中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法
【专利摘要】本发明公开了一种中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法，具体步骤为：萃取、大孔吸附树脂纯化得到30%及70%乙醇洗脱部位、取30%乙醇洗脱部位分离得到白芍苷R1纯品、芍药苷纯品、取70%乙醇洗脱部位分离得到芍药苷内酯纯品、芍药酮苷纯品、苯甲酰芍药苷纯品、没食子酰芍药苷纯品、甲基芍药苷纯品、人参皂苷Rg1纯品、人参皂苷Rc纯品、人参皂苷Rb1纯品、人参皂苷Rb2纯品等；分离出来的有效成分可以缩小药物的服用剂量，还可以保证药物的质量。
【专利说明】中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药制剂领域，具体涉及中药有效成分的分离方法。
【背景技术】
[0002]冠心病心绞痛是严重危害人类健康的疾病，已成为人类三大死亡原因之一。心绞痛是冠心病最常见的临床类型，不仅给患者带来极大痛苦，且可造成严重后果，多数学者报告心绞痛病人每年死亡率是4%左右，8年内将有30%的病人死亡。
[0003]我公司运用中医络病理论研究胸痹心痛病理机制，选用益气与虫类通络药物为主研制而成的治疗冠心病心绞痛的中药新制剂，该药在古代医家运用络病理论治疗久痛证取得良好疗效的基础上，提出冠心病心绞痛心气虚乏，络脉瘀阻，绌急而痛的病机新认识，制定了益气活血、通络止痛的治疗方法。依据保证药效、优化工艺的原则，确定了制备工艺，同时对部分药物进行了定量鉴别，既缩小了服用剂量，又保证了药物的疗效和质量。
[0004]研究表明，该药对血管病变的共性病理环节均具有显著干预作用:明显改善高血压、高血脂、高血糖等高危因素所致血管内皮功能障碍，稳定易损斑块减少心脑事件疗效确切，解除血管痉挛疗效独特，对目前尚无特效治疗药物的糖尿病微血管并发症如肾病、心肌病变、周围神经病变、眼底病变实验研究均取得显著疗效。
[0005]但该药组方复杂，虽然多年来对其作用机理做了大量的研究，但仅限于成品，其活性物质基础及其作用机理尚不明确。为了探索其活性物质，故对其植物药中间体进行了系统分离。得到如下物质:(1)芍药苷内酯，(2)芍药酮苷，(3)苯甲酰芍药苷，(4)没食子酰芍药苷，(5)芍药苷，(6)甲基芍药苷，(7)白芍苷R1, (8)人参皂苷Rg1, (9)人参皂苷Re，(10)人参皂苷Rb1, (11)人参皂苷Rb2, (12 W -O-苯甲酰芍药苷，(13)白芍苷R2。(1)-(13)结构如下:
【权利要求】
1.一种中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法，该中药组合物包括如下重量份的植物药人参3-10赤芍3-9降香1-5檀香1-5 炒酸枣仁3_10，该中药组合物植物药中间体的制备过程为:按比例称取各原料药，降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取；赤芍和炒酸枣仁加水煎煮；人参用乙醇提取后，再用水提取；将所有水提液过滤后混匀浓缩成水提浸膏，其特征在于包括以下步骤: A、萃取:称取该中药组合物植物药中间体，用20倍量水溶解，然后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂， B、大孔吸附树脂纯化:用DlOl大孔树脂将正丁醇萃取物粗分，分别用水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇依次洗脱，洗脱液浓缩干燥后，收集30%及70%乙醇洗脱部位； C、取30%乙醇洗脱部位，采用硅胶色谱柱，以氯仿-甲醇梯度洗脱，以薄层色谱检识各馏分并合并馏分，分别得到白芍苷R1纯品、芍药苷纯品； D、取70%乙醇洗脱部位，采用硅胶色谱柱，以氯仿-甲醇梯度洗脱，以薄层色谱检识各馏分并合并馏分，得到馏分Fr.rFr.9 ； E、分别取懼分Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9,经中压制备色谱分离，分别按照色谱峰收集各目标化合物，减压浓缩，分别得到各浓缩液； F、用制备液相色谱分别对各浓缩液进行洗脱，按照色谱峰分别收集目标化合物，减压浓缩分别得到芍药苷内酯纯品、芍药酮苷纯品、苯甲酰芍药苷纯品、没食子酰芍药苷纯品、甲基芍药苷纯品、人参皂苷Rg1纯品、人参皂苷Re纯品、人参皂苷Rb1纯品、人参皂苷Rb2纯品、2' -O-苯甲酰芍药苷、白芍苷R2。
2.根据权利要求1所述的中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法，其特征在于白芍苷R1的分离步骤如下: A、萃取:称取该中药组合物植物药中间体，用20倍量水溶解，然后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂； B、大孔吸附树脂纯化:用DlOl大孔树脂将正丁醇萃取物粗分，分别用水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇依次洗脱，洗脱液浓缩干燥后，收集30%及70%乙醇洗脱部位； C、取30%乙醇洗脱部位，采用硅胶色谱柱，以体积比为10:1~1:2的氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识各馏分并合并馏分，析出晶体，得到白芍苷R1纯品。
3.根据权利要求1所述的中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法，其特征在于芍药苷的分离步骤如下: Α、萃取:称取该中药组合物植物药中间体，用20倍量水溶解，然后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂； B、大孔吸附树脂纯化:用DlOl大孔树脂将正丁醇萃取物粗分，分别用水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇依次洗脱，洗脱液浓缩干燥后，收集30%及70%乙醇洗脱部位； C、取30%乙醇洗脱部位，采用硅胶色谱柱，以体积比为10:1~1:4的氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识各馏分并合并馏分，析出晶体，得到芍药苷纯品。
4.根据权利要求1所述的中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法，其特征在于芍药苷内酯的分离步骤如下: Α、萃取:称取该中药组合物植物药中间体，用20倍量水溶解，然后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂；B、大孔吸附树脂纯化:用DlOl大孔树脂将正丁醇萃取物粗分，分别用水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇依次洗脱，洗脱液浓缩干燥后，收集30%及70%乙醇洗脱部位； D、取70%乙醇洗脱部位，采用硅胶色谱柱，以体积比为10:1~1:2氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识各馏分并合并馏分，得到馏分Fr.rFr.9 ； E、取馏分Fr.3，经中压制备色谱分离，色谱柱为C18, 50 μ m，柱规格为26 X 310mm，以甲醇-水梯度洗脱，体积比10 =90^100:0，流速为25ml/min，检测波长为230nm，按照色谱峰收集芍药苷内酯，减压浓缩含芍药苷内酯的洗脱液，浓缩温度控制在500C，得到芍药苷内酯浓缩液； F、用制备液相色谱对芍药苷内酯浓缩液进行洗脱，色谱柱为C18，填料粒径为5μ m，规格为20X250mm，以乙腈-水梯度洗脱，体积比为24:76，流速为5ml/min，检测波长为230nm,按照色谱峰收集芍药苷内酯的洗脱液，50 V减压浓缩，得到芍药苷内酯纯品。
5.根据权利要求1所述的中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法，其特征在于芍药酮苷和甲基芍药苷的分离步骤如下: A、萃取:称取该中药组合物植物药中间体，用20倍量水溶解，然后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂； B、大孔吸附树脂纯化:用DlOl大孔树脂将正丁醇萃取物粗分，分别用水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇依次洗脱，洗脱液浓缩干燥后，收集30%及70%乙醇洗脱部位； D、取70%乙醇洗脱部位，采用硅胶色谱柱，以体积比为10:1~1:2氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识各馏分并 合并馏分，得到馏分Fr.rFr.9 ； E、取懼分Fr.3、Fr.4，经中压制备色谱分尚，色谱柱为C18, 50 y m，柱规格为26 X 310mm,以甲醇-水梯度洗脱，体积比10 =90^100:0，流速为25ml/min，检测波长为230nm，按照色谱峰从馏分Fr.3中收集芍药酮苷，从馏分Fr.4中收集甲基芍药苷，分别减压浓缩含芍药酮苷和甲基芍药苷的洗脱液，浓缩温度控制在50°C，得到芍药酮苷和甲基芍药苷浓缩液； F、用制备液相色谱分别对芍药酮苷和甲基芍药苷浓缩液进行洗脱，色谱柱为C18,填料粒径为5 μ m，规格为20 X 250mm，以乙腈-水梯度洗脱，体积比为25:75，流速为5ml/min，检测波长为230nm，分别按照色谱峰收集，50°C减压浓缩，得到芍药酮苷和甲基芍药苷纯品。
6.根据权利要求1所述的中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法，其特征在于苯甲酰芍药苷和没食子酰芍药苷的分离步骤如下: A、萃取:称取该中药组合物植物药中间体，用20倍量水溶解，然后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂； B、大孔吸附树脂纯化:用DlOl大孔树脂将正丁醇萃取物粗分，分别用水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇依次洗脱，洗脱液浓缩干燥后，收集30%及70%乙醇洗脱部位； D、取70%乙醇洗脱部位，采用硅胶色谱柱，以体积比为10:1~1:2氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识各馏分并合并馏分，得到馏分Fr.rFr.9 ； E、分别取馏分Fr.2、Fr.6，经中压制备色谱分离，色谱柱为C18, 50 μ m，柱规格为26X310mm,以甲醇-水梯度洗脱，体积比10:90~100:0，流速为25ml/min，检测波长为230nm，按照色谱峰从馏分Fr.2中收集苯甲酰芍药苷，从Fr.6中收集没食子酰芍药苷，分别减压浓缩含苯甲酰芍药苷和没食子酰芍药苷的洗脱液，浓缩温度控制在50°C，得到苯甲酰芍药苷和没食子酰芍药苷浓缩液；F、用制备液相色谱分别对苯甲酰芍药苷和没食子酰芍药苷浓缩液进行洗脱，色谱柱为C18，填料粒径为5 μ m，规格为20 X 250mm，以乙腈-水梯度洗脱，体积比为22:78，流速为5ml/min,检测波长为230nm，分别按照色谱峰收集，50°C减压浓缩，得到苯甲酰芍药苷和没食子酰芍药苷纯品。
7.根据权利要求1所述的中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法，其特征在于人参皂苷Rg1的分离步骤如下: A、萃取:称取该中药组合物植物药中间体，用20倍量水溶解，然后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂； B、大孔吸附树脂纯化:用DlOl大孔树脂将正丁醇萃取物粗分，分别用水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇依次洗脱，洗脱液浓缩干燥后，收集30%及70%乙醇洗脱部位； D、取70%乙醇洗脱部位，采用硅胶色谱柱，以体积比为10:1-1:2氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识各馏分并合并馏分，得到馏分Fr.rFr.9 ； E、取懼分Fr.7，经中压制备色谱分尚，色谱柱为C18, 50 u m,柱规格为26 X 310mm,以甲醇-水梯度洗脱，体积比10 =90^100:0，流速为25ml/min，检测波长为210nm，按照色谱峰收集人参皂苷Rg1，减压浓缩含人参皂苷Rg1的洗脱液，浓缩温度控制在50°C，得到人参皂苷Rg1浓缩液； F、用制备液相色谱对人参皂苷Rg1浓缩液进行洗脱，色谱柱为C18，填料粒径为5μ m，规格为20 X 250mm，以乙腈-水梯度洗脱，体积比为24:76，流速为5ml/min，检测波长为210nm，按照色谱峰收集，50°C减压浓缩，得到人参皂苷Rg1纯品。
8.根据权利要求1所述的中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法，其特征在于人参皂苷Re的分离步骤如下: A、萃取:称取该中药组合物植物药中间体，用20倍量水溶解，然后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂； B、大孔吸附树脂纯化:用DlOl大孔树脂将正丁醇萃取物粗分，分别用水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇依次洗脱，洗脱液浓缩干燥后，收集30%及70%乙醇洗脱部位； D、取70%乙醇洗脱部位，采用硅胶色谱柱，以体积比为10:1-1:2氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识各馏分并合并馏分，得到馏分Fr.rFr.9 ； E、取馏分Fr.8，经中压制备色谱分离，色谱柱为C18, 50 μ m,柱规格为26 X 310mm,以甲醇-水梯度洗脱，体积比10 =90^100:0，流速为25ml/min，检测波长为210nm，按照色谱峰收集人参皂苷Re，减压浓缩含人参皂苷Re的洗脱液，浓缩温度控制在50°C，得到人参皂苷Re浓缩液； F、用制备液相色谱对人参皂苷Re浓缩液进行洗脱，色谱柱为C18,填料粒径为5μ m,规格为20X250mm，以乙腈-水梯度洗脱，体积比为27:73，流速为5ml/min，检测波长为210nm，按照色谱峰收集，50°C减压浓缩，得到人参皂苷Re纯品。
9.根据权利要求1所述的中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法，其特征在于人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb2的分离步骤如下: A、萃取:称取该中药组合物植物药中间体，用20倍量水溶解，然后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂； B、大孔吸附树脂纯化:用DlOl大孔树脂将正丁醇萃取物粗分，分别用水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇依次洗脱，洗脱液浓缩干燥后，收集30%及70%乙醇洗脱部位； D、取70%乙醇洗脱部位，采用硅胶色谱柱，以体积比为10:1-1:2氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识各馏分并合并馏分，得到馏分Fr.rFr.9 ； E、取馏分Fr.9，经中压制备色谱分离，色谱柱为C18, 50 μ m,柱规格为26 X 310mm,以甲醇-水梯度洗脱，体积比10 =90^100:0，流速为25ml/min，检测波长为210nm，按照色谱峰分别收集人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb2,分别减压浓缩含人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb2的洗脱液，浓缩温度控制在50°C，分别得到人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb2浓缩液； F、用制备液相色谱分别对人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb2浓缩液进行洗脱，色谱柱为C18,填料粒径为5 μ m，规格为20 X 250mm，以乙腈-水梯度洗脱，体积比为28:72，流速为5ml/min,检测波长为210nm，分别按照色谱峰收集，50°C减压浓缩，得到人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb2纯品。
10.根据权利要求1所述的中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法，其特征在于2' -O-苯甲酰芍药苷的分离步骤如下: A、萃取:称取该中药组合物植物药中间体，用20倍量水溶解，然后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂； B、大孔吸附树脂纯化:用DlOl大孔树脂将正丁醇萃取物粗分，分别用水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇依次洗脱，洗脱液浓缩干燥后，收集30%及70%乙醇洗脱部位； D、取70%乙醇洗脱部位，采用硅胶色谱柱，以体积比为10:1-1:2氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识各馏分 并合并馏分，得到馏分Fr.rFr.9 ； E、取馏分Fr.2，经中压制备色谱分离，色谱柱为C18, 50 μ m，柱规格为26 X 310mm，以甲醇-水梯度洗脱，体积比10 =90^100:0，流速为25ml/min，检测波长为230nm，按照色谱峰收集2' -O-苯甲酰芍药苷，减压浓缩含2' -O-苯甲酰芍药苷的洗脱液，浓缩温度控制在50°C，得到2' -O-苯甲酰芍药苷浓缩液； F、用制备液相色谱对2，-O-苯甲酰芍药苷浓缩液进行洗脱，色谱柱为C18,填料粒径为5 μ m，规格为20 X 250mm，以乙腈-水梯度洗脱，体积比为51:49，流速为5ml/min，检测波长为230nm，按照色谱峰收集，50°C减压浓缩，得到2' -O-苯甲酰芍药苷纯品。
11.根据权利要求1所述的中药组合物植物药中间体中单萜及皂苷类成分的分离方法，其特征在于白芍苷R2的分离步骤如下: A、萃取:称取该中药组合物植物药中间体，用20倍量水溶解，然后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂； B、大孔吸附树脂纯化:用DlOl大孔树脂将正丁醇萃取物粗分，分别用水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇依次洗脱，洗脱液浓缩干燥后，收集30%及70%乙醇洗脱部位； D、取70%乙醇洗脱部位，采用硅胶色谱柱，以体积比为10:1-1:2氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识各馏分并合并馏分，得到馏分Fr.rFr.9 ； E、取馏分Fr.5，经中压制备色谱分离，色谱柱为C18, 50 μ m，柱规格为26 X 310mm，以甲醇-水梯度洗脱，体积比10 =90^100:0，流速为25ml/min，检测波长为230nm，按照色谱峰收集白芍苷R2，减压浓缩含白芍苷R2的洗脱液，浓缩温度控制在50°C，得到白芍苷R2浓缩液； F、用制备液相色谱对白芍苷R2浓缩液进行洗脱，色谱柱为C18，填料粒径为5μ m，规格为20 X 250mm，以乙腈-水梯度洗脱，体积比为20:80，流速为5ml/min，检测波长为230nm，按照色谱峰收集， 50 V减压浓缩，得到白芍苷R2纯品。
【文档编号】C07J17/00GK104072550SQ201310266771
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年6月29日 优先权日:2013年3月25日
【发明者】付强, 王曙宾 申请人:河北以岭医药研究院有限公司