从红豆杉细胞培养液中制备高纯度紫杉醇的方法
【专利摘要】本发明涉及紫杉醇的制备方法，尤其是涉及从红豆杉细胞培养液中制备高纯度紫杉醇的方法，其包括将细胞培养液过滤、经大孔树脂吸附富集，得粗提物、经常压碱性氧化铝柱层析、经过C18反相高效制备液相分离，分部收集组分、离心获取沉淀、将沉淀冷冻干燥后得高纯度紫杉醇单体。本发明选用紫杉醇高产细胞系培养液作为原材料，与红豆杉枝叶、树皮等提取相比，所含色素、脂质等杂志更少，相比于真菌和细菌发酵液，其所含紫杉醇更高，该材料方便提取；同时从红豆杉细胞培养液中直接用大孔树脂富集紫杉醇，省去大量有机溶剂使用，工艺简单，节约环保，回收率高，获得的紫杉醇纯度高。
【专利说明】从红豆杉细胞培养液中制备高纯度紫杉醇的方法
【技术领域】[0001]本发明涉及紫杉醇的制备方法，尤其是涉及从红豆杉细胞培养液中制备高纯度紫杉醇的方法。
【背景技术】[0002]紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。紫杉醇是全球最畅销的抗肿瘤药物，同时也是世界上公认的广谱强活性抗癌药物，随着临床用途的急剧扩大，国际医药市场对紫杉醇原料药有巨大的需求。[0003]近年来，国内外对紫杉醇制备多从植物的树皮、枝叶等组织提取，工艺复杂，溶剂能量消耗较多，成本较高。野生红豆杉受到法律保护后，只能从人工栽培的红豆杉获取树皮，但红豆杉生长缓慢，限制了树皮原料来源。目前，还有一些方法:如通过半合成方法制备紫杉醇，但其必需先从植物材料中获取紫杉醇前提化合物，所以也会受到资源限制；还如紫杉醇全合成方法，但其制备步骤及其复杂，成本很高，至今无法工业化生产；再如从真菌和细菌发酵液提取紫杉醇，因其含量太低，目前没有实现工业化生产。美国与意大利在利用细胞培养法直接生产紫杉醇原料药发展较快，迄今为止，全球利用红豆杉细胞培养法生产紫杉醇的总规模每年仍只有数千升，在目前全球紫杉醇原料总产量中，细胞培养法生产的紫杉醇所占份额极小。但由于细胞培养法不会消耗宝贵的紫杉树或红豆杉树资源，故这一方法属于“绿色生产新工艺”并代表着紫杉醇原料药产业的未来，具有有广阔的发展前景和市场增长空间。[0004]目前，植物细胞大规模培养生产紫杉醇的一个显著特点是培养液体积庞大，紫杉醇在培养液中的含量比较低，一般在20mg/L左右，它既有一部分分泌到培养液中，还有一大部分存留在细胞中。现有技术中，出现了从细胞内提取紫杉醇的方法，其是将收获期的细胞与培养液分离，然后将细胞烘干后提取，在这种方法中，那些因分泌或部分细胞破裂流失到培养液中的的紫杉醇将被丢弃，导致回收率较低；还出现了从红豆杉细胞培养液滤液中富集提取紫杉醇的方法，其是用大量有机溶剂对培养液进行液-液萃取。这种方法必然会导致大量有机溶剂耗费和环境忧患，还要投入大量资金用于购置大尺寸的液-液萃取设备；还出现了采用膜分离浓缩技术从从红豆杉细胞悬浮培养液分离紫杉醇的方法，尽管该方法可省去溶剂萃取步骤，能除去一部分杂质，但该方法操作麻烦，回收率不高。
【发明内容】
[0005]针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种从红豆杉细胞培养液中制备高纯度紫杉醇的新方法，该方法不仅工艺简单，而且回收率高。[0006]本发明解决上述技术问题采用的技术方案为:从红豆杉细胞培养液中制备高纯度紫杉醇的方法，其包括以下步骤:(1)将红豆杉细胞培养液进行固液分离，得到原液和细胞；然后将细胞破壁后过滤，得到滤液和滤渣；再将所述原液与滤液混合；
(2)将上述混合液体通过非极性大孔树脂吸附层析柱富集，然后用蒸馏水冲洗，再用乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，并将洗脱液中的乙醇蒸干；
(3)向上述蒸干乙醇的洗脱液中加入萃取剂，进行两次液液萃取，收集有机溶剂层，低温真空干燥，得到大孔树脂柱富集紫杉醇粗品；
(4)将上述粗品转载于用碱性氧化铝做填料的层析柱，用洗脱溶液进行洗脱，分部收集洗脱部分，并真空干燥，得到样品；
(5)将上述样品通过C18高效液相色谱柱纯化，然后用含甲醇溶液作流动相洗脱，分部收集紫杉醇洗脱部分，将收集的组分置于通风厨，挥发有机相，待出现结晶后转至4°C冰箱放置24h，离心收集一部分晶体，然后将上清液继续放置使结晶完全，离心收集另一部分晶体，再将收集的全部晶体冷冻干燥，得到高纯度紫杉醇单体。
[0007]作为优选，步骤(1)中将所述培养液离心，获得细胞，然后将细胞用匀浆机匀浆，再将匀浆后的糊状流体加入等体积的乙醇进行超声提取，并离心过滤后得到所述滤液。
[0008] 作为另一种优选，步骤(1)中将所述培养液经砂芯漏斗抽滤或经板框过滤，得到细胞，然后将细胞用匀浆机匀浆，再将匀浆后的糊状流体加入等体积的乙醇进行超声提取，并用砂芯漏斗抽滤，得到所述滤液。
[0009]进一步地，步骤(2)中采用体积浓度为75~85%乙醇溶液进行洗脱。
[0010]进一步地，向蒸干乙醇的洗脱液中加入等体积的萃取剂，萃取剂为1:1的二氯甲烷与水或为1:1的三氯甲烷与水。
[0011]进一步地，步骤(4)采用三氯甲烷:甲醇体积比为96:4的洗脱液 本发明与现有技术相比，具有以下优点:
(I)本发明选用紫杉醇高产细胞系培养液作为原材料，与红豆杉枝叶、树皮等提取相t匕，所含色素、脂质等杂质更少，相比于真菌和细菌发酵液，其所含紫杉醇更高，该材料方便提取，所含杂质更少。
[0012](2)从红豆杉细胞培养液中直接用大孔树脂富集紫杉醇，相对于溶剂提取，节约了大量有机溶剂使用；相对于膜分离技术，操作更简便，回收率更高；且大量有机溶剂采用乙醇，环保安全；
(3)本发明的总回收率在90%以上，利用高效制备液相能很好控制产品纯度，获得的紫杉醇纯度高，可大于99.5% ；
(4)高效制备液相分离紫杉醇的同时，可以分部收集其他紫杉烷类化合物；
(5)整个工艺流程简便，易于放大产业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明的流程框图。
【具体实施方式】
[0014]下面结合图1对本发明的方法作进一步地详细说明:
本方法是:(I)将红豆杉细胞培养液进行固液分离，得到原液和细胞，固液分离可采用用离心、板框过滤、砂芯漏斗抽滤等方式，大规模生产一般用板框过滤或者离心方式；然后将细胞破壁后过滤，得到滤液和滤渣；再将所述原液与滤液混合；细胞培养液中的紫杉醇几乎完全溶解在最后混合液中，通过离心或过滤可以除去破碎的细胞成分，所得滤液所含杂质更少，便于后续的大孔吸附树脂富集。
[0015](2)将上述混合液体通过非极性大孔树脂吸附层析柱富集，非极性大孔吸附树脂可为D-101，HP-30, D4020的一种；然后用蒸馏水冲洗,再用乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,并将洗脱液中的乙醇蒸干；这样能够从大量液体中富集紫杉醇，浓缩后紫杉醇含量可达I~
5% ο
[0016](3)向上述蒸干乙醇的洗脱液中加入萃取剂，进行两次液液萃取，收集有机溶剂层，低温真空干燥，得到大孔树脂柱富集紫杉醇粗品；萃取后可以除去一部分杂质，并且能除去水分，便于后续氧化铝柱层析。
[0017](4)将上述粗品转载于用碱性氧化铝做填料的层析柱，用洗脱溶液进行洗脱，分部收集洗脱部分，并真空干燥，得到样品；碱性氧化铝层析柱在分离紫杉醇同时可以催化7-表-紫杉醇等紫杉烷类化合物向紫杉醇转化，除去较难分离的杂质同时提高回收率。
[0018](5)将上述样品通过C18高效液相色谱柱纯化，然后用含甲醇溶液作流动相洗脱，分部收集紫杉醇洗脱部分，将收集的组分置于通风厨，挥发有机相，待出现结晶后转至4°C冰箱放置24h，离心收集一部分晶体，然后将上清液继续放置使结晶完全，离心收集另一部分晶体，再将收集的全部晶体冷冻干燥，得到高纯度紫杉醇单体。由于利用C18高效液相色谱柱，能高效分离紫杉醇，重复性好，便于控制。具体实施例如下:
实施例1
红豆杉细胞悬浮培养液300mL，经H PLC检测培养液中和细胞内共含紫杉醇27mg。
[0019](I)将培养液5000r/min离心5min，获得82mL细胞固体，将细胞用匀浆机在10000r/min的转速下匀浆2min，将匀浆后的糊状流体加入等体积的95%乙醇超声提取30min, 5000r/min离心过滤后得129mL,与之前液体混合共得347mL。
[0020](2)取国产D-101大孔吸附树脂，湿法装成1.5X30cm的层析柱，将混合液加载到大孔树脂色谱柱顶(上样量约为3mg紫杉醇/mL树脂)，用蒸馏水冲洗，除去水溶性杂质和色素，用体积百分比含乙醇75%的水溶液洗脱，收集30mL洗脱液，将洗脱液中的乙醇蒸干，加入等体积的三氯甲烷:水(1:1)进行液液萃取，收集有机溶剂层，低温真空干燥得到1.150g大孔树脂柱富集紫杉醇粗品，经HPLC分析含紫杉醇2.3% (25.9mg)，紫杉醇收率为95.9%。
[0021](3)将上述1.150g大孔树脂柱分离粗品，转载于用碱性氧化铝做填料的层析柱，三氯甲烷:甲醇体积比为96:4的洗脱液做流动相，分部收集洗脱部分，低温真空干燥得样品0.116g ;经HPLC分析含紫杉醇21.7% (25.2mg)，紫杉醇回收率为97.3%.[0022](4)样品通过C18高效液相色谱柱纯化，用含甲醇55%的甲醇水溶液作流动相洗脱，分部收集紫杉醇洗脱部分，将收集的组分置于通风厨，挥发有机相，待出现结晶后转至4°C冰箱放置24h，离心获取晶体，上清液继续放置使结晶尽量完全，将收集的晶体冷冻干燥后，得高纯度紫杉醇单体。获得纯度为99.6%的精分离紫杉醇24.8mg，回收率为98.4%，总回收率为91.5%。
[0023]实施例2
红豆杉细胞悬浮培养液IL J^HPLC检测培养液中和细胞内共含紫杉醇92mg。[0024](1)将培养液经砂芯漏斗抽滤后得260mL细胞固体，将细胞用匀浆机在1000Or/min的转速下匀衆2min,将匀衆后的糊状流体加入等体积的95%乙醇超声提取30min,砂芯漏斗抽滤后得405mL,与之前液体混合后共得1145mL。
[0025](2)取进口 HP-30大孔吸附树脂，湿法装成2 X 30cm的层析柱，将混合液加载到大孔树脂色谱柱顶(上样量约为3mg紫杉醇/mL树脂)，用蒸馏水冲洗，除去水溶性杂质和色素，用体积百分比含乙醇80%的水溶液洗脱，收集IOOmL的洗脱液，将洗脱液中的乙醇蒸干，加入等体积的二氯甲烷:水(1:1)进行液液萃取，收集有机溶剂层，低温真空干燥得到3.351g大孔树脂柱富集紫杉醇粗品，经HPLC分析含紫杉醇2.6% (88.5mg)，紫杉醇回收率为96.2%。
[0026](3)将上述3.351g大孔树脂柱分离粗品，转载于用碱性氧化铝做填料的层析柱，三氯甲烷:甲醇体积比为96:4的洗脱液做流动相，分部收集洗脱部分，50°C真空干燥，得样品0.349g ;经HPLC分析含紫杉醇24.8% (86.7mg)，紫杉醇回收率为98.0%。
[0027](4)样品通过C18高效液相色谱柱纯化，用含甲醇55%的甲醇水溶液作流动相洗脱，分部收集紫杉醇洗脱部分，将收集的组分置于通风厨，挥发有机相，待出现结晶后转至4°C冰箱放置24h，离心获取晶体，上清液继续放置使结晶尽量完全，将收集的晶体冷冻干燥后，得高纯度紫杉醇单体85.63mg，纯度为99.5%，回收率为98.3 %，总回收率为92.6%。
[0028]实施例3
红豆杉细胞悬浮培养液3L，经HPLC检测培养液中和细胞内共含紫杉醇265mg。
[0029](I)将培养液经砂芯漏斗抽滤后得775mL细胞固体，将细胞用匀浆机在1000Or/min的转速下匀衆2min,将匀衆后的糊状流体加入等体积的95%乙醇超声提取30min,过滤后得1210mL，与之前液体混合共得3435mL。
[0030](2)取国产D-101大孔吸附树脂，湿法装成3X30cm的层析柱，将混合液加载到大孔树脂色谱柱顶(上样量约为3mg紫杉醇/mL树脂)，用蒸馏水冲洗，除去水溶性杂质和色素，用体积百分比含乙醇85%的水溶液洗脱，收集300mL的洗脱液，将洗脱液中的乙醇蒸干，加入等体积的三氯甲烷:水(1:1)进行液液萃取，收集有机溶剂层，低温真空干燥得到12.130g大孔树脂柱富集紫杉醇粗品，经HPLC分析含紫杉醇2.1% (251mg)，紫杉醇收率为94.7%。
[0031](3)将上述12.130g大孔树脂柱分离粗品，装载于用碱性氧化铝做填料的层析柱，三氯甲烷:甲醇体积比为96:4的洗脱液做流动相，分部收集洗脱部分，低温真空干燥，得样品1.098g,经HPLC分析含紫杉醇22.3% (245mg)，紫杉醇回收率为97.6%。
[0032](4)样品通过C18高效液相色谱柱纯化，用含甲醇50%的甲醇水溶液作流动相洗脱，分部收集紫杉醇洗脱部分，将收集的组分置于通风厨，挥发有机相，待出现结晶后转至4°C冰箱放置24h，离心获取晶体，上清液继续放置使结晶尽量完全，将收集的晶体冷冻干燥后，得高纯度紫杉醇单体。获得纯度为99.5%的精分离紫杉醇242mg，回收率为98.5%，总回收率为90.9%
上述实施方式仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明精神和范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴。
【权利要求】
1.从红豆杉细胞培养液中制备高纯度紫杉醇的方法，其包括以下步骤: (1)将红豆杉细胞培养液进行固液分离，得到原液和细胞；然后将细胞破壁后过滤，得到滤液和滤渣；再将所述原液与滤液混合； (2)将上述混合液体通过非极性大孔树脂吸附层析柱富集，然后用蒸馏水冲洗，再用乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，并将洗脱液中的乙醇蒸干； (3)向上述蒸干乙醇的洗脱液中加入萃取剂，进行两次液液萃取，收集有机溶剂层，低温真空干燥，得到大孔树脂柱富集紫杉醇粗品； (4)将上述粗品转载于用碱性氧化铝做填料的层析柱，用洗脱溶液进行洗脱，分部收集洗脱部分，并真空干燥，得到样品； (5)将上述样品通过C18高效液相色谱柱纯化，然后用含甲醇溶液作流动相洗脱，分部收集紫杉醇洗脱部分，将收集的组分置于通风厨，挥发有机相，待出现结晶后转至4°C冰箱放置24h，离心收集一部分晶体，然后将上清液继续放置使结晶完全，离心收集另一部分晶体，再将收集的全部晶体冷冻干燥，得到高纯度紫杉醇单体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)中将所述培养液离心，获得细胞，然后将细胞用匀浆机匀浆，再将匀浆后的糊状流体加入等体积的乙醇进行超声提取，并离心过滤后得到所述滤液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)中将所述培养液经砂芯漏斗抽滤或经板框过滤，得到细胞，然后将细胞用匀浆机匀浆，再将匀浆后的糊状流体加入等体积的乙醇进行超声提取，并用砂芯漏斗抽滤，得到所述滤液。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:步骤(2)中采用体积浓度为75~85%乙醇溶液进行洗脱。
5.根据权利要求4所述的方`法，其特征在于:在步骤(3)中，向蒸干乙醇的洗脱液中加入等体积的萃取剂，萃取剂为1:1的二氯甲烷与水或为1:1的三氯甲烷与水。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:步骤(4)采用三氯甲烷:甲醇体积比为96:4的洗脱液。
【文档编号】C07D305/14GK103570647SQ201310546214
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】熊兴耀, 杨星星, 苏小军, 王仁才 申请人:湖南农业大学