碱基修饰核苷酸的合成方法及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种碱基修饰核苷酸的合成方法及其用途；所述方法包括将各种修饰核苷在磷酸化试剂的作用下，选择性地生成5′-核苷三磷酸；这些磷酸化试剂包括反应过程中原位生成的环状磷酸化试剂以及三氯氧磷和三丁基焦磷酸铵协同作用下的反应产物。本发明合成的碱基修饰核苷酸在DNA测序、标记、延伸等生物学领域广泛使用，目前其销售价格很高，合成方法复杂，反应选择性差，副反应多，不好分离纯化；而本发明提供的合成方法选择性好，副反应少，容易分离纯化，且所需实验条件易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。
【专利说明】碱基修饰核苷酸的合成方法及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及一种碱基修饰核苷酸的合成方法及其用途。
【背景技术】
[0002]DNA测序技术是现代生命科学和医学研究的重要手段之一。DNA测序从1977年的Sanger测序技术(一代测序)开始，在三十几年的时间里，飞速发展。测序的通量大幅提高而成本急剧下降，有人甚至认为其发展的速度打破了半导体工业界已有的摩尔定律预算的速度。二代高通量平行测序技术的出现是测序技术飞速发展的集中体现。采用第一代测序技术，人类基因组计划(HGP)耗资30亿美元完成人整个基因组(30亿个碱基)的序列测定。而目前的二代测序的最新技术仅需5000美元左右就能完成人整个基因组测序。
[0003]虽然如此，二代测序的成本和技术方面依然存在不足，不能满足基础科学和临床医学对测序的要求。单分子测序技术(三代测序技术)应运而生。三代测序技术的核心是直接对单个DNA分子进行测序，不做任何的DNA扩增反应，从而减少成本，提高通量。单分子测序技术虽然已有商业化产品，但是都还存在技术上的难点，未能大规模应用。
[0004]目前市场上的高通量测序平台被少数几家国外产品所垄断，尤其令人忧虑的是，国外公司凭借对测序试剂的控制，几乎完全控制了国内的测序市场，即便是测序硬件上我们能有所突破，在测序试剂等配套产品上我们还将受制于人。因此，自主研发可适用于二代测序甚至是三代测序平台的测序试剂，将对改变目前的市场格局、建立我国自主的测序平台具有战略性的意义。为此，国家863、973和“十二五”生物技术发展规划都将研发新一代测序技术及配套产品的研发列为重点发展的对象。
[0005]用于测序的可逆终端一般都选取U，C，A，G四个不同碱基修饰的核苷酸.而传统核苷酸的合成一直存在着副反应多，产物难以分离纯化，一般都需要借助FPLC和制备HPLC反复纯化，才可以得到纯度足够高的核苷酸产品(Chem.Eur.J.2011，17，2903-2915).本发明中我们选择了一种比较弱的环状磷酸化试剂，它能够有效地在核苷的5’羟基反应，而最大的副反应是将三磷酸接在3’羟基，其它的副反应很少，同时为了进一步降低3’羟基的磷酸化反应，当原料的转化率达到70%时，将反应停止，因为核苷的价格比核苷酸低得多.本发明的合成方法简单，反应条件温和，反应过程可控，适合大规模生产。并且用我们自己合成的核苷酸成功地用于合成适合DNA测序的可逆终端等其它衍生物的合成.
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种碱基修饰核苷酸的合成方法及其用途；该合成方法原料简单、便宜，反应条件温和，操作简单，可适合大规模生产。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0008]第一方面 ，本发明涉及一种碱基修饰核苷酸的合成方法，所述方法包括如下步骤:
【权利要求】
1.一种碱基修饰核苷酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:A、5-碘_2
2.一种如权利要求1所述的方法合成得到的5-丙炔胺2’ -去氧胞嘧啶核苷酸dCTP(AP3)在合成用于DNA测序的可逆终端中的用途。
3.—种如权利要求1所述的方法合成得到的5-丙炔胺2’ -去氧尿嘧啶核苷酸dUTP(AP3)在合成用于DNA测序的可逆终端中的用途。
4.一种如权利要求1所述的方法合成得到的7-去氮-7-丙炔胺-2’ -去氧腺嘌呤核苷酸dATP(AP3)在合成用于DNA测序的可逆终端中的用途。
5.一种碱基修饰核苷酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:A、核苷酸dUTP在NIS、NBS或NCS作用下在叠氮钠的水溶液中反应，在嘧啶碱基的5-位
接1、或Cl，得到化合物
6.—种如权利要求5所述的方法合成得到的5-卤素-2’ -去氧尿嘧啶核苷酸dUTP-X在合成修饰核苷酸中的用途。
7.—种碱基修饰核苷酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:
8.如权利要求7所述的碱基修饰核苷酸的合成方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤:在Cu1、Pd(PPh3)4和TEA存在的条件下，化合物F2 FaC上口和所述dGTP-X或GTP-X发生偶联反应，得所述化合物dGTP (AP3)或GTP (AP3);所述dGTP-X或GTP_X、F2、Cu1、Pd (PPh3)4 和 TEA 的摩尔比为 I: (2 ~3): 0.072: 0.025: (1.5 ~2)。
9.如权利要求7所述的碱基修饰核苷酸的合成方法，其特征在于，所述化合物G(AP3)可通过如下步骤合成而得:a、在冰水浴搅拌条件下，摩尔比为1.0: (1.2~2)的丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应，得化合物f、、；b、在Cul、Pd(PPh3)4和TEA存在的条件下，化合物F2和所述G-X反应，得所述化合物G(AP3)，所述G-X、F2, Cul、Pd(PPh3)4和TEA的摩尔比为1: (2~3): 0.072: 0.025: (1.5 ~2)。
10.一种碱基修饰核苷酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 丙烯腈与化合物
【文档编号】C07C213/02GK103588838SQ201310533070
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】沈玉梅, 龚兵, 汤道年, 邵志峰, 赵小东, 李小卫, 伍新燕, 黎庆, 魏晓飞, 刘亚智 申请人:上海交通大学