一种利用温度诱导双水相体系分离纯化芦丁的方法
【专利摘要】一种利用温度诱导双水相体系分离纯化芦丁的方法，包括以下步骤：(1)将槐米粉碎后经饱和石灰水浸泡，再经超声提取，过滤，向滤液中加入盐酸调节pH值为3～4，过滤析出的沉淀，沉淀经少量的水洗涤三次，在60℃以下干燥即得芦丁粗品；(2)将EOPO和水按体积比1～3∶1～4混合，然后向其中加入盐，混合均匀，向溶液中加入芦丁粗品，混合均匀后，离心分离水相和富含EOPO的有机相；(3)将步骤(2)得到的有机相在50～70℃水浴10～30min，溶液自动分成两相，离心分离有机相和水相，芦丁在水相富集，EOPO在有机相富集并得以回收；(4)将步骤(3)得到的水相冷却至室温，放置过夜，析出结晶，过滤得到芦丁纯品。该方法经济、环保、低能耗，且能最大程度地获得高纯度芦丁。
【专利说明】一种利用温度诱导双水相体系分离纯化芦丁的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用温度诱导双水相体系分离纯化芦丁的方法，属于生物化工【技术领域】。
【背景技术】
[0002]芦丁是黄酮类化合物，易溶解于热水、热乙醇中。以往提取芦丁时通常采用的方法是碱提取酸沉淀法。该方法是利用芦丁具有酸性，可与碱成盐而溶于水，加酸使成酸性后，其游离析出的原理，再经重结晶得到较纯的芦丁。该方法虽然多年来一直被视为较理想的方法，但由于是加热提取，常有一定的水解产物存在，产率较低(一般为9%?13% )。
[0003]专利文献CN101081859公开的一种芦丁提取方法，芦丁粗品用乙醇和醋酸乙酯的混合物搅拌，过滤，将上述滤液进行吸附，洗柱，浓缩洗脱液回收乙醇，离心过滤,烘干。专利文献CN1410423公开的一种提取芦丁的工艺，将芦丁溶剂提取，溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或甲醛，提取滤液用吸附柱进行吸附，吸附柱为聚酰胺柱、氧化铝柱、凝胶柱、葡聚糖凝胶柱、纤维素粉柱、硅胶柱、大孔吸附树脂柱、离子交换树脂柱，用乙醇、甲醇、蒸馏水、甲醛中的一种或两种洗柱，洗脱液经蒸馏浓缩回收溶剂，离心过滤，80°C以下烘干得精品芦丁。
[0004]双水相萃取技术是一种新型的分离技术，亲水性聚合物水溶液在一定条件下可以形成双水相体系，通过被分离物在两相中分配不同，便可实现分离。该技术自研究开发以来，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。双水相萃取技术设备投资少，操作简单，且不存在有机溶剂残存问题，因此在天然药物分离与提取中也有良好的应用前景。但是，由于聚合物回收困难，所以在一定程度上阻碍了双水相技术的应用。.
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种利用温度诱导双水相体系分离纯化芦丁的方法，该方法经济、环保、低能耗，且能最大程度地获得高纯度芦丁，并能应用于工业化生产。
[0006]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]—种利用温度诱导双水相体系分离纯化芦丁的方法，该方法包括以下步骤:
[0008](I)提取芦丁粗品:将槐米粉碎后经饱和石灰水浸泡30?40min，再经频率20kHz的超声提取20?60min，过滤；药渣重复提取一次，合并两次滤液，向滤液中加入盐酸调节PH值为3?4，过滤析出的沉淀，沉淀经少量的水洗涤三次，在60°C以下干燥即得芦丁粗品;
[0009](2)双水相分离:将环氧乙烷-环氧丙烷共聚物和水按体积比I?3:1?4混合，然后向其中加入盐，混合均匀，所得溶液中盐的浓度为0.1?0.2g/mL,向溶液中按2.0?
5.0mg/mL的量加入芦丁粗品，混合均勻后，以转速为1000?2000r/min离心分离2?5min,分离水相和富含环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的有机相，芦丁在有机相富集，杂质在水相富集；[0010](3)温度诱导双水相分离:将步骤⑵得到的有机相在50?70°C水浴10?30min,溶液自动分成两相，以转速为1000?2000r/min离心分离3?5min,分离有机相和水相，芦丁在水相富集，环氧乙烷-环氧丙烷共聚物在有机相富集并得以回收；
[0011](4)浓缩干燥:将步骤(3)得到的水相冷却至室温，放置过夜，析出结晶，过滤得到芦丁纯品。
[0012]在本发明的方法中，常温下环氧乙烷-环氧丙烷共聚物(EOPO)与盐水溶液形成双水相体系，将芦丁富集到EOPO相。由于EOPO具有较低的浊点，升高EOPO相温度，当温度上升至EOPO的浊点温度以上时，溶液自动分成水相和有机相，芦丁再次分配到水相，而富含EOPO的有机相得以回收。
[0013]其中，所述步骤(I)中的槐米粉碎至30?60目。所述步骤(2)中的EOPO平均分子量优选为2000?3000。所述的盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或无水硫酸钠。EOPO与水的体积比优选为 1: 1、1: 2、1: 3、1: 4、2: 3、3: 2 或 3: 4。
[0014]在温度诱导双水相分离过程中，操作环境始终保持在EOPO的浊点以上的温度，即离心分离过程中的体系温度保持在50?70°C，优选控制为60°C，离心分离过程可以分两次操作。
[0015]本发明的优点在于:
[0016]本发明采用EOPO/盐双水相分配结合温度诱导相分离从天然植物槐米中提取芦丁，与以往采用的聚乙二醇的双水相体系分离纯化过程相比，双水相分相迅速，且没有乳化层，同时富含EOPO的一相可以回收并循环使用，工艺环保、操作简单、降低物耗。
[0017]本发明采用的EO PO的浊点与芦丁产物的溶解度匹配适当，所得芦丁产品纯度较闻。
【具体实施方式】
[0018]以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例中所使用的试剂均为试剂级。
[0019]实施例1
[0020]I)提取芦丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL烧杯中，加水200mL饱和石灰水浸泡30min，采用频率20kHz的超声提取30min，过滤；药渣重复提取一次，合并两次滤液，加盐酸调节PH值为3，析出芦丁，抽滤，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得芦丁粗品16.6g，含量为38.3%。
[0021]2)双水相分离:配制EOPO/盐双水相体系，其中EOPO (分子量2000) IOmLjjC 15mL，磷酸氢二钾的浓度为0.lg/mL。向该双水相体系中加入芦丁粗品2mg/mL，混合均匀后，以转速为2000r/min离心分离3min，分离有机相(富含Ε0Ρ0) 20.2mL和水相4.1mL,芦丁在有机
相富集，杂质在水相富集。
[0022]3)温度诱导双水相分离:对有机相(富含Ε0Ρ0)进行温度诱导相分离。在60°C水浴IOmin后，溶液自动分成两相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在离心机中以转速2000r/min离心分离5min,分离有机相(富含Ε0Ρ0) 14.7mL和水相5.2mL,芦丁在水相富集
2.7mg/mL，有机相EOPO得以回收。
[0023]4)水相冷却至室温，放置过夜，析出结晶，过滤得到芦丁纯品12.6mg，纯度为92.8%，收率为 61.1%。
[0024]实施例2
[0025]I)提取芦丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL烧杯中，加水200mL饱和石灰水浸泡30min，采用频率20kHz的超声提取30min，过滤；药渣重复提取一次，合并两次滤液，加盐酸调节PH值为3，析出芦丁，抽滤，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得芦丁粗品16.6g，含量为38.3%。
[0026]2)双水相分离:配制EOPO/盐双水相体系，其中EOPO (分子量2500) IOmLjjC 15mL，磷酸氢二钾的浓度为0.lg/mL。向该双水相体系中加入芦丁粗品2mg/mL，混合均匀后，以转速为2000r/min离心分离3min，分离有机相(富含Ε0Ρ0) 18.2mL和水相5.7mL,芦丁在有机
相富集，杂质在水相富集。
[0027]3)温度诱导双水相分离:对有机相(富含Ε0Ρ0)进行温度诱导相分离。在60°C水浴IOmin后，溶液自动分成两相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在离心机中以转速2000r/min离心分离5min,分离有机相(富含Ε0Ρ0) 9.3mL和水相8.3mL,芦丁在水相富集
1.4mg/mL，有机相EOPO得以回收。
[0028]4)水相冷却至室温，放置过夜，析出结晶，过滤得到芦丁纯品10.7mg,纯度为94.0%，收率为 52.5%0
[0029]实施例3
[0030]I)提取芦丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL烧杯中，加水200mL饱和石灰水浸泡30min，采用频率20kHz的超声提取30min，过滤；药渣重复提取一次，合并两次滤液，加盐酸调节PH值为3，析出芦丁，抽滤，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得芦丁粗品16.6g，含量为38.3%。
[0031]2)双水相分离:配制EOPO/盐双水相体系，其中EOPO (分子量2750) IOmLjjC 15mL，磷酸氢二钾的浓度为0.lg/mL。向该双水相体系中加入芦丁粗品2mg/mL，混合均匀后，以转速为2000r/min离心分离3min，分离有机相(富含Ε0Ρ0) 19.0mL和水相5.3mL,芦丁在有机
相富集，杂质在水相富集。
[0032]3)温度诱导双水相分离:对有机相(富含Ε0Ρ0)进行温度诱导相分离。在60°C水浴IOmin后，溶液自动分成两相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在离心机中以转速2000r/min离心分离5min,分离有机相(富含Ε0Ρ0) 13.1mL和水相5.3mL,芦丁在水相富集
2.lmg/mL，有机相EOPO得以回收。
[0033]4)水相冷却至室温，放置过夜，析出结晶，过滤得到芦丁纯品10.lmg，纯度为
93.9%，收率为 49.5%。
[0034]实施例4
[0035]I)提取芦丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL烧杯中，加水200mL饱和石灰水浸泡30min，采用频率20kHz的超声提取30min，过滤；药渣重复提取一次，合并两次滤液，加盐酸调节PH值为3，析出芦丁，抽滤，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得芦丁粗品16.6g，含量为38.3%。
[0036]2)双水相分离:配制EOPO/盐双水相体系，其中EOPO (分子量2000) IOmLjjC 15mL，磷酸二氢钾的浓度为0.lg/mL。向该双水相体系中加入芦丁粗品2mg/mL，混合均匀后，以转速为2000r/min离心分离3min，分离有机相(富含Ε0Ρ0) 17.0mL和水相7.7mL,芦丁在有机相富集，杂质在水相富集。
[0037]3)温度诱导双水相分离:对有机相(富含Ε0Ρ0)进行温度诱导相分离。在60°C水浴IOmin后，溶液自动分成两相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在离心机中以2000r/min离心分离5min,分离有机相(富含Ε0Ρ0) 4.6mL和水相12.1mL,芦丁在水相富集0.8mg/mL,有机相EOPO回收量较少。
[0038]4)水相冷却至室温，放置过夜，析出结晶，过滤得到芦丁纯品8.6mg,纯度为
92.7%，收率为 41.6%。
[0039]实施例5
[0040]I)提取芦丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL烧杯中，加水200mL饱和石灰水浸泡30min，采用频率20kHz的超声提取30min，过滤；药渣重复提取一次，合并两次滤液，加盐酸调节PH值为3，析出芦丁，抽滤，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得芦丁粗品16.6g，含量为38.3%。
[0041]2)双水相分离:配制EOPO/盐双水相体系，其中EOPO (分子量2000) IOmLjjC 15mL，Na2SO4的浓度为0.lg/mL。向该双水相体系中加入芦丁粗品2mg/mL,混合均勻后，以转速为2000r/min离心分离3min,分离有机相(富含Ε0Ρ0) 13.6mL和水相9.1mL,芦丁在有机相富
集，杂质在水相富集。
[0042]3)温度诱导双水相分离:对有机相(富含Ε0Ρ0)进行温度诱导相分离。在60°C水浴IOmin后，溶液自动分成两相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在离心机中以2000r/min离心分离5min,分离有机相 (富含Ε0Ρ0) 1.6mL和水相11.2mL,芦丁在水相富集0.7mg/mL,有机相EOPO回收量较少。
[0043]4)水相冷却至室温，放置过夜，析出结晶，过滤得到芦丁纯品7.4mg,纯度为
93.9%，收率为 36.3%0
[0044]实施例6
[0045]I)提取芦丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL烧杯中，加水200mL饱和石灰水浸泡30min，采用频率20kHz的超声提取30min，过滤；药渣重复提取一次，合并两次滤液，加盐酸调节PH值为3，析出芦丁，抽滤，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得芦丁粗品16.6g，含量为38.3%。
[0046]2)双水相分离:配制EOPO/盐双水相体系，其中EOPO (分子量2000) IOmLjjC 10mL，磷酸氢二钾的浓度为0.lg/mL。向该双水相体系中加入芦丁粗品2mg/mL，混合均匀后，以转速为2000r/min离心分离3min，分离有机相(富含Ε0Ρ0) 13.7mL和水相4.4mL,芦丁在有机
相富集，杂质在水相富集。
[0047]3)温度诱导双水相分离:对有机相(富含Ε0Ρ0)进行温度诱导相分离。在60°C水浴IOmin后，溶液自动分成两相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在离心机中以2000r/min离心分离5min,分离有机相(富含E0P0)9.5mL和水相3.3mL,芦丁在水相富集3.0mg/mL,有机相EOPO得以回收。
[0048]4)水相冷却至室温，放置过夜，析出结晶，过滤得到芦丁纯品8.0mg,纯度为92.3%，收率为 38.6%。
[0049]实施例7
[0050]I)提取芦丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL烧杯中，加水200mL饱和石灰水浸泡30min，采用频率20kHz的超声提取30min，过滤；药渣重复提取一次，合并两次滤液，加盐酸调节PH值为3，析出芦丁，抽滤，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得芦丁粗品16.6g，含量为38.3%。
[0051]2)双水相分离:配制EOPO/盐双水相体系，其中EOPO (分子量2000) 15mL，水10mL，磷酸氢二钾的浓度为0.lg/mL。向该双水相体系中加入芦丁粗品2mg/mL，混合均匀后，以转速为2000r/min离心分离3min，分离有机相(富含Ε0Ρ0) 13.1mL和水相5.2mL,芦丁在有机
相富集，杂质在水相富集。
[0052]3)温度诱导双水相分离:对有机相(富含Ε0Ρ0)进行温度诱导相分离。在60°C水浴IOmin后，溶液自动分成两相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在离心机中以2000r/min离心分离5min,分离有机相(富含Ε0Ρ0) 5.3mL和水相6.9mL,芦丁在水相富集2.6mg/mL,有机相EOPO得以回收。
[0053]4)水相冷却至室温，放置过夜，析出结晶，过滤得到芦丁纯品14.6mg，纯度为92.4%，收率为 70.4%。.
【权利要求】
1.一种利用温度诱导双水相体系分离纯化芦丁的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)提取芦丁粗品:将槐米粉碎后经饱和石灰水浸泡30?40min，再经频率20kHz的超声提取20?60min，过滤；药渣重复提取一次，合并两次滤液，向滤液中加入盐酸调节pH值为3?4，过滤析出的沉淀，沉淀经少量的水洗涤三次，在60°C以下干燥即得芦丁粗品； (2)双水相分离:将环氧乙烷-环氧丙烷共聚物和水按体积比I?3: I?4混合，然后向其中加入盐，混合均匀，所得溶液中盐的浓度为0.1?0.2g/mL,向溶液中按2.0?5.0mg/mL的量加入芦丁粗品，混合均勻后，以转速为1000?2000r/min离心分离2?5min,分离水相和富含环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的有机相，芦丁在有机相富集，杂质在水相富集; (3)温度诱导双水相分离:将步骤(2)得到的有机相在50?70°C水浴10?30min，溶液自动分成两相，以转速为1000?2000r/min离心分离3?5min，分离有机相和水相，芦丁在水相富集，环氧乙烷-环氧丙烷共聚物在有机相富集并得以回收； (4)浓缩干燥:将步骤(3)得到的水相冷却至室温，放置过夜，析出结晶，过滤得到芦丁纯品。
2.根据权利要求1所述的利用温度诱导双水相体系分离纯化芦丁的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的槐米粉碎至30?60目。
3.根据权利要求1所述的利用温度诱导双水相体系分离纯化芦丁的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的平均分子量为2000?3000。
4.根据权利要求1所述的利用温度诱导双水相体系分离纯化芦丁的方法，其特征在于，所述的盐为磷酸 氢二钾、磷酸二氢钾或无水硫酸钠。
5.根据权利要求1所述的利用温度诱导双水相体系分离纯化芦丁的方法，其特征在于，所述步骤(2)中环氧乙烷-环氧丙烷共聚物与水的体积比为1: 1、1: 2、1: 3、1: 4、2: 3、3: 2或3: 4。
【文档编号】C07D311/40GK103435585SQ201310339629
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月6日 优先权日:2013年8月6日
【发明者】霍清, 缪刚, 杨宏伟 申请人:北京联合大学生物化学工程学院