纤溶活性化合物fgfc1的分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种从发酵液中分离纯化FGFC1的方法。所述方法包括步骤：（1）将FGFC1菌丝体和碱性水溶液混合、抽提，得到抽提液；（2）将抽提液和有机溶剂混合后上柱经大孔聚合物填料层析，用有机溶剂与水的碱性混合溶液洗脱，得到FGFC1馏分。
【专利说明】纤溶活性化合物FGFC1的分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及发酵液的分离纯化，尤其涉及一种从发酵液中分离纯化FGFCl的方 法。
【背景技术】
[0002] FGFCl是一种具有纤溶活性的微生物天然产物，由海洋真菌长孢葡萄穗霉 Stachybotrys longispora FG216(CCTCC NO. C22010068)发酵产生，活性研究表明，其具有 促进纤溶酶原和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂相互活化的作用，有望开发成为药物，具有 良好的应用前景。
[0003] 现有文献报道的分离纯化方法为：
[0004] 甲醇抽提发酵液后用HPLC分离制备，具体工艺如下：FGFCl发酵液与等体积甲醇 混合，超声15min，在转速IOOOOrpm条件下离心15min，所得上清液减压浓缩、真空干燥得到 含有FGFCl的干固物，而后用少量甲醇溶解，溶解后的溶液用半制备型高效液相色谱仪，色 谱柱Sepax HP-C18柱（21. 2mmX 250mm, 10 μ m)分离，色谱条件为：流动相：A相：0· 05M乙酸 铵；B相：甲醇；A :B=30 :70。洗脱条件为：流速10ml/mim，进样量为0. 5ml，检测波长265nm。
[0005] 该方法存在以下不足：
[0006] (1)用甲醇进行抽提，成本较高；且甲醇具有一定毒性；
[0007] (2)使用粒径为10 μ m的反相C18填料进行层析，属于高压色谱，对设备要求较高； 层析填料化学稳定性差，不耐酸碱，易污染。层析流动相中含有无机盐乙酸铵，给FCFGl的 后续精制过程增加了难度。
[0008] 综上所述，该方法不适于规模化的制备FGFCl。
[0009] 因此，本领域迫切需要提供一种从海洋真菌长孢葡萄穗霉Stachybotrys longispora FG216 (CCTCC NO. C22010068)的发酵液中分离纯化纤溶活性化合物FGFCl的 方法。
【发明内容】
[0010] 本发明旨在提供一种从发酵液中分离纯化FGFCl的方法。
[0011] 本发明提供了一种从发酵液中分离纯化FGFCl的方法，所述方法包括步骤：
[0012] (1)将FGFCl菌丝体和碱性水溶液混合、抽提，固液分离后得到抽提液；和
[0013] (2)将抽提液和有机溶剂混合后上柱经大孔聚合物填料层析，用有机溶剂与水的 碱性混合溶液洗脱，得到FGFCl馏分。
[0014] 在另一优选例中，所述大孔聚合物填料为非极性大孔聚合物填料。
[0015] 在另一优选例中，所述的非极性聚合物填料的骨架选自聚苯乙烯-二乙烯苯或甲 基丙烯酸酯；更优选聚苯乙烯-二乙烯苯。
[0016] 在另一优选例中，所述大孔聚合物填料粒径为30-200 μ m ;更优选30-150 μ m。
[0017] 在另一优选例中，步骤（1)中所述碱性水溶液为可溶性无机碱的水溶液；更优选， 所述可溶性无机碱的水溶液选自氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。
[0018] 在另一优选例中，步骤（1)中所述碱性水溶液的pH为8-14 ;更优选为PH11-13。
[0019] 在另一优选例中，步骤（2)中以所述有机溶剂与水的碱性混合溶液的总体积计，其 中含有有机溶剂20-80% ;更优选为30-60%。
[0020] 在另一优选例中，以抽提液和有机溶剂的混合溶液的总体积计，其中含有有机溶 剂5-35% ;更优选为15-30%。
[0021] 在另一优选例中，步骤（2)中所述抽提液和有机溶剂的混合溶液的pH为4-12 ;更 优选pH为6. 5。
[0022] 在另一优选例中，所述方法还包括步骤：经HPLC测定后，将HPLC峰纯度> 95%的 FGFCl馏分进行收集，得到FGFCl的纯化液。
[0023] 在另一优选例中，所述方法还包括步骤：将收集得到的FGFCl的HPLC纯度大于等 于95%的馏分，通过减压蒸发去除有机溶剂得到水溶液，所得水溶液冷冻干燥后得到FGFCl 的干粉。
[0024] 在另一优选例中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或乙腈；更优选乙 醇。
[0025] 据此，本发明提供了一种从海洋真菌长孢葡萄穗霉Stachybotrys Iongispora FG216 (CCTCC NO. C22010068)的发酵液中分离纯化纤溶活性化合物FGFCl的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1显示了实施例制备得到的FGFCl的MS图谱。
【具体实施方式】
[0027] 发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现将FGFCl发酵液的菌丝体经过碱性水 溶液抽提、大孔聚合物填料层析，可简单有效地得到高纯度的FGFCl。
[0028] 如本文所用，"FGFC1"是指分子式为C51H68N 2Oltl的物质，其结构式为：
[0029]
【权利要求】
1. 一种从发酵液中分离纯化FGFC1的方法，其特征在于，所述方法包括步骤： (1) 将FGFC1菌丝体和碱性水溶液混合、抽提，固液分离后得到抽提液； (2) 将抽提液和有机溶剂混合后上柱经大孔聚合物填料层析，用有机溶剂与水的碱性 混合溶液洗脱，得到FGFC1馏分。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔聚合物填料为非极性大孔聚合物 填料。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的非极性聚合物填料的骨架选自聚苯 乙烯-二乙烯苯或甲基丙烯酸酯；优选聚苯乙烯-二乙烯苯。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔聚合物填料粒径为30-200 y m ;优 选 30-150 u m。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中所述碱性水溶液为可溶性无机碱 的水溶液。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述可溶性无机碱的水溶液选自氢氧化钠 水溶液或氢氧化钾水溶液。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中所述碱性水溶液的pH为8-14 ; 优选 pHll-13。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中以所述有机溶剂与水的碱性混合 溶液的总体积计，其中含有有机溶剂20-80 % ;优选30-60 %。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，以抽提液和有机溶剂的混合溶液的总体积 计，其中含有有机溶剂5-35% ;优选15-30%。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抽提液和有机溶剂的混合溶液的pH为 4-12 ;优选 pH 为 6. 5。
11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：将HPLC峰纯度 彡95%的FGFC1馏分进行收集，得到FGFC1的纯化液。
12. 如权利要求1-11任一所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异 丙醇、丙酮或乙腈；优选乙醇。
【文档编号】C07D519/00GK104418868SQ201310379733
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月27日
【发明者】刘永双, 那可, 赵文杰, 赵波, 马川川, 魏晓东, 张守雨 申请人:上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院