一种毒素蛋白及其纯化方法
【专利摘要】本发明提供一种毒素蛋白，从间斑寇蛛卵粒中分离纯化出来，其N-端序列为Glu-Ser-Ile-Gln-Thr-Ser-Thr-Tyr-Val-Pro-Asn-Thr-Pro-Asn-Gln-Lys-Phe-Asp-Tyr-Glu-Val-Gly-Lys-Asp-Tyr—，分子量为28690。腹腔注射能引起蜚蠊和小鼠出现一系列中毒症状；能抑制神经细胞膜上的河豚毒素不敏感型电压门控钠离子通道。本发明还提供了此毒素蛋白的纯化方法，具体包括卵粒提取物的制备、分子筛层析步骤、离子交换层析步骤以及反相-高效液相层析步骤，引入疏水性较弱的C4柱进行纯化，步骤简单，纯化效果好。
【专利说明】一种毒素蛋白及其纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别地，涉及一种从间斑寇蛛卵粒中提取的毒素蛋白及其纯化方法。
【背景技术】
[0002]间斑寇蛛(L.tredecimguttatus)俗称黑寡妇蜘蛛或黑毒蜘蛛，是一种体型中等的蜘蛛，在分类学上隶属于节肢动物门，蛛形纲，蜘蛛目，球蛛科，寇蛛属。间斑寇蛛是目前世界上已知毒性最强的蜘蛛之一，与其他有毒动物不同的是，不仅在其毒腺毒液中存在毒素，而且在身体的其他组织(如腿、腹部组织等)以及卵粒中也存在毒性成分。研究间斑寇蛛毒腺外的毒性成分具有重要的理论和实际意义。
[0003]国外相关研究人员对间斑寇蛛的毒腺毒素的研究较为系统和深入，从中分离纯化出多种毒素蛋白并对其结构与功能进行了研究，但对该种蜘蛛毒腺外毒素的研究报道较少。相关研究大多在粗提取物的水平上进行，缺乏对其中的活性成分进行完全分离纯化和结构与功能分析的研究报道:
[0004]1971年Buffkin等人利用分子筛层析将间斑寇蛛卵粒提取物分成了三个主要的峰，并证明第一个大峰成分具有毒性，但由于没有完全纯化，对其中的活性成分缺乏具体的研究。
[0005]2001年Akhunov等人也利用分子筛层析将间斑寇蛛卵粒提取物分成了几个部分，并证明其中三个部分具有毒性，但他们在用离子交换层析对有毒性的部分样品做进一步分离时，未得到有毒性的纯化产物，因此，对间斑寇蛛的卵粒毒素的研究就停留在粗提取物的水平上。
[0006]2009年以来，湖南师范大学以王贤纯教授为首的研究团队对间斑寇蛛卵粒的毒性展开了较为系统的研究，不仅对卵粒提取物的理化和生物学性质进行了系统的分析，还利用蛋白质组学的策略对卵粒的蛋白质组进行了鉴定，证明间斑寇蛛卵粒的蛋白质组与毒腺的相似性很小，因而推测其具有与毒腺毒液不同的毒性机制。通过分子筛层析以及离子交换层析步骤纯化了一种N-端的部分氨基酸序列为NSIADDRYRWPGYPGAGLIPHIDS —的蛋白质，并且验证了其毒性的存在。卵粒中还有很多其它活性成分值得分离纯化和深入研究，因此，对间斑寇蛛卵粒毒素的研究具有很重要的意义。
[0007]传统的分离蛋白质的基本策略是先利用分子筛层析或分级沉淀等方法对混合物样品进行分级分离，然后利用阴或阳离子交换层析进行进一步的纯化。由于间斑寇蛛卵粒中的许多蛋白质无论是在分子大小方面，还是在电荷方面，差异都比较小，仅仅根据它们这两个方面的差异进行分离难以达到纯化的目的。鉴于反相高效液相色谱(RP-HPLC)所使用的反相柱是根据物质疏水性的差异对其进行分离，且其分辨率高于一般分子筛层析柱和离子交换柱。但实际工作中，RP-HPLC—般不用于蛋白质的分离，因为蛋白质尤其是分子量较大的蛋白质与分离介质间的疏水相互作用较强，可能引起蛋白质的不可逆吸附或变性。
【发明内容】
[0008]本发明的第一目的在于提供一种毒素蛋白，从间斑寇蛛卵粒中分离纯化出来。该毒素蛋白的 N-端序列为 Glu-Ser-1le-Gln-Thr-Ser-Thr-Tyr-Val-Pro-Asn-Thr-Pro-Asn-
Gln-Lys-Phe-Asp-Tyr-Glu-Val-Gly-Lys-Asp-Tyr-,分子量为 28690,腹腔注射能引起
蜚蠊和小鼠出现一系列中毒症状；能抑制神经细胞膜上的河豚毒素不敏感型电压门控钠离子通道。
[0009]本发明的第二目的在于提供一种上述毒素蛋白的纯化方法，具体包括以下步骤:
[0010]第一步:卵粒提取物的制备，将间斑寇蛛的卵粒进行匀浆，离心后取上清液作为提取液，沉淀研磨后再次提取，重复2-5次，合并提取液，经冷冻干燥或浓缩后，得到卵粒提取物；
[0011]第二步:分子筛层析步骤，将卵粒提取物溶于磷酸缓冲液中，进行分子筛层析分离，通过磷酸缓冲液洗脱，得到洗脱峰，选择经SDS-PAGE鉴定出的目标峰作为分子筛层析后的目标峰；
[0012]第三步:离子交换层析步骤，将分子筛层析后的目标峰在阴离子交换层析柱上进行离子交换层析，得到洗脱峰，取穿过峰作为离子交换层析后的目标峰；
[0013]第四步:反相-高效液相层析步骤，采用低疏水性的C4反相柱将离子交换层析的目标峰进行脱盐和进一步纯化，收集经过SDS-PAGE确定的目标峰进行冷冻干燥，即得纯化的间斑寇蛛卵粒毒素蛋白。
[0014]以上技术方案中优选的，第一步中的匀浆是在缓冲液或水中进行，其中缓冲液的浓度为0.04-1.06mol/L ;离心过程具体为:在转速为8000-10000r/min的条件下离心8_12分钟。优选所述缓冲液的浓度为0.05mol/L,离心时转速为10000r/min，离心时间为10分钟。
[0015]以上技术方案中优选的，第二步中用于分子筛层析的卵粒提取物用磷酸缓冲液配成浓度为2.0-2.8mg/ml的溶液；分子筛层析采用Sephacryl TM S-200柱层析,规格为
2.6cmX60cm ;磷酸缓冲液洗脱时的流速为2_2.5ml/min,检测波长为280nm。优选用于分子筛层析的卵粒提取物用磷酸缓冲液配成浓度为2.5mg/ml的溶液，磷酸缓冲液洗脱时的流速为 2.5ml/min。
[0016]以上技术方案中优选的，第三步中的阴离子交换层析柱为Toyopearl DEAD-650E阴离子交换层析柱，规格为5mmX10cm;TriS-HCl缓冲液的浓度为48-52mmol/L，pH为
8.0-8.6 ;梯度洗脱时氯化钠溶液的起始浓度为1-1.2mol/L。优选所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为8.5 ;梯度洗脱时氯化钠溶液的起始浓度为1.0mol/L。
[0017]以上技术方案中优选的，第四步中脱盐和进一步纯化步骤中，C4反相柱的规格为
4.6mmX 250mm,采用洗脱液A和洗脱液B进行线性梯度洗脱，洗脱液A为0.05%的三氟乙酸，洗脱液B为含0.05%三氟乙酸的乙腈，洗脱过程中每分钟增加0.8-1.2%的洗脱液B，流速为0.7-1.0m/min，检测波长为280nm。
[0018]本发明具有以下有益效果:本发明通过将分子筛层析、离子交换层析以及反相-高效液相层析的结合，完全纯化间斑寇蛛卵粒中的毒素蛋白，操作步骤简单，实用性强；本发明将反相-高效液相层析法引入卵粒蛋白的分离纯化时，采用疏水性较弱的C4柱，用于分子量相对较小的卵粒蛋白的分离；同时，降低洗脱液中三氟乙酸的添加量，以减少其对蛋白质可能的不利影响。通过分子筛层析、离子交换层析和基于弱疏水性C4柱的RP-HPLC的组合分离策略，实现了上述毒素蛋白的分离和纯化。
[0019]除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
[0021]图1是本发明优选实施例1的卵粒提取物分子筛层析图；
[0022]图2是本发明优选实施例1的分子筛层析目标峰离子交换图；
[0023]图3是本发明优选实施例1的离子交换目标峰RP-HPLC图；
[0024]图4是本发明优选实施例1的毒素蛋白电喷雾质谱分析图；
[0025]图5是本发明优选实施例1的毒素蛋白对河豚毒素不敏感型钠通道电流的影响图；
[0026]图6是本发明优选实施例1的毒素蛋白对河豚毒素敏感型钠通道电流的影响图。【具体实施方式】
[0027]以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
[0028]实施例1:
[0029]一种毒素蛋白，从间斑寇蛛的卵粒中提取出来，分子量为28690，其N-端序列为Glu-Ser-1Ie-Gln-Thr-Ser-Thr-Tyr-Val-Pro-Asn-Thr-Pro-Asn-Gln-Lys-Phe-Asp-Tyr-Glu-
Val-Gly-Lys-Asp-Tyr-。毒性略低于文献报道的部分蛋白质类或多肽类毒素。该毒素蛋
白经腹腔注射能引起蜚蠊和小鼠出现一系列中毒症状；能抑制神经细胞膜上的河豚毒素不敏感型电压门控钠离子通道。
[0030]该毒素蛋白的纯化方法，具体包括以下步骤:
[0031]第一步:卵粒提取物的制备，将间斑寇蛛的卵粒进行匀浆，离心后取上清液作为提取液，沉淀研磨后再次提取，重复2-5次，合并提取液，经冷冻干燥或浓缩后，得到卵粒提取物；匀浆是在低浓度缓冲液或水中进行，其中缓冲液的浓度为0.05mol/L ;离心过程具体为:在转速为10000r/min下离心10分钟。上述的冷冻干燥或浓缩采用生物实验中的常规手段进行。
[0032]第二步:分子筛层析步骤，将卵粒提取物溶于磷酸缓冲液中，采用S印hacryl?
S-200柱层析进行分子筛层析分离，通过磷酸缓冲液洗脱，得到7个主要洗脱峰，选择经SDS-PAGE鉴定出的第3个峰作为分子筛层析后的目标峰；用于分子筛层析的卵粒提取物用磷酸缓冲液配成浓度为2.5mg/ml的溶液；分子筛层析柱的规格为2.6cmX60cm ;磷酸缓冲液洗脱中流速为2.5ml/min，检测波长为280nm，层析结果详见图1。
[0033]第三步:离子交换层析步骤,将分子筛层析后的目标峰在Toyopearl DEAD-650E阴离子交换层析柱上进行离子交换层析，得到洗脱峰，取穿过峰(不交换峰)作为离子交换层析后的目标峰；阴离子交换层析柱的规格为5mmX10cm ;Tris_HCl缓冲液的浓度为50mmol/L, pH为8.5 ;梯度洗脱时氯化钠溶液的起始浓度为1.0mol/L，层析结果详见图2。
[0034]第四步:反相-高效液相层析(RP-HPLC)步骤，采用低疏水性的C4反相柱将离子交换层析的目标峰进行脱盐和进一步纯化，收集经过SDS-PAGE确定的目标峰进行冷冻干燥，即得纯化的间斑寇蛛卵粒毒素蛋白；C4反相柱的规格为4.6mmX250mm。采用洗脱液A和洗脱液B进行线性梯度洗脱。洗脱液A为0.05%的三氟乙酸，洗脱液B为含0.05%三氟乙酸的乙腈。洗脱过程中每分钟增加0.8-1.2%的洗脱液B，流速为0.7-1.0m/min,检测波长为280nm，层析结果详见图3。
[0035]以上方案中SDS-PAGE检测时的其他参数为常规操作即可。
[0036]将经过反相-高效液相层析步骤后的毒素蛋白进行分子量测定，具体为:采用电喷雾生物质谱测定间斑寇蛛卵粒毒素蛋白的分子量，将纯化样品用0.1%甲酸配制成约
Iμ g/μ L的浓度，在电喷雾质谱仪上进行，仪器测定前用标准液进行外部校正，雾化气为N2气，源温度为150°c，锥孔电压为1200V，质量误差设定±0.lppm，测定结果详见图4，根据各多电荷峰的m/z和所带电荷数计算出该蛋白质的的分子量为28690。
[0037]具体计算方法如下:选取任意两个相邻的质谱峰，`建立方程组。
[0038]比如:取m/z分别为1196.42和1248.37的两个峰进行计算:
[0039]设蛋白质的分子量为Mr ;第一个峰离子带的电荷数为Z，那么第二峰离子带的电荷数则为Z-1。
[0040]方程(I)Mr=I 196.42XZ - Z ； 方程(2) Mr=1248.37X (Z-1) - (Z-1)
[0041]解联立方程(I)(2)得:Mr=28690Z=24
[0042]根据相邻峰离子相差一个电荷的规律，可知其他各峰离子带的电荷数。可根据每个峰离子的m/z值和电荷数算出蛋白质的分子量，将各分子量数值平均后可得到更为准确的分子量。
[0043]将本发明的毒素蛋白进行毒性测试，采用直接腹部注射的方法检测纯化蛋白对动物的影响:
[0044]( I)对老鼠进行试验:
[0045]实验组:按每Kg体重5.Smg的剂量对小鼠腹腔注射本发明的毒素蛋白，结果发现注射后约3分钟小鼠即出现不适症状，主要表现为动作迟缓，时间稍长(约10分钟左右)出现精神萎靡、食欲下降、对外部刺激反应性降低等中毒症状。结果表明，该蛋白质对小鼠具有一定的毒性，但在本实验剂量下，动物未出现死亡现象。与部分来自动物毒腺的毒素相t匕，从蜘蛛卵粒纯化的本发明毒素蛋白的哺乳动物毒性相对较低。
[0046]对照组:注射生理盐水的老鼠活动正常，对外界刺激反应十分灵敏。
[0047](2)对蜚蠊进行试验:
[0048]实验组:按每g体重15 μ g的剂量对蜚蠊进行腹部注射本发明的毒素蛋白后，蜚蠊立刻出现动作迟缓甚至静止不动，几乎完全失去对外部刺激的反应性等中毒症状。
[0049]对照组:注射生理盐水的蜚蠊活动正常，对外界刺激反应十分灵敏。
[0050]以上结果表明，本发明的毒素蛋白对动物具有一定的毒性。
[0051]检测本发明毒素蛋白对神经细胞钠离子通道的影响(即毒素蛋白对电压门控钠离子通道电流的影响):采用全细胞膜片钳分析技术检测间斑寇蛛卵粒毒素对神经细胞钠离子通道的影响，具体步骤为:从处死后的Sprague-Dawley大鼠急性分离背根神经节，剪碎并经胶原酶和胰蛋白酶处理获得背根神经节细胞，经短时间培养后用于膜片钳分析；膜片钳记录在室温下进行，电极内液的组成为(mmol/L):
[0052]CsCl145MgCl2.6H20 4HEPES10
[0053]EGTA10glucose10ATP2[0054]pH 为 7.2 ;
[0055]细胞外液组成为(mmol/L):
[0056]NaCl145KCl2.5CaCl21.5
[0057]MgCl2.6H20 1.2TEA-Cl90HEPES10
[0058]EGTA10glucose10pH 为 7.4。
[0059]本发明的毒素蛋白能抑制大鼠背根神经节细胞膜上的河豚毒素不敏感型电压门控钠离子通道电流，毒素浓度为I μΜ时，抑制21.23±3.96%的河豚毒素不敏感型钠通道电流，见图5中的曲线，但对河豚毒素敏感型钠通道电流的抑制作用不明显，详见图6中曲线，图5和图6中的纵坐标标尺线均为2ηΑ，横坐标标尺线均为10ms。以上结果说明本发明毒素蛋白的作用具有一定的特异性。
[0060]本发明通过将分子筛层析、离子交换层析以及反相-高效液相层析的结合，完全纯化间斑寇蛛卵粒中的毒素蛋白，操作步骤简单，实用性强；本发明将反相-高效液相层析法引入卵粒蛋白的分离纯化时，采用疏水性较弱的C4柱，用于分子量相对较小的卵粒蛋白的分离；同时，降低洗脱液中三氟乙酸的添加量，以减少其对蛋白质可能的不利影响，通过分子筛层析、离子交换层析和基于弱疏水性C4柱的RP-HPLC的组合分离策略，实现了上述毒素蛋白的分离和纯化；纯化出的毒性蛋白通过试验证明其对动物存在一定的毒性。
[0061]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种毒素蛋白，其特征在于:所述毒素蛋白的N-端序列为:Glu-Ser-1le-Gln-Thr-Ser-Thr-Tyr-Val-Pro-Asn-Thr-Pro-Asn-Gln-Lys-Phe-Asp-Tyr-Glu-Val-Gly-Lys-Asp-Tyr-ο
2.根据权利要求1所述的毒素蛋白，其特征在于:所述毒素蛋白的分子量为28690。
3.—种如权利要求1或2所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于:包括以下步骤: a、卵粒提取物的制备:将间斑寇蛛的卵粒进行匀浆，离心后取上清液作为提取液，沉淀研磨后再次提取，重复2-5次，合并提取液，经冷冻干燥或浓缩后，得到卵粒提取物； b、分子筛层析步骤:将卵粒提取物溶于磷酸缓冲液中，进行分子筛层析分离，通过磷酸缓冲液洗脱，得到洗脱峰，选择经SDS-PAGE检测出的目标峰作为分子筛层析后的目标峰； C、离子交换层析步骤:将分子筛层析后的目标峰在阴离子交换层析柱上进行离子交换层析，得到洗脱峰，取穿过峰作为离子交换层析后的目标峰； d、反相-高效液相层析步骤:采用C4反相柱将离子交换层析的目标峰进行脱盐和进一步纯化，收集经过SDS-PAGE确定的目标峰进行冷冻干燥，即得纯化的毒素蛋白。
4.根据权利要求3所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于:步骤a中的匀浆在缓冲液或水中进行，其中缓冲液的浓度为0.04-1.06mol/L ;离心过程具体为:在转速为8000-10000r/min的条件下离心8-12分钟。
5.根据权利要求4所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于:所述缓冲液的浓度为0.05mol/L ;离心时转速为10000r/min，离`心时间为10分钟。
6.根据权利要求3所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于:步骤b中用于分子筛层析的卵粒提取物用磷酸缓冲液配成浓度为2.0-2.8mg/ml的溶液；分子筛层析采用Sephacryl?S-200柱层析,规格为2.6cmX60cm ;磷酸缓冲液洗脱时的流速为2_2.5ml/min,检测波长为280nm。
7.根据权利要求6所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于:用于分子筛层析的卵粒提取物用磷酸缓冲液配成浓度为2.5mg/ml的溶液；磷酸缓冲液洗脱时的流速为2.5ml/min0
8.根据权利要求3所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于:步骤c中的阴离子交换层析柱为Toyopearl DEAD-650E阴离子交换层析柱,规格为5mmX IOcm ;Tris_HCl缓冲液的浓度为48-52mmol/L，pH为8.0-8.6 ;梯度洗脱时氯化钠溶液的起始浓度为1_1.2mol/L。
9.根据权利要求8所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于:所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为8.5 ;梯度洗脱时氯化钠溶液的起始浓度为1.0mol/L。
10.根据权利要求3所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于:步骤d中脱盐和进一步纯化步骤中，C4反相柱的规格为4.6mmX 250mm,采用洗脱液A和洗脱液B进行线性梯度洗脱，洗脱液A为0.05%的三氟乙酸，洗脱液B为含0.05%三氟乙酸的乙腈，洗脱过程中每分钟增加0.8-1.2%的洗脱液B，流速为0.7-1.0m/min，检测波长为280nm。
【文档编号】C07K1/16GK103497242SQ201310472474
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】王贤纯, 梁宋平, 李建军, 晏益中, 段志贵, 胡卫军 申请人:湖南师范大学