人凝血因子轻链蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明通过体外抑菌活性检测了人凝血因子轻链蛋白抗不同革兰氏阴性菌的最低抑菌浓度，通过体内抑菌活性检测了人凝血因子轻链蛋白对革兰氏阴性菌的抑制作用，证明了人凝血因子轻链蛋白对革兰氏阴性菌具有明显的抑制作用，以便开发出一类治疗革兰氏阴性菌感染的新型药物。通过质谱及银染检测证明了人凝血因子轻链蛋白对内毒素的水解及清除作用，以便开发出一类治疗内毒素血症的新型药物。所述人凝血因子轻链蛋白为人凝血因子VD、IX、X轻链蛋白，以及与它们具有50%以上同源性的蛋白。
【专利说明】人凝血因子轻链蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，特别涉及人凝血因子轻链蛋白及其在制药中的应用。
【背景技术】
[0002] 革兰氏阴性菌泛指在革兰氏染色反应中呈现红色的细菌。由于细胞壁结构的不 同，在革兰氏染色过程中，不同的染料造成了其与革兰氏阳性菌着色的不同（阳性菌为紫 色)。革兰氏阴性菌以大肠杆菌为代表，还有变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感 (嗜血）杆菌、副流感(嗜血）杆菌、卡他(摩拉）菌、不动杆菌属等等。该类细菌的致病能力往 往与其细胞壁的特殊组分--脂多糖(又叫内毒素）相关。在人体当中，脂多糖会诱导机体 产生大量细胞因子并激活免疫系统，最终形成有机体对病原菌的先天性免疫应答。例如红 肿就是细胞因子大量产生并释放导致的。
[0003] 在革兰氏阴性菌感染的治疗中，除了清除感染灶及用相应的支持对症治疗外，还 需使用抗生素。目前主要采用的是氨基糖苷类、β_内酰胺类等抗生素。这些抗生素对各 种革兰氏阴性菌有强大杀菌作用，而且对于铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌 等常见革兰氏阴性杆菌都具有较长时间的抗生素后效应。除了抗生素以外，如前列腺素合 成酶抑制剂、左旋咪唑、吞噬肽等也被用于革兰氏阴性菌感染的治疗。然而，随着抗生素的 广泛应用，临床出现的抗生素滥用现象导致细菌的耐药性已经从单类耐药发展成为多重耐 药，使大量原本能够有效替代的二线抗生素无效。其次，抗菌药物在杀/抑菌的同时会诱导 内毒素的产生，增加了疾病的治疗难度，所以尽管不断有新的杀伤力强的抗生素问世及先 进的支持疗法出现，革兰氏阴性菌感染所致的内毒素血症的处理仍是临床上棘手的问题， 尤其是其20?30%的死亡率更是令人难以接受。据报道脂多糖是导致革兰氏阴性菌感染后 发生的一系列毒性反应的主要病源物。虽然抗生素对清除细菌具有较好的效果，但对已游 离于血液中的脂多糖以及由其持续刺激靶细胞产生的多种有害细胞因子无能为力，所以临 床选用抗菌药物时应对药敏实验结果及其诱导内毒素释放的特性进行综合考虑。第三，因 为脂多糖在革兰氏阴性菌的细胞壁表面，使得很多旧型抗生素不能有效抑制此类细菌。基 于这些原因，近年来人们正在积极开拓治疗革兰氏阴性菌感染的新领域。
[0004] 抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs)是指具有抗菌活性的短肽，这类活性肽 多数具有热稳定性、强碱性及广谱抗菌等特点。目前人们已经从不同的生物体中鉴定出约 2000多个AMPs，这些AMPs经诱导而合成，在机体抵抗病原体的入侵方面起着重要的作用， 被认为是生物非特异性免疫功能的重要防御成分。因此寻找新型抗革兰氏阴性菌的APMs 成为研究的热点与难点。
[0005] 人凝血因子W (human factor VLhF W)是人体内天然存在的蛋白质，其分子量约 为50kD。其分子包含四个结构域：N末端膜结合的γ羧基谷氨酸结构域（Gla结构域)，两 个表皮生长因子样结构域（EGFUEGF2)和一个C端丝氨酸蛋白酶结构域。它在人体内还存 在一些序列同源性较高的类似物，如人凝血因子IX (human factor IX，hFIX)、人凝血因子X (human factor X，hFX)等。迄今为止，尚未见以人凝血因子W、人凝血因子IX、人凝血因 子X三者的轻链作为抑菌药物治疗细菌感染的相关报道及制备治疗革兰氏阴性菌所致的 内毒素血症的药物的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是提供人工制备的人凝血因子轻链蛋白，本发明的另一目的是 证明所述人凝血因子轻链蛋白对革兰氏阴性菌具有抑制作用，以便开发出一类治疗革兰氏 阴性菌感染的新型药物及治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物。
[0007] 本发明所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :1所述，或与SEQ ID NO :1所述氨基酸序列具有50%以上的同源性的蛋白。与序列表中 SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列具有50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO :3 所述。
[0008] 或本发明所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :2所述，或与SEQ ID NO :2所述氨基酸序列具有50%以上的同源性的蛋白。与序列 表中SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列具有50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :3 所述。
[0009] 或本发明所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :3所述，或与SEQ ID NO :3所述氨基酸序列具有50%以上的同源性的蛋白。与序列 表中SEQ ID NO :3所述的氨基酸序列具有50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 所述。
[0010] 氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :1所述列的人凝血因子轻链蛋白命名为 LhF VL氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :2所述的人凝血因子轻链蛋白命名为LhF IX，氨 基酸序列为序列表中SEQ ID NO :3所述的人凝血因子轻链蛋白命名为LhF X。
[0011] 上述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，由原核重组质粒表达而成，或真核重组 质粒表达而成，或通过化学合成制备。
[0012] 本发明所述人凝血因子轻链的原核重组质粒、真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO :4所述的核苷酸序列或与序列表中SEQ ID NO :4所述的核苷酸序列具有50%以上同源 性的基因分别与原核载体或真核载体构建而成。与序列表中SEQ ID NO :4所述的核苷酸序 列具有50%以上同源性的基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6所 述。所述原核载体为pET质粒系统，包括pET-14b、pET-19b、pET-21a( + )、pET-28a( + )、 pET-42a ( + );所述真核载体为 pcDNA3. I ( + )、pcDNA3. 1 (_)。
[0013] 本发明所述人凝血因子轻链的原核重组质粒、真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO :5所述的核苷酸序列或与序列表中SEQ ID NO :5所述的核苷酸序列具有50%以上同源 性的基因分别与原核载体或真核载体构建而成。与序列表中SEQ ID NO :5所述的核苷酸序 列具有50%以上同源性的基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6所 述。所述原核载体为pET质粒系统，包括pET-14b、pET-19b、pET-21a( + )、pET-28a( + )、 pET-42a ( + );所述真核载体为 pcDNA3. I ( + )、pcDNA3. 1 (_)。
[0014] 本发明所述人凝血因子轻链的原核重组质粒、真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO :6所述的核苷酸序列或与序列表中SEQ ID NO :6所述的核苷酸序列具有50%以上同源 性的基因分别与原核载体或真核载体构建而成。与序列表中SEQ ID NO :6所述的核苷酸序 列具有50%以上同源性的基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所 述。所述原核载体为pET质粒系统，包括pET-14b、pET-19b、pET-21a( + )、pET-28a( + )、 pET-42a ( + );所述真核载体为 pcDNA3. I ( + )、pcDNA3. 1 (_)。
[0015] 本发明所使用的方法：
[0016] (1)通过PCR反应，获取编码重组LhFW、LhF IX、LhF X蛋白的基因或与它们具有 50%以上同源性的基因；
[0017] (2)将上述扩增的各基因片段分别插入到原核载体或真核载体构建原核重组质粒 或真核重组质粒，再将原核重组质粒或真核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后 筛选出含有正确插入片段的重组质粒测序；
[0018] (3)将测序结果正确的原核重组质粒转化入工程菌中进行表达，分离纯化表达的 蛋白即获得重组LhF W蛋白、LhF IX蛋白、LhF X蛋白或与它们具有50%以上同源性的蛋白； 或将真核重组质粒转染至哺乳动物细胞进行培养，建立稳定细胞系进行真核表达，然后分 离纯化的蛋白即获得重组LhF W蛋白、LhF IX蛋白、LhF X蛋白或与它们具有50%以上同源 性的蛋白；
[0019] (4)重组LhF W、LhF IX、LhF X蛋白或与它们具有50%以上同源性的蛋白的体外 抑菌活性检测；
[0020] (5)重组LhF W、LhF IX、LhF X蛋白或与它们具有50%以上同源性的蛋白的体内 抑菌活性检测；
[0021] (6)重组LhF W、LhF IX、LhF X蛋白或与它们具有50%以上同源性的蛋白水解脂 多糖的质谱检测；
[0022] (7)重组LhF W、LhF IX、LhF X蛋白或与它们具有50%以上同源性的蛋白水解脂 多糖的银染检测；
[0023] 所述原核载体为pET质粒系统，所述pET质粒系统包括pET-14b、pET-19b、 pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-42a(+)等原核表达质粒；所述真核载体为 pcDNA3. I ( + )、 pcDNA3. 1 (-)等。
[0024] 人凝血因子轻链蛋白的化学合成通常委托专业公司。
[0025] 本发明所述LhF W、LhF IX、LhF X蛋白能够水解革兰氏阴性菌的脂多糖(又称内 毒素，为革兰氏阴性菌外膜的主要成分)，破坏细胞结构的稳定性，进而起到杀菌的作用。同 时，研究表明轻链蛋白与组织因子具有很强的结合作用。当有机体受到创伤时，组织因子会 大量暴露于伤口处，使得轻链蛋白随之聚集在伤口处，起到对伤口的靶向抑菌作用。体外抑 制革兰氏阴性菌活性检测表明：LhF W、LhF IX、LhF X蛋白体对革兰氏阴性菌具有明显的抑 制作用，它们对大肠杆菌DH5 α、大肠杆菌BL21、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、 嗜水气单胞菌、异型枸橼酸杆菌、卡他莫拉菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘质沙雷氏杆 菌的最低抑菌浓度（MIC)如下：
[0026]
【权利要求】
1. 人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :1所述， 或与SEQ ID NO :1所述氨基酸序列具有50%以上的同源性的蛋白。
2. 根据权利要求1所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其特征在于与序列表中 SEQID NO :1所述的氨基酸序列具有50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO :3 所述。
3. 人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :2所述， 或与SEQ ID NO :2所述氨基酸序列具有50%以上的同源性的蛋白。
4. 根据权利要求3所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其特征在于与序列表中 SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列具有50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :3 所述。
5. 人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :3所述， 或与SEQ ID NO :3所述氨基酸序列具有50%以上的同源性的蛋白。
6. 根据权利要求5所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其特征在于与序列表中 SEQ ID NO :3所述的氨基酸序列具有50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 所述。
7. 根据权利要求1至6中任一权利要求所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其特 征在于由原核重组质粒表达而成，或真核重组质粒表达而成，或通过化学合成制备。
8. 权利要求1至7所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白在制备治疗革兰氏阴性菌感 染的药物中的应用。
9. 权利要求1至7所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白在制备治疗革兰氏阴性菌所 致的内毒素血症的药物中的应用。
【文档编号】C07K14/745GK104211802SQ201310206823
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年5月29日 优先权日:2013年5月29日
【发明者】宋旭, 陈金武, 廖东升, 马登佼 申请人:四川大学