缀合的因子viii分子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及缀合的因子VIII分子。本发明涉及具有改变的循环半衰期的B-结构域截短的因子VIII分子，所述分子与亲水聚合物共价缀合。本发明此外涉及用于得到这种分子的方法以及这种分子的用途。
【专利说明】缀合的因子Vl I I分子
[0001]本申请是国际申请日为2009年2月26日的国际申请PCT/US2009/035339进入中国、申请号为200980106738.3的题为“缀合的因子VIII分子”的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及缀合的凝固因子VIII分子。具体地，本发明涉及具有改变的循环半衰期的缀合的因子VIII分子。
【背景技术】
[0003]A型血友病是由凝固因子VIII (FVIII)活性的缺乏或功能障碍造成的一种遗传性出血障碍。临床表现不是在初级止血-正常形成血凝块-而是由于缺乏次级凝血酶形成所导致的凝块不稳定。通过静脉内注射从血液分离的或重组生产的凝固因子FVIII，治疗该疾病。
[0004]流行的治疗推荐正在从传统的在要求时(on-demand)治疗转向预防。内源的FVIII的循环半衰期是12-14小时，因而每周需要进行几次预防性治疗，以使患者得到实际上无症状的生活。对于许多人，尤其是儿童和年轻人，静脉内施用伴有显著的不便和/或疼痛。因而本领域需要新颖的具有因子VIII活性的因子VIII产品，它们优选地在结构上是同质的，优选地是安全的，且优选地具有显著延长的循环半衰期，以减少每周施用因子VIII的次数。此外，本领域需要相对简单的得到和生产这种分子的方法。
[0005]本领域已知，为了延长循环半衰期，向因子VIII加入聚乙二醇(PEGylation)。但是，这是得到具有同质结构以及显著提高的循环半衰期的安全产品的障碍。可得到的生产缀合的因子VIII分子的方法经常是费力的，和/或倾向于导致低得率和/或在结构上不同质的产品。在W02008011633中已经暗示了人工改造的0-联糖基化位点用于得到治疗蛋白的应用，所述治疗蛋白具有延长的治疗蛋白循环半衰期，但是，其中没有公开缀合的因子VIII分子。
【发明内容】
[0006]在第一个方面，本发明涉及具有改变的循环半衰期的B结构域截短的因子VIII分子，所述分子在截短的B结构域中通过0-联寡糖与亲水聚合物共价缀合，其中因子VIII激活导致共价缀合的侧基的去除。
[0007]在其它方面，本发明另外涉及用于得到这种分子的方法，这种分子的用途和包含这种分子的药物组合物。
[0008]因而，提供了具有改变的循环半衰期的缀合的因子VIII分子，其中缀合的侧基(例如亲水聚合物)在激活后去除。根据本发明的分子优选地在结构上-至少在亲水聚合物在截短的B结构域中的位置这方面-是同质的，且优选地具有有利的安全概况。同样，本文另外提供了相对简单的用于得到这种分子的方法。优选地，根据本发明的激活的因子VIII分子类似于内源激活的因子VIII。
[0009]发明详述
[0010]定义:
[0011]因子VIII分子:FVIII/因子VIII是一种主要由肝细胞产生的大的、复杂的糖蛋白。FVIII由2351个氨基酸组成，包括信号肽，且含有几个根据同源性定义的不同结构域。存在3个A-结构域，I个独特的B-结构域和2个C-结构域。结构域次序可以列成NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。FVIII在血浆中作为在B-A3边界处分开的两条链进行循环。链通过二价金属离子结合进行连接。A1-A2-B链称作重链(HC)，而A3-C1-C2称作轻链(LC)。
[0012]内源的因子VIII分子作为一群具有各种大小的B结构域的分子在体内循环。在体内可能发生的是，B结构域的逐渐酶促去除，从而产生一群具有各种大小的B结构域的分子。一般认为，随同凝血酶激活发生在位置740处的切割，由此去除B-结构域的最后一部分。但是，不能排除的是，其中例如在位置740的切割位点已经受损的因子VIII变体可能是有活性的。
[0013]本文使用的“因子VIII”或“FVIII”是指一种人血浆糖蛋白，它是内在的凝固途径的一个成员，且是血液凝固所必需的。“天然的FVIII”是在SEQ ID N0.1 (氨基酸1-2332)中所示的全长人FVIII分子。B-结构域跨SEQ ID NOl中的氨基酸741-1648。
【权利要求】
1.具有改变的循环半衰期的B-结构域截短的因子VIII分子，所述分子在截短的B结构域中通过0-联寡糖与亲水聚合物共价缀合，其中(i)因子VIII激活导致共价缀合的亲水聚合物的去除。
2.根据权利要求1的分子，其中FVIII前体多肽的重链和轻链部分被接头分开，其中所述接头的序列源自FVIII B结构域。
3.根据权利要求1-2中任一项的分子，其中所述B结构域的长度为20-30个氨基酸。
4.根据权利要求1-3中任一项的分子，其中所述B结构域的长度为20个氨基酸。
5.根据权利要求1-4中任一项的分子，其中所述亲水聚合物是PEG。
6.根据权利要求5的分子，其中所述PEG的大小是约40，OOODa0
7.根据权利要求1-4中任一项的分子，其中所述亲水聚合物是多糖。
8.根据权利要求7的分子，其中所述多糖是聚唾液酸。
9.根据权利要求1-8中任一项的分子，其中所述分子包含根据SEQID NO:2的氨基酸序列。
10.基酸。
11.备:a)b)c)d)根据权利要求1-9中任一项的分子，其中所述B结构域比SEQ ID NO:2短I个氨根据权利要求1-10中任一项的分子，其中所述分子通过包含下述步骤的方法制用编码包含SEQ ID NO:2的FVIII分子的载体转染合适的宿主细胞；在适合于在宿主细胞中表达FVIII蛋白的条件下培养步骤(a)的宿主细胞；从步骤(b)的宿主细胞培养物收获FVIII蛋白；和经由0-联寡糖给FVIII蛋白分子共价缀合亲水聚合物。
12.药物组合物，其包含根据权利要求1-11中任一项的分子。
13.根据权利要求1-11中任一项的分子或根据权利要求12的药物制剂，其用作治疗血友病的药物。
14.根据权利要求1-11中任一项的分子或根据权利要求12的药物组合物，其用于通过皮下施用治疗血友病。
15.根据权利要求1-11中任一项的分子或根据权利要求12的药物制剂，其用于通过静脉内施用治疗血友病。
【文档编号】C07K14/755GK103497247SQ201310180846
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2009年2月26日 优先权日:2008年2月27日
【发明者】S.德弗里斯, G.博尔特, B.B.S.范达尔, L.蒂姆, H.R.斯特尼克, T.D.斯蒂恩斯特鲁普 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司