植物病原细菌ahl类信号分子免疫半抗原的合成的制作方法
【专利摘要】本发明设计植物病原细菌AHL类分子通用免疫半抗原的合成技术，属于有机化学及免疫学技术范畴。根据有机化学的一般原理，合成AHL类信号分子的通用免疫半抗原。与-20℃冰箱中保存备用。此抗原具有稳定性好，免疫原性较强等特点，可制备出高效价、高亲和力的AHL类信号分子抗体。抗原制备技术简单可行，整个制备过程无需特别的仪器设备。
【专利说明】植物病原细菌AHL类信号分子免疫半抗原的合成
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物病原细菌AHL类信号分子通用免疫半抗原的合成技术，属于有机化学剂免疫学技术范畴。
【背景技术】
[0002]群体感应又称为自体诱导(autoinduction),是细菌监控种内或种间群体密度的环境信号感应系统。QS依赖于一种小的可扩散的信号分子(Al)，这种信号分子由细菌产生并向细胞外扩散，在周围环境中积累。随着种群密度的增加，环境中积累的Al信号分子的浓度也成比例地增高，当达到一定阈值水平时，细菌通过细胞内受体对这些信号分子进行检测，在群体范围内调控一些相关基因的表达。目如已知QS系统能够调控细囷的多种生理生化功能，包括细菌毒性(Von-Bodman et al., 2003)、生物体发光(Eberhard et al.,1981)、接合(Zhang et al., 1993)、色素的形成(McClean et al., 1997)、孢子及生物膜的形成(Zhu & Mekalanos, 2003)等。QS系统赋予细菌一些高等生物的特性，因此QS系统被认为可能是单细胞生物向多细胞生物进化的早期步骤(Miller & Bassler, 2001)。QS调节使单细胞和多细胞生物构成之间的界限变得模糊。目前，细菌细胞间的信号传导在微生物学研究中已经成为一个热点。
[0003]QS系统在细菌中普遍存在，根据信号分子的种类，QS系统可以分为以下四类:(I)酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones, AHL)型QS系统；(2)扩散性信号分子(Diffusible signal factor, DSF)型 QS 系统；(3)呋喃酸硼酸二酯(Furanosyl boratediester, A1-2)型QS系统；(4)寡肽型QS系统；(5) AI_3型QS系统。在革兰氏阴性细菌中，最常见的QS信号分子为AHL s。AHL是由一个可变的酰基链(ayslside chain)尾部与一个稳定的高丝氨酸内酯(HSL)头部相连，不同的AHL分子其酰基链的长度为4至18个碳，其第三个碳上的氢常被羟基或氧取代，另一个改变是在酰基链上存在双键，这种可变的酰基链尾部决定AHL的特异性。目前发现最长的酰基链是由苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)合成的带18个碳的AHL (Marketon et al., 2002) ?自然界中一种细菌可以产生几种不同结构的AHL分子，而不同种的细菌也可以产生同种结构的信号分子(Williams etal.，2007)，通过这些信号分子的产生和识别机制，不同的细菌实现了互相感应交流的过程。迄今共发现有三类蛋白酶负责催化AHLs分子的合成,分别为Luxl蛋白、LuxM / Ains类蛋白和Htds类蛋白。目前已经从动植物病原细菌中鉴定出近20种AHL类信号分子，侧链长度分别为4~18个碳原子。目前，AHL类信号分子的检测方法主要有两种:(I)依赖于高效液相色谱和核磁共振的仪器检测。仪器检测需要有AHL类信号分子的标准样品，通过仪器分析标准样品与待测样品中目标化合物的出峰时间和结构特征，来实现某种细菌产生AHL类信号分子的具体类型即含有多少个碳链分子。然而，由于仪器检测存在检测技术复杂、需要使用专用的大型设备，价格昂贵等问题，该方法在实际研究中并未普及。(2)生物显影。生物显影是利用生物检测菌株来完成AHL类信号分子的检测，是目前广泛应用的一种检测方法。例如，Zhu等人(2003)以IacZ基因为报告基因，构建了一个检测AHL类信号分子的农杆菌检测菌株(Agrobacterium tumefaciens JZA1),并成功应用于动植物病原细菌培养上清中AHL类信号分子的检测(Zhu et al.,2003) ;MCClean等人(1997)利用紫色杆菌(Chromobacterium violaceum026)来检测动植物病原细菌在培养过程中产生的AHL类信号分子(Mcclean et al.，1997)。尽管生物显影的检测方法能够检测多数植物病原细菌产生的AHL类信号分子，但这种检测方法必须依赖于待测的信号分子达到一定的浓度阈值，对于低浓度信号分子的检测这种方法仍然难以奏效。由于病原细菌在寄主内产生的信号分子浓度较低(但这种低浓度的信号分子也足以帮助细菌调节自身毒性基因的表达)，导致生物显影的检测方法很难实现这种“低浓度”信号分子的检测。正是由于现有的检测方法存在不足，导致AHL类信号分子在植物病原细菌与寄主互作过程中的变化动态及其致病功能的研究受到限制。基于单克隆抗体的酶联免疫检测方法(ELISA)由于其灵敏度高、稳定性强、操作简便等特点广泛应用于农药、兽药、重金属等小分子化学物质的残留检测(Zhang，et al.,2007 ；Zhu, et al.,2007 ；Qian et al.，2009)，但应用该方法来检测植物病原细菌信号分子的研究未见相关报道。本项目组长期从事化学农药等小分子化合物、植物毒素和激发子的免疫学研究。在前期工作中，本项目组利用基于单克隆抗体的酶联免疫技术，首次鉴定了由水稻白叶枯病菌产生的激发子harpin在非寄主烟草中的受体蛋白(Chen et al.,2009)，揭示该方法可以作为研究病原细菌与寄主植物互作的一种实用、有效的新方法。
【发明内容】
[0004]1.植物病原细菌AHL类信号分子的通用免疫半抗原的合成，包括如下:
[0005]
【权利要求】
1.一种用于制备植物病原细菌AHL类信号分子抗体的通用免疫半抗原的合成方法，详细步骤如下:
【文档编号】C07D307/33GK103524464SQ201310504410
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】钱国良, 刘凤权, 王利民 申请人:南京农业大学