一种大丽轮枝菌的致病相关蛋白VdSENP1及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种大丽轮枝菌致病相关蛋白VdSENP1及其编码基因与应用。该蛋白VdSENP1，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1）序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的蛋白和其编码基因对培育抗黄萎病棉花，以及提高棉花产量和品质具有十分重要的意义。
CGMCC NO8056
20130813
【专利说明】-种大丽轮枝菌的致病相关蛋白VdSENPI及其编码基因
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种大丽轮枝菌（Verticillium d址liae Kleb.)致病相关蛋白及其编码基因。
【背景技术】
[0002] 由±壤丝状真菌大丽轮枝菌（Verticillium d址liae Kleb.)所引起的棉花黄萎 病是威胁棉花生产的主要病害，多年来一直严重影响着我国棉花的品质和产量。棉花黄萎 病1914年始见于美国的费吉尼亚州，随后在其它州和世界各植棉国先后发现（沈其益， 1992)，1935年随引进美棉品种传入我国，但危害不重。到二十世纪50年代W后，黄萎病在 我国南北局部棉区陆续发生，扩散蔓延速度加快。80年代末，黄萎病已遍及全国478个植棉 县（市）。进入90年代W来，我国棉花黄萎病扩展蔓延迅猛，尤其是1993, 1995, 1996,2002 年在全国范围内连续大发生，损失严重。至今，我国大部分主产棉区己成为黄萎病重病区。
[0003] 黄萎病致病菌大丽轮枝菌（Verticillium d址liae Kleb.)，属半知菌亚口，丛梗 抱目，淡色抱科，轮枝菌属。大丽轮枝菌的寄主范围很广，涉及十字花科、醫薇科、豆科、茄 科、唇形花科、菊科等，目前已达660多种植物，并且还在逐年扩大。关于棉花黄萎病的致病 机制有多种解释，其中W导管堵塞和中毒两种观点为主。60年代人们对该病菌致病机制的 认识是由于菌体在导管内定殖，并大量繁殖，同时刺激邻近的薄壁细胞产生胶状物质及侵 填体而堵塞导管，阻碍水分的运转，从而导致棉株萎焉（Garber, 1966)。马远莉等（1990)对 棉花各部位黄萎病菌在导管中的分布情况研究后认为，正常的次生木质部导管的潜在输水 能力远远超过植物的总需水量，而且被堵塞的导管数占整个维管束的比例不大（最大的有 17. 7%)，因此导管堵塞不是导致棉花萎焉的主要原因。Keen等（1972)认为，黄萎病菌在代 谢过程中产生的毒素为有毒的蛋白质，是一种酸性蛋白质一脂多糖的复合体。该复合物对 感病棉花品种的叶片与根组织的细胞膜具有破坏作用，使细胞内r和Na+大量渗漏。而抗 病品种的细胞膜不具备毒素作用的受体位点而不受毒素破坏。Wang等（2004)从黄萎病原 菌的菌丝中分离到一个新的具有对棉花叶片有致萎作用的蛋白VdNEP。该蛋白可W诱导烟 草叶片形成坏死斑，也可W使拟南芥产生抗病反应，因此该蛋白可能参与了黄萎病菌对棉 花侵染时的互作反应。但目前尚不清楚该蛋白是否与W前己分离的毒素蛋白是同一物质。 现在越来越多的研究表明，黄萎病菌分泌的毒素是导致黄萎病的关键生化因子，同时组织 导管的阻塞影响水分运输可能加剧了病症的产生。
[0004] 大丽轮枝菌是一种±传真菌，在干燥恶劣的环境下能够产生其休眠结构微菌核， 从而在±壤中存活多年。所W微菌核的形成与其致病性息息相关。2004年，Dobinson KF 等值obinson, K. F. , et al. , 2004)利用改造了的EZ: :TN转座系统，对来源于番茄的大丽轮 枝菌的膜蛋白酶VTP1成功的进行了定向敲除。该基因能够促进微菌核的形成，但是敲除 W后没有影响其致病性及生长特性。2005年，Dobinson KF等对来源于窝宦和番茄的大丽 轮枝菌的细胞分裂素活化蛋白激酶基因VMK1进行了敲除。敲除VMK1后菌株对各种宿主 的致病性严重衰退，说明MAP激酶介导的信号通路在真菌致病性上起着重要作用。并且基 因的敲除减少了抱子的产生和微菌核的形成，说明该基因可能参与多个细胞进程。2006年 Dobinson KF等化limes, A,et al, 2006)又利用此系统对来源于番茄的大丽轮枝菌的类型 2疏水蛋白基因VDH1进行了敲除。该基因的敲除减少了微菌核的产生，但不影响其致病性。 对抱子的产生也没有影响，但影响了抱子对干燥环境的耐受力。说明VDH1基因的功能是多 方面的，可能与大丽轮枝菌在±壤中长期的生存有关。2008年Dobinson KF等又研究了在 微菌核的形成过程中VDH1基因的调控和表达，发现VDH1基因在微菌核、菌丝融合体及抱子 中特异表达，进一步证明了该基因与微菌核的形成相关。
[0005] 由于棉花黄萎病危害的严重性和寄主的广泛性，世界上不少国家的科技工作者对 其进行了深入研究。植物在与病原物的长期协同进化过程中获得了一系列复杂的防御机制 保护自己，抗性表现为组成型抗性和诱导型抗性，诱导型抗性又包括组织结构抗性和生理 生化抗性。对黄萎病抗性不同的棉花品种在组织结构方面存在一定差异，己被国内外不少 研究证实。抗病品种木质部的细胞间隙较小，细胞壁较厚，且木质部中含有较多的髓射线。 另外，抗病品种的导管腔和木质部的纤维腔直径小于感病品种，说明棉花品种对黄萎病的 抗性与其具有坚实的木质部有关。棉花的生理生化抗病性方面己有过较多的研究，研究较 多的抗病相关因子包括：植保素、单宁、可溶性糖、氨基酸及多种酶类。棉株在遭受病菌侵 袭后，内部产生多种抑菌物质，主要包括棉酷、植保素、单宁等，另外还与一些酶类、蛋白W 及小分子物质如化。它们的作用是非专化性，与植物的基础抗性相关。棉花抗黄萎病的 机制是一个非常复杂的问题，涉及的因素众多，因此不断深入研究该些抗病反应产物在基 因表达水平上的规律，对于进一步深入了解抗病机制和利用基因工程手段改造棉花品种抗 性具有重要意义。
[0006] 抗病基因的获得是选育抗病品种的重要基础，目前通过分子生物学手段己经克隆 的植物抗病基因大概有39个W上，其中抗病原真菌的大概有20多个，如拟南芥抗白粉病基 因RPW8,番茄抗枯萎病基因Ve，高梁抗普通镑病（Puccinia Sor曲i)基因化1-D，且在海岛 棉上已经克隆了 NBS-LRR类抗病基因。在常规育种上，国内外棉花育种者一直重视抗源的 筛选和创造。1983-1986年李成谋等161对911份陆地棉资源进行了抗黄萎病鉴定，筛选了 抗性较好的一批抗（耐）病品种。K. V. Srinvasin鉴定了 126个海岛棉品种的抗性，结果显 示表现耐病和抗病的占85%。无论是通过常规方法寻找抗源，还是通过分子生物学手段克 隆抗病基因都已经取得了一定的进展，但还没有找到真正防治棉花黄萎病的有效办法。根 本原因在于棉花等作物遗传背景复杂，很难在分子水平进行更深入的研究，另外黄萎病菌 (大丽轮枝菌，Veriicillium d址liae)小种分化变异性强等原因也为抗病遗传育种带来重 重困难。因此，研究棉花黄萎病病原大丽轮枝菌与寄主植物互作的分子机理就至关重要。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种来自大丽轮枝菌Veriicillium d址liae的致病相关 蛋白，名称为 VdSENPl(Sentrin-specific Proteasel)。
[0008] 本发明提供的致病相关蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：
[0009] 1)序列表中的SEQ ID Ns . 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010] 2)将序列表中的SEQ ID Ns. 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且与真菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。
[0011] 所述真菌具体为大丽轮枝菌。
[0012] 序列表中SEQ ID Ns . 2所示的氨基酸序列由1064个氨基酸残基组成。
[001引上述1)和2)中的VdSENPl蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物 表达得到。上述1)和2)中的VdSENPl蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQ ID Ns . 1的 第383-3577位核巧酸所示的DM序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一 个或几个碱基对的错义突变后得到。
[0014] 编码所述VdSENPl蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[00巧]所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可W 是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0016] 本发明的又一个目的是提供所述蛋白的编码基因。
[0017] 所述编码基因具有下述核巧酸序列之一：
[0018] 1)序列表中SEQ ID Ns ;1的第383-3577位核巧酸所示的核巧酸序列；
[0019] 2)序列表中SEQ ID Ns . 1所示的核酸序列；
[0020] 3)编码序列表中SEQ ID Ns ;2蛋白质序列的多核巧酸序列；
[0021] 4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID Ns ;1限定的DNA序列杂交的核巧酸序 列；
[002引 5)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90% W上同源性，且编码相同功能 蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95% W上；再具体的为96% W上；再具体的为97% W上；再具体的为98% W上；再具体的为99% W上。
[0023] 上述高严谨条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1%SDS 和 1 X SSC，0. 1%SDS 各洗膜一次。
[0024] 其中，序列表中的SEQ ID Ns ;1由3836个核巧酸组成，其开放阅读框架（0RF)为 自5'末端第383-3577位核巧酸，编码序列表中SEQ ID Ns ;2所示的蛋白质，即本发明所 述的VdSENPl蛋白。
[00巧]含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的 保护范围。
[0026] 所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0027] 所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的 3'端非翻译区域，即包含聚腺巧酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。 所述聚腺巧酸信号可引导聚腺巧酸加入到mRNA前体的3'端。使用所述基因构建重组表达 载体时，在其转录起始核巧酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动 子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载 体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。
[0028] 扩增本发明所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明保护的范围。
[0029] 本发明的另一个目的是提供本发明所述蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重 组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在在提高大丽轮枝菌的致病性中的应用。
[0030] 本发明的再一个目的是提供一株致病性降低的大丽轮枝菌，其保藏编号为CGMCC NO. 8056。
[0031] 抑制大丽轮枝菌中本发明所提供的蛋白的表达或抑制大丽轮枝菌中本发明所提 供的编码基因的表达的方法或产品在降低大丽轮枝菌的致病性中的应用也属于本发明保 护的范围。
[0032] 本发明所提供的蛋白或任一本发明所提供的编码基因作为祀点在降低大丽轮枝 菌的致病性中的应用也属于本发明保护的范围。
[0033] 所述致病性是指引起棉花的黄萎病。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1为突变菌株vdsenpl与野生型菌株592致病性比较图示。
[00巧]图2为突变菌株vdse吨1与野生型菌株592在PDA培养基上生长性状的比较图示。
[0036] 图3为突变菌株vdsenpl与野生型菌株592在查氏培养基中生长性状的比较图 /J、- 〇
[0037] 图4为突变菌株vdsenpl的southern杂交图示。
[0038] 图5为突变菌株vdsenpl经过互补试验获得的互补菌株vdsenpl/VdSENPl的 southern 和 no;rthe;rn 鉴定结果图。
[0039] 图6为突变菌株vdse吨1经过互补试验获得的互补菌株vdsenpl/VdSENPl的致病 性鉴定图示。
[0040] 图7为菌丝及抱子中VdSENPl基因表达水平的nodhern杂交检测结果图。
[0041] 图8为菌核期及棉花汁液诱导条件下，VdSENPl基因表达水平的nodhern杂交检 测结果图。
[0042] 图9不同的环境胁迫及高渗胁迫下，VdSENPl基因表达水平的nodhern杂交检测 结果图。
【具体实施方式】
[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045] 实施例1、大丽轮枝菌（Verticillium d址liae Kleb.)致病基因VdSENPl的制备
[0046] 提取大丽轮枝菌野生型菌株592 (菌株592采自新疆棉花田，记载该材料的文献是 棉花植株内黄萎病菌致病类型的快速检测.新疆农业科学2010,47 (4) =827-831，公众可从 中国科学院微生物研究所获得）的RNA，反转录为cDNA，并W该cDNA为模板，用下述引物1 和引物2进行RT-PCR扩增：
[0047] 弓I物 1 :此CCGGG ATGGGGTCAAAAAAACATGTCC (上游引物，下划线部分为 Sma I);
[0048] 引物 2 :cACTAGT TCATGCATAAGGATATTCGC (下游引物，下划线部分为 Spe I )。
[0049] PCR扩增产物经克隆测序证明，扩增产物具有序列表中SEQ ID Ns . 1的第 383-3577位核巧酸所示的核酸序列，编码具有序列表中SEQ ID Ns.2所述氨基酸残基序列 的蛋白质，共1064个氨基酸残基，将该具有序列表中SEQ ID Ns . 2所述氨基酸残基序列的 蛋白质命名为VdSENPl，将VdSENPl蛋白的编码基因命名为VdSENPl。
[0050] 实施例2、大丽轮枝菌（Verticillium d址liae Kleb.)致病基因VdSENPl的功能 验证
[0051] ( 一)、表达载体的构建
[0052] 真菌表达载体1300HPH-VdSENPl的构建方法如下；首先，将载体pCAMBIA-1300221 (记载 pCAMBIA-1300221 质粒的文献是 Satellite RNA-derived satsiR-12targeting the 3' UTR of Cucumber mosaic virus triggers viral RNAs for degradation. Journal of Virology. 201185. 13384-13397,公众可从中国科学院微生物研究所获得该质粒。）用Sma I 酶切得到载体片段与地0V21载体(记载地0V21载体的文献是Different chitin synthase genes are required for various developmental and plant infection processes in the rice blast fungus Magnaporthe o;ryzae，PLoS 化thogen, 20128 :el002526,公众可 从中国科学院微生物研究所获得该质粒。）经EcoR I和化nd III酶切补平得到的HPH片 段连接，得到重组载体1300HPH。然后将载体pSULPH-EGFP (记载pSULPH-EGFP质粒的文 献是 A Glutamic Acid-Rich Protein Identified in Verticillium dahliae from an Insertional Mutagenesis Affects Microsclerotial Formation and Pathogenicity, PLoS 0肥，2010 5(12) :el5319,公众可从中国科学院微生物研究所获得该质粒。）和实施例 1所述PCR扩增产物用Sma I和Spe I酶切，胶回收约3195bp核酸片段和13000bp载体骨架 片段，连接过夜，得到重组载体pSULPH-VdSENPl。最后，将载体1300HPH用化nd III和甜a I酶切得到载体骨架片段，载体pSULPH-VdSENPl用化nd III和甜a I酶切得到VdSENPl表 达片段，连接过夜，得到重组表达载体1300HPH-VdSENPl，经测序验证，重组表达载体构建正 确，即所述重组表达载体1300HPH-VdSENPl为在出发载体pCAMBIA-1300221的Sma I酶切 位点间插入HPH表达片段，并在化nd III和甜a I酶切位点间插入了具有序列表中SEQ ID 施.1的第383-3577位所示的核酸序列的DM片段的表达片段而得到的重组表达载体。
[0053] (二)、突变菌株vdsenpl的制备
[0054] 1、大丽轮枝菌突变体库的构建
[0055] 大丽轮枝菌菌株592在PDA平板上25C培养后将抱子接种于查氏液体培养基（将 2g NaN〇3、lg K&PCVlg M拆〇4. 7H2〇、lg KCl、2mg FeS〇4. 7&0和 30g藏糖溶于 1L蒸觸水中配 制而成。）中振荡培养5-8天直至抱子浓度为1. 0X lOVmU抱子培养液用4层无菌纱布过 滤W除去菌丝。4000巧m离也lOmin得到抱子并用诱导培养基加AS (己醜了香丽）200mM将 抱子浓度调节到1. 0X l(TVmL。将含pSULPH-EGFP质粒的农杆菌在30ml基本培养基（MM) (含有Kan50mg/L，Rif25mg/L)中28°C培养4811，4000巧111，离也lOmin,沉淀用诱导培养基 (IM)洗两次，重息农杆菌至0D值为0. 2-0. 3并加200mM AS (己醜了香丽）、40mM MES W及 Kan巧Omg/L)，28C，20化pm振荡培养化。然后吸取lOOy L上述培养物与lOOy 1的分生 抱子息浮液混合，泼于放在共培养基上的孔径为45 y m的47mm直径的纤维素膜上，在28C 培养36h。用2mL基本培养基洗膜，收获真菌和细菌培养物，然后取200两涂于含100 y g/ 血氯嚼賴隆（化olorimuron)的选择培养基平板上，抑制A. tumefaciens的生长，挑取单个 转化子转至选择培养基平板进行二次筛选并保存转化子。
[0056] 2、突变菌株vdsenpl的获得
[0057] 通过菌株侵染水培棉花来鉴定突变体的致病性，从而筛选出致病性改变的突变 体。挑选饱满的棉种（新陆早-16,购于新疆石河子大学农学院），用15%的次氯酸轴浸泡 30min后，无菌水冲洗2-3遍，再用无菌水浸泡催芽过夜后平铺在培养盒中保湿，待芽长至 3畑1，种于发芽盒中。在泡沫板上打取直径2畑1、间距3cm的孔洞，用海绵条缠绕发芽棉子的 根芽交界处，塞入泡沫板的孔洞中。将泡沫板置于盛满清水的塑料盒（高8-lOcm)上，于 25°C，光照16h，黑暗她下培养。待真叶长出时将清水换成1/3的MS培养液，每周更换一次 培养液，1片真叶展平时接种。将-8(TC保存的菌株经PDA平板活化3-4山从菌落边缘挑取 菌块放入查氏培养液，25C，220巧m摇培5山过滤，滤液5000g离也5min，清水稀释抱子，血 球计数板计数，将浓度调至1 X 1〇7个抱子/ml。将调好浓度的抱子息浮液加入空塑料盒中， 将棉苗根部浸入抱子息液40min，之后取出棉苗用1/3的MS培养液25C光照16h，黑暗下继 续培养棉苗她。每盒中种12株苗，每个菌株3次重复，对照棉苗用清水浸泡40min。筛选 结果见图1。
[0058] 通过上述方法，筛选获得了致病性减弱的突变菌株vdsenpl，其生长速度减缓，菌 落边缘的生长出现毛刷状不整齐现象，且显微镜下观察可知其菌丝出现极性生长现象(见 图2、图3)。将该致病性减弱的突变菌株vdsenpl保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中也(简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO. 8056,保藏日期为2013年08月13日， 分类命名为大丽轮枝菌VediciIlium d址liae。保藏中也的地址是北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，邮编100101。公众可从中国科学院微生物研究所获得该突变菌株vdsenpl)。
[0059] 3、Southern杂交确定突变菌株vdsenpl的T-DNA插入拷贝数
[0060] A、基因组DNA的提取方法如下：在液体查氏培养基中，200巧m振荡培养菌丝。震 荡培养的液体1000化pm离也lOmin后用液氮研磨。加入500 y L的提取缓冲液（lOOmmol/ LTris-HCl，P服.0, lOOmmol/L邸TA，250mmol/L化C1)，润流使菌粉与提取缓冲液充分混 合，然后加入50 y L20%SDS，轻摇化pendo计管，使混合物混合均匀，置于37C水浴比，取出 并加入75L5mol/L化C1，轻轻混匀，再加入65 y L10%CTAB及0. 75mol/LNaCl溶液，轻轻混 匀，然后放入65°C水中温育20min，取出后加入700yL氯仿/异戊醇（24:1)溶液，混匀， 1200化pm离也12min，取上清液，加入2倍体积的冰冻无水己醇，混匀后放入-2(TC冰箱中 至少30min，取出后在1000化pm离也2min，弃上清，用70%酒精洗盐2次，干燥后，加入40 y L TE溶解。
[0061] B、提取的DNA分别用EcoR I、甜a I和BamH I酶切
[0062] 酶切体系：
[0063]
【权利要求】
1. 一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白： 1) 序列表中的SEQ ID Ns. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2) 将序列表中的SEQ ID Ns . 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且与真菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。
2. 权利要求1所述蛋白的编码基因。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因具有下述核苷酸序列 之一： 1) 序列表中SEQ ID Ns :1的第383-3577位核苷酸所示的核苷酸序列； 2) 序列表中SEQ ID Ns . 1所示的核酸序列； 3) 编码序列表中SEQ ID Ns :2蛋白质序列的多核苷酸序列； 4) 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID Ns :1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列； 5) 与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白 质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以 上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
4. 含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。
5. 扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任意片段的引物对。
6. 权利要求1所述的蛋白和权利要求2-3任一所述的编码基因和权利要求4所述的重 组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高大丽轮枝菌的致病性中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述致病性是指引起棉花的黄萎病。
8. -株致病性降低的大丽轮枝菌，其保藏编号为CGMCC NO. 8056。
9. 抑制大丽轮枝菌中权利要求1所述的蛋白表达或抑制大丽轮枝菌中权利要求2-3任 一所述的编码基因表达的方法或产品在降低大丽轮枝菌的致病性中的应用。
10. 权利要求1所述的蛋白或权利要求2-3任一所述的编码基因作为靶点在降低大丽 轮枝菌的致病性中的应用。
【文档编号】C07K14/37GK104447965SQ201310424509
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】郭惠珊, 赵云龙 申请人:中国科学院微生物研究所