理10?60分钟，冷却至 60°C以下，每100克海马加5克酶酶解40?50小时； 6) 将5)酶解后的物料离心，上层溶液中和至中性后，喷雾干燥得蛋白粗品。 分离出的沉淀加入到5)的物料中。 (2) 从海马蛋白粗品中提取海马短肽 1) 将由步骤（1)提取的海马蛋白粗品加入12倍海马蛋白粗品体积的水成pH值7. 0? 8.0,在常温下搅拌20分钟； 2) 用7500转/分的蝶式分离机分离，得到含有蛋白浆液和细纤维； 3) 将含有蛋白的浆液在反应器中与粉状含量90-95%海马分离蛋白调至浓度为6%的蛋 白浆液； 4) 采用色埋法和交联法将蛋白酶I、II固定，制成直径l-5mm的颗粒，成为固定化酶， 将其装入间歇或连续式反应器中，海马蛋白浆液以1-5倍床体积/小时流进反应器，反应温 度50-60°C，pH值控制在8-10,流出液为海马蛋白的水解液； 5) 将海马蛋白水解液通过超滤膜过滤，膜下物为MW小于2000的海马短肽超滤液，膜上 物为丽大于2000的海马蛋白、海马肽的混合固形物； 6) 将混合固形物返回海马蛋白浆液中重新调浆，继续水解； 7) 将海马短肽超滤液通过大孔强酸性阳离子柱脱盐，脱盐后料液电解率为l〇-2〇US/ cm2 ； 8) 脱盐后的料液浓缩至固形物9-11%，经活性炭脱色，炭液比为0. 5-1:10，pH值为4-7， 温度为30-70°C ; 9) 脱色后的料液经瞬间高温灭菌喷雾干燥得出精制海马短肽。
2. 根据权利要求1所述的从海马提取短肽的方法，其特征在于，所述步骤（1)中的步骤 5)中的酶为酸性蛋白酶、AS. 1398蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味酶或中性蛋白酶中的 一种或两种以上的混合物。
【文档编号】C07K1/34GK104152517SQ201310180051
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月15日 优先权日:2013年5月15日
【发明者】吴文惠, 吴德新, 包斌, 陈佳捷, 严婷, 苏同伟, 孔婷 申请人:上海海洋大学, 中渔（福建）海洋生物科技有限公司