一种白果内酯的分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种白果内酯的分离纯化方法。本发明方法包括下列步骤：（1）制备银杏内酯富集物；（2）反相吸附树脂柱层析制得白果内酯粗品；（3）白果内酯粗品重结晶后得到白果内酯精品。本发明方法制得的白果内酯含量可达98%-99%。本发明方法所使用的填料为MCI-GEL或NM100反相吸附树脂，具有很好的选择性，能大大提高白果内酯的分离效率，并可以再生利用，毒性低、使用成本低。本发明溶媒简单易得，所用设备为常规设备，操作简便，能耗少，生产安全，无污染，所得产品纯度高，适于工业化生产，有较大的应用价值。
【专利说明】一种白果内酯的分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物的分离纯化方法，具体涉及一种白果内酯的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]银杏叶的成分组成复杂，内含多种活性成分，主要有黄酮、萜内酯，此外还有有机酸、烷基酚和烷基酚酸、留体化合物、微量元素等。而银杏叶中的药用成分主要是银杏黄酮类和银杏内酯类物质。目前从银杏叶中主要分离得到二萜内酯和倍半萜内酯，即银杏内酯A、B、C、J、M和白果内酯。白果内酯属倍半萜内酯，分子结构中仅含有一个戊烷。白果内酯有很强的生物活性，具有多方面的神经保护作用，包括促进神经生长、改善老年记忆功能、防止老年痴呆的发生等。由于银杏叶中萜内酯的含量极低，因此，要得到具有高药用价值的银杏内酯和白果内酯，则须将银杏叶或其粗提物进行再提取精制。目前文献报道的银杏内酯提取分离方法主要有:溶剂提取法，溶剂提取-色谱柱分离法、超临界提取分离法、高速逆流色谱法及模拟移动床色谱法等，其中应用最多的是色谱柱分离法，填料多采用硅胶、氧化铝及反相C18硅胶柱填料等。中国发明专利《从银杏叶中提取分离银杏内酯A、B、C、J及白果内酯单体的方法》(专利申请号200710050242.1)和《从银杏叶中提取分离白果内酯的方法》(专利申请号200710050244.0)中采用硅胶柱层析和正己烷-乙酸乙酯溶剂系统洗脱的方法分离白果内酯。但是，该方法中使用的硅胶不能回收再利用，还要使用大量有机溶剂洗脱，不利于工业化生产。中国发明专利《银杏内酯A、B、C、J和白果内酯单体的高效分离纯化方法》(专利申请号200810046162.3)和《白果内酯的分离纯化制备方法》(专利申请号201210457118.8)中分别采用制备型高效液相色谱柱和反相硅胶柱层析制备白果内酯，此方法的缺点在于反相硅胶载样量小，甲醇或乙腈使用量大，工艺成本较高，不利于大量制备。因而，上述纯化精制方法尚存在各种缺陷，不能高效经济环保地分离出高纯度的白果内酯，亟待进一步改进提取分离白果内酯的方法。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计分离纯化简便、成本低、有利于环保，适用于工业化生产的白果内酯的分离纯化方法。
[0004]本发明提供了一种白果内酯的分离纯化方法。
[0005]本发明的方法包括以下步骤:
[0006](I)制备银杏内酯富集物:取银杏叶提取物(EGB)，有机溶剂萃取，萃取液减压蒸干，得到银杏内酯富集物；
[0007](2)反相吸附树脂柱层析:银杏内酯富集物通过反相吸附树脂，先用0-20%的乙醇洗脱1-4BV除杂，再用20%-50%乙醇洗脱树脂1-8BV，收集含白果内酯的洗脱液回收溶剂至干，得到白果内酯粗品；
[0008](3)重结晶:白果内酯粗品用10%_60%乙醇加热溶解过滤后，2°C -10°C冷藏放置12-48h，析出结晶，反复结晶1-3次，用纯化水洗晶1-5次，于60°C _120°C真空烘干，即得高纯度白果内酯。
[0009]所述BV为本领域公认的洗脱柱体积单位。
[0010]本发明的白果内酯的分离纯化方法，所述步骤(1)银杏叶提取物(EGB)为市售，或通过下列方法制备:以银杏干叶为原料，粉碎，用40%-80%乙醇水溶液提取，提取溶剂用量为药材量的4-8倍W/V，提取次数为3-4次，每次提取时间为1-2小时，合并提取液，减压浓缩回收乙醇至无乙醇味后，过滤，滤液上大孔吸附树脂DlOl或HP20柱，柱体积为药材量的1-1.5倍量W/V，水洗2-3BV去杂，60%-80%乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡为止，减压浓缩洗脱液即得银杏叶提取物。
[0011]步骤(1)的有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酮、甲基乙基酮、正丁醇或异丁醇中的一种或两种混合溶剂萃取，优选乙酸乙酯或丙酮，萃取次数为1-6次，优选3次，每次萃取所用溶剂用量为银杏叶提取物5-15倍量W/V，优选10倍量W/V。
[0012]所述步骤(2)将反相吸附树脂柱层析所得含白果内酯流份于55°C -65 °C和-0.09—0.1MPa条件下减压旋蒸干至无溶剂，40°C _70°C加热溶解于10%_60%乙醇中，趁热过滤，滤液于2V -10°C条件下放置12-48小时，析出结晶，过滤即得白果内酯粗品。
[0013]步骤(2)所述反相吸附树脂填料为MC1-GEL CHP系列反相吸附树脂或匪100系列反相吸附树脂。
[0014]所述MC1-GEL CHP系列反相吸附树脂为三菱化学株式会社生产，型号为CHP20/P120,其技术参数为:粒径为75-150 u m,平均粒径为120 y m，PH范围为0-14，孔径为450埃，基体为聚苯乙烯和二乙烯基共聚物。
[0015]所述匪100系列反相吸附树脂为苏州纳微科技有限公司生产,型号为匪100,其技术参数为:粒径为50-150 i`im，孔径为300埃，基体为聚苯乙烯和二乙烯基苯。
[0016]除杂溶剂为0-20%乙醇溶液，优选10%乙醇溶液，洗脱体积为1-4BV，优选1-2BV ；
[0017]洗脱溶剂为20-50%乙醇，优选30-40%乙醇，洗脱体积为3-10BV，优选6-8BV。
[0018]所述步骤(3)结晶溶剂为10%_60%乙醇；重结晶步骤为反复重结晶1-3次；洗结晶步骤为用纯化水洗结晶1-5次。
[0019]优选结晶溶剂为20%_50%乙醇；重结晶步骤为反复重结晶2次；洗结晶步骤为用纯化水洗结晶3次。
[0020]本发明方法制得的白果内酯通过检测含量为98%_99%。
[0021]本发明方法与现有技术相比，取得了很好的效果:
[0022]本发明方法所使用的填料为MC1-GEL或WlOO反相吸附树脂，该填料对银杏内酯具有很好的选择性，能大大提高白果内酯的分离效率，并且填料可以再生利用，比硅胶、氧化铝等柱层析所用的有机溶剂毒性低、使用成本低。
[0023]另外，本发明由于分离纯化白果内酯的溶媒简单易得，所用设备为常规设备，因此操作简单，能耗少，采用无毒吸附剂吸附，乙醇解吸，故生产安全，无污染，并且所得产品纯度高，适于工业化生产，有较大的应用价值。
【具体实施方式】
[0024]下面通过实施例对本发明做进一步说明，而不是为了限制本发明的范围。
[0025]实施例1[0026]取银杏叶提取物(EGB)(市售，银杏总内酯含量≥6%)4g悬浮于40mL水中，用乙酸乙酯萃取三次，每次50mL，萃取溶液于60°C和-0.09—0.1MPa条件下减压回收溶剂，萃取物为银杏内酯富集物，HPLC-ELSD检测总银杏内酯含量为34.5%，萃取物60oC加热溶于IOOmL水中，用IOOmL的MC1-GEL树脂进行吸附，吸附时间为0.5h，先用10%的乙醇洗脱3BV除杂，再用30%乙醇洗脱树脂8BV，HPLC检测后收集含白果内酯洗脱液，于65°C和-0.09—0.1MPa条件下，减压旋蒸干至无溶剂得白果内酯粗品，白果内酯粗品加入40%乙醇(2.8mL)，60°C加热溶解后，放置冰箱(4°C ) 24h，析出结晶，反复重结晶2次，用纯化水(每次ImL)洗晶3次，于65°C真空加热烘干，得到白果内酯83mg，HPLC-ELSD检测含量为98.4%。
[0027]银杏内酯和白果内酯的检测方法选用HPLC-ELSD检测法(参考文献为医药导报，2010 年 3 月，29 (3):377-378)。
[0028]实施例2
[0029]取银杏叶提取物(EGB)(市售，银杏总内酯含量≥6%) 4g悬浮于40mL水中，用乙酸乙酯萃取三次，每次50mL，萃取溶液于60oC减压回收溶剂，萃取物为银杏内酯富集物，HPLC-ELSD检测总银杏内酯含量为31.8%，萃取物60°C加热溶于IOOmL水中，用IOOmL的匪100树脂进行吸附，吸附时间为0.5h，先用10%的乙醇洗脱3BV除杂，再用30%乙醇洗脱树脂8BV，HPLC检测后收集含白果内酯洗脱液，于65oC和-0.09—0.1MPa条件下，减压旋蒸干至无溶剂得白果内酯粗品，回收溶剂，白果内酯粗品加入40%乙醇(2.6mL)，60°C加热溶解后，放置冰箱(4°C)24h，析出结晶，反复重结晶2次，用纯化水(ImL)洗晶3次，于65°C真空加热烘干，得到白果内酯71mg，HPLC-ELSD检测含量为98.8%。
[0030]实施例3
[0031]取干银杏叶(市售)300g，粉碎，80%乙醇回流提取三次，溶剂用量依次为2.4L、1.5L和1.5L，每次提取2h，合并提取液，60°C和-0.09—0.1MPa条件下，减压浓缩至无乙醇味，过滤，滤液上大孔吸附树脂DlOl柱，纯化水(1000mL)洗柱去杂，70%乙醇(2000mL)洗脱至洗脱液颜色变淡(薄层层析检测无银杏叶提取物即可)，洗脱液于60°C和-0.09-0.1MPa条件下，减压旋蒸干至无溶剂得银杏叶提取物(6g)，HPLC-ELSD检测银杏总内酯含量为6.5%
[0032]银杏叶提取物6g用乙酸乙酯萃取三次，每次150mL，萃取溶液于60°C减压蒸干回收溶剂，萃取物为银杏内酯富集物，HPLC-ELSD检测总银杏内酯含量为29.3%，萃取物60°C加热溶解于20mL水中，用70mL的MC1-GEL树脂进行吸附，吸附时间为lh，先用10%乙醇洗脱3BV除杂，再用30%乙醇洗脱树脂6BV，HPLC检测后收集含白果内酯洗脱液，于65°C和-0.09-0.1MPa条件下，减压旋蒸干至无溶剂减压浓缩干得白果内酯粗品，回收溶剂，白果内酯加入30%乙醇3.8mL，60°C加热溶解后，放置冰箱(4°C )24h，析出结晶，反复重结晶3次，用纯化水(1.5mL)洗晶3次，于80°C真空加热烘干，得到白果内酯102mg，HPLC-ELSD检测含量为98.5%。
[0033]实施例4
[0034]取干银杏叶(市售)500g，粉碎，80%乙醇回流提取三次，溶剂用量依次为4L、2.5L和2.5L，每次提取2h，合并提取液，60°C和-0.09—0.1MPa条件下，减压浓缩至无乙醇味，过滤，滤液上大孔吸附树脂DlOl柱，纯化水(1500mL)洗柱去杂，70%乙醇(3000mL)洗脱至洗脱液颜色变淡(薄层层析检测无银杏叶提取物即可)，洗脱液于60°C和-0.09-0.1MPa条件下，减压浓缩干得银杏叶提取物(7.2g)，HPLC-ELSD检测银杏总内酯含量为9.9%。[0035]银杏叶提取物7.2g用乙酸乙酯萃取三次，每次250mL，萃取溶液于60oC减压蒸干回收溶剂，萃取物为银杏内酯富集物，HPLC-ELSD检测总银杏内酯含量为31.8%，萃取物60°C加热溶解于40mL水中，用IOOmL的NM100树脂进行吸附，吸附时间为lh，先用10%乙醇洗脱3BV除杂，再用30%乙醇洗脱树脂6BV，HPLC检测后收集含白果内酯洗脱液，于65°C和-0.09-0.1MPa条件下，减压旋蒸干至无溶剂得白果内酯粗品，回收溶剂，白果内酯加入50%乙醇4.2mL，60°C加热溶解后，放置冰箱(4°C) 24h，析出结晶，反复重结晶3次，用纯化水(1.5mL)洗晶3次，于80°C真空加热烘干，得到白果内酯(153mg，HPLC-ELSD检测含量为98.4%) o
[0036]实施例5
[0037]按实施例3的方法制备银杏内酯富集物(1.8g)，HPLC-ELSD检测总银杏内酯含量为37.6%，萃取物60oC加热溶解于20mL水中，用70mL的MC1-GEL树脂进行吸附，吸附时间为1.5h，先用10%乙醇洗脱4BV除杂，再用25%乙醇洗脱树脂8BV，HPLC检测后收集含白果内酯洗脱液，于60°C和-0.09-0.1MPa条件下，减压旋蒸干至无溶剂减压浓缩干得白果内酯粗品，回收溶剂，白果内酯加入25%乙醇6.8mL，50°C加热溶解后，放置冰箱(4°C) 36h，析出结晶，反复重结晶2次，用纯化水(1.5mL)洗晶3次，于60°C真空加热烘干，得到白果内酯205mg, HPLC-ELSD 检测含量为 98.Tl。
[0038]实施例6
[0039]按实施例4的方法制备银杏内酯富集物(3.3g)，HPLC-ELSD检测总银杏内酯含量为18.6%，萃取物60oC加热溶解于40mL水中，用IOOmL的NM100树脂进行吸附，吸附时间为1.5h，先用10%乙醇洗脱3BV除杂，再用35%乙醇洗脱树脂6BV，HPLC检测后收集含白果内酯洗脱液，于55°C和-0.09-0.1MPa条件下，减压旋蒸干至无溶剂得白果内酯粗品，回收溶剂，白果内酯加入45%乙醇6.2mL，60 V加热溶解后，放置冰箱(4°C ) 24h，析出结晶，反复重结晶3次，用纯化水(1.5mL)洗晶3次，于70°C真空加热烘干，得到白果内酯(241mg，HPLC-ELSD 检测含量为 98.8%)。
【权利要求】
1.一种白果内酯的分离纯化方法，其特征在于，该方法包括下列步骤: (1)制备银杏内酯富集物:取银杏叶提取物，有机溶剂萃取，减压蒸干即得银杏内酯富集物； (2)反相吸附树脂柱层析:银杏内酯富集物通过反相吸附树脂，先用0-20%的乙醇洗脱1-4BV除杂，再用20%-50%乙醇洗脱树脂1-8BV，收集含白果内酯的洗脱液回收溶剂至干，得到白果内酯粗品； (3)重结晶:白果内酯粗品用10%-60%乙醇加热溶解过滤后，2°C-10°C冷藏放置12-48h，析出结晶，反复结晶1-3次，用纯化水洗晶1-5次，于60°C _120°C真空烘干，即得高纯度白果内酯。
2.根据权利要求1所述的一种白果内酯的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)银杏叶提取物为市售，或通过下列方法制备:以银杏干叶为原料，粉碎，用40%-80%乙醇水溶液提取，提取溶剂用量为药材量的4-8倍W/V，提取次数为3-4次，每次提取时间为1-2小时，合并提取液，减压浓缩回收乙醇至无乙醇味后，过滤，滤液上大孔吸附树脂DlOl或HP20柱，柱体积为药材量的1-1.5倍量W/V，水洗2-3BV去杂，60%-80%乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡为止，减压浓缩洗脱液即得银杏叶提取物。
3.根据权利要求1所述的一种白果内酯的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酮、甲基乙基酮、正丁醇或异丁醇中的一种或两种混合溶剂萃取，优选乙酸乙酯或丙酮，萃取次数为1-6次，优选3次，每次萃取所用溶剂用量为银杏叶提取物5-15倍量W/V，优选10倍量W/V。
4.根据权利要求1所述的一种白果内酯的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)反相吸附树脂填料为MC1-GEL CHP系列反相吸附树脂或WlOO系列反相吸附树脂。
5.根据权利要求4所述的一种白果内酯的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)MC1-GEL CHP系列反相吸附树脂为三菱化学株式会社生产，型号为CHP20/P120，其技术参数为:粒径为75-150 u m,平均粒径为120 y m，PH范围为0-14，孔径为450埃，基体为聚苯乙烯和二乙烯基共聚物；所述匪100系列反相吸附树脂为苏州纳微科技有限公司生产，型号为匪100，其技术参数为:粒径为50-150 iim，孔径为300埃，基体为聚苯乙烯和二乙烯基苯。
6.根据权利要求1所述的一种白果内酯的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)除杂溶剂为0-20%乙醇溶液，优选10%乙醇溶液，洗脱体积为1-4BV，优选1-2BV ;洗脱溶剂为20%-50%乙醇，优选30%-40%乙醇，洗脱体积为3-10BV，优选6-8BV。
7.根据权利要求1所述的一种白果内酯的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)将反相吸附树脂柱层析所得含白果内酯流份于55oC-65oC和-0.09—0.1MPa条件下减压旋蒸干至无溶剂，40°C -70°C加热溶解于10%-60%乙醇中，趁热过滤，滤液于2V _10°C条件下放置12-48小时，析出结晶，过滤即得白果内酯粗品。
8.根据权利要求1所述一种白果内酯的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)结晶的溶剂为10%-60%乙醇；重结晶为反复重结晶1-3次；用纯化水洗结晶1-5次。
9.根据权利要求8所述一种白果内酯的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)结晶溶剂为20%-50%乙醇；重结晶为反复重结晶2次；用纯化水洗结晶3次。
10.根据权利要求1所述的一种白果内酯的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)重结晶后得到的白果内酯含量为98%-99%。
【文档编号】C07D493/20GK103524526SQ201310482318
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】肖志勇, 于垂亮, 吕署一, 徐继红, 梅锦平 申请人:上海信谊百路达药业有限公司